Российские нанотехнологии, 2021, T. 16, № 4, стр. 578-584

ВВЕДЕНИЕ

Нанокомпозиты (НК) металлов являются одними из наиболее перспективных материалов для использования в медико-биологических целях. Благодаря малым размерам они легче транспортируются через биологические мембраны и проникают сквозь различные барьеры организма. Наночастицы (НЧ) меди и оксида меди широко применяются в биомедицинских целях, а также в промышленности при производстве полупроводников, теплоносителей, катализаторов [1, 2].

Благодаря антимикробным свойствам НК Cu являются перспективными материалами для разработки антимикробных препаратов (мази, капли), асептической упаковки и материалов с бактерицидными и фунгицидными свойствами [3, 4]. Одним из перспективных направлений использования НК Cu является регенеративная медицина [5]. Согласно литературным данным НЧ Cu способны модулировать клетки, цитокины и факторы роста, участвующие в механизме репарации поврежденной ткани, причем эффективнее, чем ионы меди [5, 6]. Гистологическая оценка способности НЧ Cu стимулировать репаративные функции ткани показала активную пролиферацию фибробластов, отложение коллагена и реэпителизацию поврежденного участка [6].

Нанотехнологии предлагают много новых возможностей в различных отраслях народного хозяйства. Вместе с тем остается актуальным вопрос о безопасности НК металлов для человека. Проведенные в [7, 8] исследования токсичности НК серебра, железа и гадолиния, инкапсулированных в полимерную матрицу арабиногалактана, показали, что данные НК способны оказывать токсическое действие на организм. При подостром воздействии в дозе 500 мкг/кг они способны вызывать гибель нейронов сенсомоторной коры головного мозга, в том числе развитие апоптоза в нейронах, а также нарушение нормальной реологии крови в органах и развитие белковой дистрофии гепатоцитов в печени.

Цель настоящей работы – исследование токсичности нанокомпозита оксида меди (Cu₂OАГ), инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана, с оценкой морфологических, нейрофизиологических и генотоксических изменений в организме белых крыс.

МЕТОДЫ

Содержание меди в препарате Cu₂OАГ составляло 7%. Исследование осуществляли в два этапа. На первом проводили оценку острой токсичности исследуемого НК. Исследование проводили согласно ГОСТу 32419-2013 [9]. Ввиду наличия малого количества исследуемого НК, вследствие высокой цены компонентов его синтеза, исследование острой токсичности проводили на белых мышах. Для этого десяти половозрелым мышам-самцам массой 20–25 г внутрижелудочно с помощью зонда вводили 0.5 мл водного раствора Cu₂OАГ в дозе 2000 мг/кг массы тела животного. Животным контрольной группы в таком же режиме давали дистиллированную воду. Наблюдение за животными длилось 14 дней, после чего белых мышей декапитировали под легким эфирным наркозом и при вскрытии оценивали макроскопические изменения внутренних органов.

На втором этапе изучали подострое воздействие Cu₂OАГ. Исследование осуществляли на 60 половозрелых беспородных белых крысах-самцах массой 200–220 г. Животные были разделены на две группы: опытную (n = 30) и контрольную (n = 30). Животным опытной группы внутрижелудочно с помощью зонда вводили 2 мл водного раствора Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг массы тела (в пересчете по Cu) в течение 10 дней. Животные контрольной группы в аналогичном режиме получали дистиллированную воду. Выбор дозы обусловлен ранее проведенными исследованиями НК серебра и гадолиния [7, 8], в которых при данной дозе наблюдались наиболее выраженные изменения морфологии ткани сенсомоторной коры головного мозга и печени.

Сразу после окончания воздействия крыс усыпляли путем декапитации под легким эфирным наркозом. Для исследования изымали головной мозг, печень и почки. Органы фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, рН 7.4 (BioVitrum, Россия), далее проводили по спиртам восходящей концентрации и заливали парафином. Из парафиновых блоков с помощью санного микротома МС-1 (Россия) готовили срезы толщиной 3–5 мк, которые окрашивали гематоксилином и эозином по методике [10]. В окрашенных срезах с помощью микроскопа Olympus BX 51 подсчитывали общее число нейронов на единицу площади, общее число клеток астроглии, общее число дегенеративно измененных нейронов (дегенеративно измененными считались темно-окрашенные нейроны без четко различимого ядра и цитоплазмы) и число актов нейронофагии.

Для определения биоэлектрической активности коры головного мозга при подостром воздействии Cu₂OАГ части животных опытной (n = 8) и контрольной групп (n = 8) на следующий день после окончания введения вживляли нихромовые электроды. Вживление электродов проводили с помощью стереотаксической установки под анестезией (кетамин из расчета 0.15 мл/100 г и ксила (рометар) в дозе 0.075 мл/100 г массы тела внутрибрюшинно в смеси в одном шприце). Определение координат выполняли с помощью стереотаксического атласа мозга взрослой крысы. Координаты для вживления электродов в сенсомоторную зону коры головного мозга крыс: координата точки С 3: 1.5 мм от брегмы, 2 мм в сторону от сагиттального шва и 2 мм вглубь [11]. Индифферентный электрод вживляли в носовую пазуху. Для оценки функционального состояния центральной нервной системы животным проводили электроэнцефалографию (ЭЭГ). Регистрацию ЭЭГ-активности у крыс выполняли в условиях свободного поведения через 3–5 дней после вживления электродов в кору головного мозга [12]. Запись и обработку ЭЭГ проводили с помощью электроэнцефалографа и специальной компьютерной нейрофизиологической программы “Нейроспектр” (г. Иваново, Россия). Анализировали изменения следующих показателей ЭЭГ: распределение в процентах основных ритмов (δ, θ, α, β1, β2) ЭЭГ; амплитуду при проведении пробы со зрительными вызванными потенциалами (ЗВП) [11, 13].

Для оценки генотоксических эффектов исследуемого НК часть ткани печени и головного мозга исследовали методом “ДНК-комет” по протоколу [15]. Для этого образцы тканей лабораторных животных помещали в стеклянные пробирки с охлажденным до 4°С фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 20 мM EDTA-Na₂ и 10% DMSO (рН 7.5), и гомогенизировали стеклянным пестиком. Пробирки выдерживали 5 мин при комнатной температуре для осаждения крупных фрагментов тканей. Суспензии клеток в объеме 60 мкл вносили в пробирки с 240 мкл 1%-ного раствора легкоплавкой агарозы в ФСБ, подогретом до 42°С (микротермостат “Термит”, Россия), и ресуспендировали. Затем 60 мкл раствора агарозы с клетками наносили на предварительно покрытые 1%-ной универсальной агарозой предметные стекла, покрывали покровным стеклом и помещали на лед. Далее все операции проводили в затемненном помещении при желтом свете. После затвердевания агарозы (~5–10 мин) покровные стекла осторожно удаляли, микропрепараты помещали в стеклянную кювету (тип Шиффендекер), заливали предварительно охлажденным до 4°С лизирующим буфером (10 мM Tris-HCl (pH 10), 2.5 M NaCl, 100 мM EDTA-Na 2.1% TritonX-100, 10% DMSO) и инкубировали 1 ч. После микропрепараты переносили в электрофорезную камеру с охлажденным до 4°С буфером для электрофореза (300 мM NaOH, 1 мM EDTA-Na₂ (pH > > 13)) и инкубировали в течение 20 мин для реализации щелочнолабильных сайтов и щелочной денатурации ДНК. После проводили электрофорез в течение 20 мин при напряженности поля 1 В/см и силе тока ~300 мA (20 В/см и 300 мA). По окончании электрофореза микропрепараты переносили в стеклянную кювету и фиксировали в 70%-ном растворе этилового спирта в течение 10 мин. После фиксации микропрепараты высушивали и хранили до анализа при комнатной температуре. Окраску препаратов осуществляли SYBR Green I, регистрацию проводили на микроскопе Olympus ВХ-51 (Япония), совмещенном с цифровой камерой Olympus Е-420 (Япония) при увеличении ×100. Изображения ДНК-комет (по 100 клеток от каждого животного) анализировали с помощью программы “CASP 1.2.2”. В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание фрагментов ДНК в хвосте комет (процент ДНК в хвосте).

Часть органов подопытных животных (головной мозг, печень и почки) забирали для определения содержания в них меди. После взятия навески минерализацию проб проводили концентрированной азотной кислотой в индивидуальных автоклавах из тефлона, помещенных в микроволновую печь. Для определения концентрации меди использовали атомно-абсорбционный метод. Измерения проводили на приборе ААС-240DUO фирмы “Agilent Technologies” (США).

Все животные, полученные в виварии ФГБНУ ВСИМЭИ, содержались на стандартном рационе вивария, со свободным доступом к воде и пище. Манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986). Опытные и контрольные группы подбирались в соответствии с методическими рекомендациями “Оценка безопасности наноматериалов”, утвержденными приказом № 280 от 12 октября 2007 г.

Для статистической обработки результатов применяли пакет прикладных программ “Statistica 6.0” (StatSoft, лицензия № AXXR004E642326FA). Результаты  приведены в виде медианы и интерквартильного диапазона, Me (Q₂₅–Q₇₅). Для сравнений достоверности различий полученных результатов между группами использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Нулевые гипотезы об отсутствии различий между группами отвергали при достигнутом уровне значимости соответствующего статистического критерия р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Однократное внутрижелудочное введение Cu₂ОАГ в дозе 2000 мг/кг не приводило к гибели белых мышей в течение всего срока наблюдений. Поведение, внешний вид животных опытной группы, потребление ими корма и воды не имело отличий от животных контрольной группы. Макроскопическое обследование внутренних органов через 14 дней после введения НК также не показало отличий от контроля. Согласно ГОСТу 32419-2013 при отсутствии за период наблюдения гибели животных и видимых макроскопических изменений DL₅₀ данного НК больше 2000 мг/кг, следовательно, исследуемое вещество может быть отнесено к 5-му классу опасности.

При подостром внутрижелудочном воздействии Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг анализ содержания меди в ткани головного мозга, печени (орган детоксикации) и почек (орган выведения) белых крыс показал, что ее уровень в данных органах значительно выше показателей контрольной группы.

Изучение морфологической структуры ткани головного мозга при подостром воздействии Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг показало, что кровенаполнение сосудов вещества мозга в норме, сосудистые стенки без изменений. Данные морфометрической оценки клеточных популяций сенсомоторной коры головного мозга белых крыс представлены в табл. 1.

Установлено, что число нормальных нейронов на единицу площади не имело статистически значимого отличия от контроля (р = 0.5). При этом число клеток астроглии в опытной группе значительно ниже показателей контрольной группы (р = 0.02). Число дегенеративно измененных нейронов не имело статистически значимого отличия (р = 0.06). Число актов нейронофагии также не имело статистически значимого отличия от контрольной группы (р = 0.3) (рис. 1, табл. 1).

Рис. 1.

Ткань головного мозга белых крыс при подостром воздействии Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг: а – опытная группа, б – контрольная группа; 1 – дегенеративно измененный нейрон, 2 – нормальный нейрон, 3 – клетки астроглии. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение ×400.

В ткани печени кровенаполнение синусоидных капилляров, центральных вен и вен портальных трактов было без изменений. Портальные тракты не расширены, признаков склероза и воспаления не наблюдалось. Центральные вены расширены. Балочно-радиарное строение печеночных долек сохранено. Данные морфометрической оценки числа звездчатых макрофагов Купфера и полиядерных гепатоцитов печени белых крыс представлены в табл. 2.

Число звездчатых макрофагов Купфера в синусоидных капиллярах было статистически значимо выше по сравнению с контрольными показателями (р = 0.04). Число полиядерных гепатоцитов не имело статистически значимого отличия от контрольной группы (р = 0.1) (рис. 2, табл. 2).

Рис. 2.

Ткань печени белых крыс при подостром воздействии Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг: а – опытная группа, б – контрольная группа; 1 – звездчатые макрофаги Купфера, 2 – полиядерные гепатоциты. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение ×400.

В ткани почек не выявлено изменений кровенаполнения коркового и мозгового вещества органа. Нарушения реологии крови в органе не отмечено. Состояние стенок почечных артерий и артериол в норме, как и интерстициального пространства. Строение почечных клубочков сохранено. Очагов воспаления или некроза почечной ткани не отмечено. Эпителий дистальных и проксимальных почечных канальцев в норме. Площадь капсулы Шумлянского–Боумена не имела статистически значимого отличия от контрольных показателей.

Подострое воздействие НК Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг вызывало изменения некоторых показателей биоэлектрической активности сенсомоторной коры головного мозга животных. Результаты распределения основных ритмов фоновой ЭЭГ крыс представлены в табл. 3.

При анализе фоновой записи ЭЭГ крыс после подострого воздействия Cu₂OАГ отмечено значительное снижение доли индекса β-2-ритма по сравнению с показателем контрольной группы при уровне значимости различий р = 0.014.

У крыс после подострого воздействия НК при проведении пробы с ЗВП отмечено уменьшение амплитуды пика P2 ЗВП по сравнению с таковым у интактных животных при р = 0.011. Кроме того, воздействие Cu₂OАГ вызывало снижение амплитуды пика N2-P3 ЗВП относительно значения контрольных особей (р = 0.019) (рис. 3).

Рис. 3.

Амплитуда Р2 (а) и N2-P3 (б) ЗВП, мкВ при подостром воздействии Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/г. Различия статистически значимы по сравнению с контролем по критерию Манна–Уитни, p < 0.05.

Установленные нейрофизиологические изменения подтверждают неблагоприятные эффекты при подостром внутрижелудочном пути поступления НК Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг массы тела.

Анализ результатов исследования показал, что процентное содержание ДНК в хвостах комет в исследованных тканях не имело различий в опытной и контрольной группах экспериментальных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По оценке результатов исследования острой токсичности нанокомпозит Cu₂OАГ относится к 5-му классу опасности (2000 < DL₅₀ ≤ 5000 мг/кг). Следовательно, данный НК обладает относительно низкой опасностью по острой токсичности.

При подостром воздействии Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг (в пересчете по Cu) отмечается увеличение содержания меди в ткани головного мозга, печени и почек, что свидетельствует о биодоступности данного НК для органов и тканей. В ткани печени выявлена выраженная макрофагальная реакция, заключающаяся в увеличении числа звездчатых макрофагов Купфера в синусоидах органа. Данный показатель свидетельствует о возникновении в печени компенсаторных процессов вследствие подострого воздействия исследуемого НК. В ткани сенсомоторной коры головного мозга подопытных животных отмечается снижение общего числа клеток астроглии на единицу площади, что может указывать на избирательную цитотоксичность нанокомпозита Cu₂OАГ. Учитывая важную роль астроглиальных клеток в формировании нормального гомеостаза нервной ткани [19], выявленная избирательная цитотоксичность способна привести к усугублению нейротоксического эффекта в ткани головного мозга в отдаленном периоде. В распределении ритмов фоновой записи ЭЭГ установлено уменьшение доли спектра β-2-ритма. При проведении пробы с ЗВП выявлено уменьшение амплитудных значений пика P2 и N2-P3 ЗВП, что свидетельствует о дестабилизирующих изменениях в биоэлектрической активности. Во многих исследованиях при патологическом состоянии, в частности развитии гипоксии, у крыс установлено нарушение распределения и снижение амплитуды ритмов ЭЭГ [15–18]. Выявленные изменения показателей нейрофизиологической активности, возможно, обусловлены снижением числа клеток астроглии в ткани головного мозга. Поскольку одна из основных функций астроглиальных клеток трофическая [19], вероятно, снижение их числа при подостром воздействии Cu₂OАГ приводит к нарушению данной функции и, соответственно, возникновению изменений в функциональном состоянии нейронов, которое проявляется в результатах ЭЭГ.

Согласно литературным данным, многие металлические наночастицы, включая оксид меди, железо, серебро, оксид титана и никель, способны повреждать ДНК клеток. В результате прямого воздействия металлических наночастиц увеличивается содержание активных форм кислорода, что, вероятно, обусловливает токсическое действие веществ на генетический материал клеток [20]. В [21] продемонстрирована генотоксичность наночастиц оксида меди в культуре кератиноцитов человека. Результаты показали, что воздействие на клетки культуры наночастиц Cu₂O приводило к дозозависимому увеличению “хвоста комет”, что позволило авторам сделать вывод о генотоксических свойствах наночастиц оксида меди. Однако результаты настоящего исследования, направленного на изучение генотоксических свойств нанокомпозита Cu₂OАГ при подостром воздействии в дозе 500 мкг/кг, не выявили генотоксического эффекта препарата. Возможно, это связано с активацией комплекса адаптивных механизмов организма, отсутствующих в культуре клеток.

Таким образом, подострое внутрижелудочное введение нанокомпозита оксида меди Cu₂OАГ в дозе 500 мкг/кг белым крысам вызывает проявление неблагоприятных биологических эффектов со стороны нервной системы и печени. Остается открытым вопрос о сохранности выявленных нарушений в отдаленном постконтактном периоде и влиянии их на функциональное состояние организма.