Российские нанотехнологии, 2021, T. 16, № 4, стр. 572-577

ВВЕДЕНИЕ

Исключительные свойства наноматериалов обусловливают перспективы их широкого применения в промышленности [1]. Наночастицы (НЧ) оксидов металлов широко используются в производствах конструкционных материалов, катализаторов, накопителей энергии, красок, люминофоров, косметических и медицинских препаратов [2, 3]. Одним из важных направлений развития нанотехнологий является получение нанопорошков, 80% которых составляют порошки оксидов металлов, причем наиболее популярными и востребованными для производств являются НЧ оксида алюминия (Al₂O₃) [4]. Оксид алюминия используется для изготовления оптически прозрачной и конструкционной керамики, теплозащитных покрытий и лакокрасочных материалов, выступает в роли катализатора в ряде процессов органического синтеза [5, 6]. Вследствие больших объемов производства Al₂O₃ и незамкнутого характера многих технологических циклов, в которых он используется, данный наноматериал может быть значимым загрязнителем и представлять серьезную угрозу для окружающей среды [7]. Отметим, что токсический эффект от частиц нанодиапазона значительно больше, чем от аналогичных по составу частиц микронных размеров [8, 9].

Несмотря на распространенность, алюминий и его соединения относятся к токсичным элементам [10]. НЧ Al₂O₃ легко поглощаются различными клеточными культурами [11, 12], оказывая при этом цитотоксическое действие [12, 13] и обладая способностью к каталитической генерации свободных радикалов [14]. Пыль глинозема (~33 г/м³ за пять часов в день) вызывает сильное повреждение эпителия дыхательных путей крыс [15].

В природные воды алюминий и его соединения попадают естественным путем при частичном растворении глин и алюмосиликатов, а также в результате вредных выбросов промышленных предприятий и со сточными водами [15]. С каждым годом таких выбросов в окружающую среду становится все больше, а контроль за степенью загрязнения ими все ниже. Поскольку НЧ Al₂O₃ нерастворимы в воде и практически не способны к биологической деградации, они могут накапливаться в составе компонентов природных экосистем и оказывать губительное влияние на большинство живых организмов, обитающих в природных водоемах [16]. Установлено вредное действие водных дисперсий Al₂O₃ на дафний [17], пресноводных улиток [18], рыб [19], почвенных нематод [20] и насекомых [21].

Основными методами контроля экологического состояния водоемов продолжают оставаться физико-химические методы. Однако наряду с аналитическими методами все чаще применяются методы биологического тестирования, позволяющие оценить всю совокупность свойств исследуемой среды по ответным реакциям живых организмов. Такими организмами являются пресноводные инфузории, они широко распространены в водоемах и играют заметную роль в самоочистке воды. Являясь одноклеточными организмами, инфузории одновременно демонстрируют реакции на организменном и клеточном уровне, тем самым расширяя диапазон критериев оценки токсичности. К сожалению, вопросы реакции инфузорий на частицы Al₂O₃ изучены недостаточно.

Основная цель данного исследования – определение токсического эффекта наночастиц оксида алюминия в эксперименте на инфузориях Paramecium caudatum (P. caudatum).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для оценки токсичности НЧ Al₂O₃ использовали коммерческий препарат фирмы Sigma-Aldrich, представляющий собой нанодисперсный порошок белого цвета с диаметром частиц 16.4 ± ± 10.0 нм и ζ-потенциалом 44.3 ± 1.8. Измерение ζ-потенциала и гидродинамического диаметра частиц проводили с использованием прибора Zetasizer Nano ZS (Malvern).

НЧ Al₂O₃ были охарактеризованы с помощью темнопольной электронной микроскопии (ТЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ-изображения получены с помощью микроскопа Dimension Icon (Bruker), работающего в режиме PeakForce  Tapping, с использованием зонда ScanAsyst-Air (Bruker) (номинальная длина 115 мкм, наконечник радиусом 2 нм, жесткость пружины 0.4 Н м^–1). Полученные данные обработаны с использованием программного обеспечения Nanoscope Analysis v.1.7. (Bruker). НЧ Al₂O₃ визуализировали при помощи высококонтрастной ТЭМ CytoViva^®. ТЭМ-изображения получены с помощью конденсора CytoViva^®, присоединенного к микроскопу Olympus BX51, оснащенному флюоритным объективом (×100) и CCD-камерой.

Для биотестирования водную суспензию НЧ Al₂O₃ готовили непосредственно перед исследованием. Для устранения агрегации суспензию обрабатывали ультразвуком (в течение 2 мин при 44 кГц и 40 Вт). Острую токсичность НЧ Al₂O₃ исследовали в концентрациях 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15 и 10 мкг/мл при различных экспозициях (0.16, 0.5, 1, 3, 5 и 24 ч).

В качестве модельных организмов использовали равноресничных инфузорий P. caudatum. Оценку устойчивости инфузорий к воздействию НЧ Al₂O₃ проводили по методике [22], основанной на определении выживаемости инфузорий. P. caudatum культивировали в десятикратном разведении среды Лозина-Лозинского, приготовленной растворением следующих навесок солей в 1 л дистиллированной воды: NaCl (1.0 г), KCl (0.1 г), NaHCO₃ (0.2 г), MgSO₄ (0.1 г), CaCl₂ (0.1 г) с добавлением водной суспензии дрожжей Saccharomyces cerevisiae (3 мл) при температуре 22–24°С. Для проведения экспериментов инфузорий отбирали вручную, используя микропипетку. Для наблюдения за парамециями использовали стереоскопический микроскоп Carl Zeiss Stemi 2000C. Для проведения биотестирования применяли культуральный планшет с лунками. Микропипеткой отбирали по 10–12 особей в минимальном количестве среды и переносили в лунки планшета. После помещения инфузорий в планшеты в контрольные лунки приливали по 0.2 мл культуральной среды, а в опытные – по 0.2 мл тестируемой пробы. Отмечали время начала биотестирования. В процессе экспозиции ни в контрольных, ни в опытных лунках кормление инфузорий не осуществлялось. Критерием токсичности служила гибель инфузорий. Неподвижные и изменившие форму клетки считали погибшими. Кроме того, оценивали изменение характера движения инфузорий.

Выживаемость инфузорий (N, %) определяли по формуле

где N₂, N₁– среднеарифметическое значение количества инфузорий в конце и начале опыта, шт.

В качестве критерия токсичности использовали показатель средняя летальная доза (LD₅₀), определяемый графически как концентрация исследуемого раствора, при которой токсичность составляет 50%.

Все эксперименты проводили в трех повторностях. При этом каждая серия опытов была выполнена не менeе трех раз. При статистической обработке полученных результатов использовали t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данное исследование направлено на изучение потенциально токсических эффектов, вызванных НЧ Al₂O₃, которые в настоящее время широко используются в промышленности. Типичные АСМ-изображения демонстрируют геометрию и размер частиц Al₂O₃, имеющих форму эллипсоидов и диаметр, равный 13–16 нм. Данные изображения максимально характеризуют топографию поверхности. Для визуализации частиц Al₂O₃ использовали ТЭМ (рис. 1).

Для оценки токсичности Al₂O₃ в качестве модели in vivo использовали P. caudatum – подвижные одноклеточные микроскопические организмы, питающиеся дрожжами и захватывающие другие частицы, суспендированные в водной среде. Парамеции имеют типичную форму эллипсоида, сами клетки прозрачные, что позволяет визуализировать органеллы, например пищеварительные вакуоли, заполненные дрожжевыми клетками (рис. 2а). С помощью усиленной ТЭМ можно наблюдать поглощение частиц Al₂O₃. Из рис. 2б видно, как частицы Al₂O₃ попадают в клетку P. caudatum из водной среды. Оксид алюминия ингибирует фагоцитарную активность у P. caudatum, при этом нарушается процесс образования пищеварительных вакуолей во всем диапазоне изученных концентраций. При более низких концентрациях НЧ Al₂O₃ были диффузно распределены в цитоплазме (рис. 2б). Например, оксид кремния в концентрации 5 мг/мл оказывает слаботоксичное действие [23], но при этом не препятствует образованию пищеварительных вакуолей даже при больших концентрациях. После попадания внутрь НЧ оксида кремния переносятся в пищеварительные вакуоли, визуализированные с помощью ТЭМ (рис. 2в).

Высококонтрастные ТЭМ-изображения позволяют быстро, просто и эффективно наблюдать НЧ Al₂O₃ внутри прозрачных тел парамеций, так же как и в предыдущих исследованиях с микроскопическими червями Caenorhabditis elegans [24] и инфузориями P. caudatum [23].

В типичном эксперименте оценивали острую токсичность НЧ Al₂O₃ в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкг/мл. При этом исследовали выживаемость инфузорий при различных экспозициях (табл. 1).

Для оценки выживаемости учитывали число мертвых особей. Показателями гибели инфузорий служат деформация тела, разрыв оболочки, лизис клетки, а также сохранение неподвижности. Через 0.16 ч эксперимента при концентрациях 100 и 50 мкг/мл отмечали отсутствие двигательной активности у 50% клеток. Через 0.5 ч при концентрации 100 мкг/мл наблюдали разрыв клеточной оболочки и лизис клеток, а при концентрации 50 мкг/мл около 30% клеток сохраняли двигательную активность. В остальных концентрациях большая часть клеток сохраняла нормальную двигательную активность. Показатели выживаемости инфузорий после 24 ч инкубации с Al₂O₃ представлены на рис. 3а. Наибольшее снижение выживаемости наблюдалось при концентрациях 20–100 мкг/мл, при которых Al₂O₃ оказывает острое токсичное действие на инфузории. Концентрации 10 и 15 мкг/мл оказывают слаботоксичное действие на парамеций.

В качестве критерия токсичности использовали LD₅₀ – летальная доза Al₂O₃, вызывающая гибель половины (50%) организмов за определенный промежуток времени (24 ч). В результате проведенных исследований параметры токсичности Al₂O₃ в остром опыте составили: LD₅₀ = = 23 мкг/мл (рис. 3б).

В других исследованиях НЧ Al₂O₃ оказались менее токсичными. В [25] установлено, что концентрация Al₂O₃ (размер частиц 83 нм), при которой происходит гибель 50% инфузорий Paramecium multimicronucleatum в 48-часовой экспозиции, составляет 9269 мг/л. Токсичность НЧ Al₂O₃ (с размером частиц Δ₅₀ 7 и 70 нм) изучали по хемотоксическому ответу инфузорий P. caudatum [26]. Согласно проведенным исследованиям НЧ Al₂O₃ (Δ₅₀ = 70 нм) оказались наиболее токсичными (LD₅₀ = 1.22 мг/л), чем НЧ (Δ₅₀ = 7 нм), которые не оказывали токсичного действия.

Несоответствие данных о зависимости токсичности НЧ Al₂O₃ от размера частиц может быть вызвано использованием авторами различных методов оценки токсичности.

Токсичность Al₂O₃ зависит от межфазного взаимодействия НЧ с клеточной поверхностью, а также от физико-химических свойств НЧ (размер и поверхностный заряд) [25]. С уменьшением размеров НЧ площадь поверхности увеличивается, что вызывает дозозависимое увеличение окислительного стресса [27]. Окислительный стресс является одним из основных механизмов токсического действия НЧ Al₂O₃, возникающий в условиях воздействия НЧ на водные организмы [26]. Также значимым фактором является заряд частиц. Наибольшую опасность представляют положительно заряженные частицы, обладающие высоким сродством к макромолекулам ДНК и, следовательно, несущие генотоксический потенциал [27].

Токсичность НЧ Al₂O₃ различна для разных тест-организмов. Было выявлено ингибирующeе влияние Al₂O₃ с размером частиц 70 нм на рост микроводорослей Сhlorella vulgaris (LD₅₀ = 15 мг/л), а для Daphnia magna Al₂O₃ оказался менее токсичным, LD₅₀ составляет более 100 мг/л [26]. Оксид алюминия (с размером частиц 16 нм) в концентрации 4 мг/л индуцирует необратимые гистопатологические поражения жаберных, печеночных и мозговых тканей пресноводных рыб Oreochromis mossambicus после 96 ч воздействия [19]. При сравнении среднелетальной дозы Al₂O₃ у разных видов выявлено, что инфузории P. caudatum являются более чувствительными организмами для оценки токсичности Al₂O₃ в водных средах (LD₅₀ = 23 мкг/мл).

При анализе литературных данных можно сделать вывод, что токсическое действие НЧ Al₂O₃ является специфическим и зависит от размера и поверхностного заряда частиц, а также от концентрации и времени экспозиции.

Таким образом, высокая токсичность НЧ Al₂O₃ может быть вызвана небольшими размерами частиц (13–16 нм) и высокой проникающей способностью, что облегчает их перераспределение внутри клетки. Оксид алюминия, используемый в этом исследовании, демонстрирует положительный поверхностный потенциал (44 мВ), что также может способствовать увеличению токсичности. Известно, что НЧ Al₂O₃ способны генерировать активные формы кислорода, повреждать ДНК, нарушать экспрессию белков, деполяризовывать клеточную мембрану, вызывать морфологические изменения и гибель клеток [12, 28]. Оксид алюминия оказывает вредное воздействие на низшие водные организмы, участвующие в самоочищении водоемов и представляющие собой кормовые ресурсы для рыб. Следовательно, контаминация водной среды НЧ Al₂O₃ может оказывать негативное влияние на живые организмы и представлять опасность для водных экосистем.

Несмотря на то что инфузории как модельный объект широко используются для оценки токсичности, механизмы токсических эффектов НЧ Al₂O₃ на P. caudatum практически не изучены. Это свидетельствует о необходимости проведения дополнительных токсикологических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Опасность наночастиц оксида алюминия оценивали по выживаемости инфузорий P. caudatum. НЧ Al₂O₃ оказывают острое токсическое воздействие на парамеций. При концентрации 100 мкг/мл (экспозиция 0.5 ч) наблюдается 100%-ная гибель инфузорий. Значение LD₅₀ составляет 23 мкг/мл при 24-часовой экспозиции. Сравнительно высокая токсичность НЧ Al₂O₃ может быть вызвана небольшими размерами (13–16 нм) и положительным зарядом частиц, а также высокой проникающей способностью, что облегчает их перераспределение внутри клетки.

Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания № 0671-2020-0058 в сфере научной деятельности. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета за счет гранта президента Российской Федерации (МД-2153.2020.3).