Российские нанотехнологии, 2022, T. 17, № 3, стр. 424-432

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время основной теорией развития болезни Альцгеймера (БА), которая характеризуется прогрессирующей гибелью нейронов, снижением когнитивных способностей и развитием деменции, является образование амилоидных бляшек и гиперфосфорилирование τ-белка. Однако причины развития таких нарушений остаются неясными до сих пор. Рассматриваются различные гипотезы возникновения и развития БА, в том числе дисфункция митохондрий в нейронах, при которой происходит избыточное образование активных форм кислорода, что обусловливает развитие окислительного стресса [1]. Большое значение в развитии БА играет воспаление – прежде всего как вторичный фактор, возникающий в ответ на патофизиологические процессы в нервной ткани, но которое также рассматривается в качестве этиологического фактора, предшествующего отложению амилоида [2–4]. Большое количество недавних исследований посвящено изучению действия антиоксидантных и противовоспалительных препаратов для превентивной терапии БА. Было установлено, что у трансгенных мышей 5XFAD с семейной БА, получавших тетракурмин, обладающий антиоксидантным действием, наблюдалось значительное улучшение показателей теста на распознавание объектов и пространственной памяти. Также отмечено улучшение показателей окислительного стресса в тканях мозга: активности супероксиддисмутазы и уровней малонового диальдегида и глутатиона [5]. Еще одним известным природным антиоксидантом является каротиноид астаксантин (АСТ), присутствующий в микроводорослях, дрожжах, а также в ракообразных, криле и лососевых видах рыб. АСТ является основным каротиноидом в Haematococcus и существует главным образом в виде моноэфиров (70%) и диэфиров (15–20%). В свободной форме находится 4–5% АСТ [6]. Структурная формула АСТ приведена на рис. 1. В многочисленных исследованиях АСТ успешно применяли в случаях экспериментального диабета [7], при окислительном стрессе, вызванном возрастными изменениями [8], на крысах с хирургической моделью БА [9]. В последнее время установлено нейропротекторное действие этого каротиноида при его применении на моделях БА как хирургических [9], так и трансгенных [10, 11]. Распространенной мышиной моделью БА является линия трансгенных мышей 5XFAD (семейная БА), у которых пять мутаций находятся в гене АРР – предшественнике амилоидного пептида, и в гене PS1, кодирующем белок пресенилин 1.

Рис. 1.

Структурные формулы свободной формы АСТ (R₁ = H, R₂ = H), его моно- (R₁ – остаток жирной кислоты, R₂ = H) и диэфиров (R₁ и R₂ – остатки жирной кислоты).

Поскольку каротиноид – гидрофобное соединение, оно не растворимо в воде, поэтому применение в качестве пищевой добавки животным возможно в виде жирорастворимой формы. В [12] была разработана наноэмульсионная форма эфиров АСТ на основе фосфолипидов. Цель настоящего исследования – изучение действия наноформ АСТ и его эфиров на поведение трансгенных мышей 5ХFAD с помощью поведенческих тестов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы. Астаксантин из Blakeslea trispora, эфиры АСТ (смесь моно- и диэфиров) из Haematococcus pluvialis (Sigma-Aldrich, Германия); фосфатидилхолин Lipoid S75 (в составе 75.3% фосфатидилхолина и 8% фосфатидилэтаноламина) (Lipoid GMBH, Германия); изопропанол (Химмед, Россия).

Наноэмульсии (НЭ) готовили методом инжекции раствора фосфатидилхолина в изопропаноле в воду [12, 13]. Получены НЭ следующего состава: S75:АСТ (2:0.2 мг/мл), S75:эфиры (2:0.2 мг/мл) и S75 (2 мг/мл). Гидродинамический диаметр (d, нм) частиц определяли на приборе Zetasizer Nano (Malvern, Великобритания).

Животные. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 и согласно протоколу, утвержденному комиссией по биоэтике НИЦ “Курчатовский институт” № НГ-1/01.13пр от 11.03.2021. Самцы трансгенных мышей 5XFAD (B6SJL) поступили в возрасте 4 мес (далее “5XFAD фон”) (46 особей) и в возрасте одного года (далее “5XFAD 12 мес”) (18 особей). Самцы C57Bl/6 поступили в возрасте 4 мес (далее C57Bl) (14 особей). До транспортировки в НИЦ “Курчатовский институт” все животные содержались в одинаковых условиях.

Животные получены из Центра доклинических испытаний Института физиологически активных веществ РАН, г. Черноголовка. Перед началом тестирования животные прошли двухнедельный карантин. Животные содержались в индивидуально вентилируемых клетках со свободным доступом к воде и пище при 12-часовом цикле день/ночь.

Поведенческие тесты. Использовали тесты приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) и “открытое поле” (ОП) с использованием системы оценки пространственного поведения животных Noldus. За час до начала эксперимента мышей помещали в комнату, где располагался тест. Для устранения запаха предыдущего животного все поверхности протирали 70%-ным раствором спирта. Тест ОП представлял собой круглую арену диаметром 120 см с высокими бортиками. Арена виртуально была разделена на три зоны: центральная, медиальная и периферическая. Животных помещали в центр арены. Трек записывали в течение 5 мин. Учитывали следующие параметры: общее пройденное расстояние и среднюю скорость, время, проведенное в центральной, медиальной и периферической зонах, количество заходов в эти зоны, а также латентный период выхода из центральной зоны для оценки свободного поведения, двигательной и исследовательской активности.

ПКЛ представлял собой скрещенные посередине перпендикулярно друг другу открытые и закрытые прозрачными стенками рукава высотой 30 см, длиной 62 см каждый. Лабиринт был приподнят над землей на высоту 80 см. Мышей помещали в центр, они свободно перемещались между рукавами. Трек записывали в течение 5 мин. Учитывали время, проведенное в открытых рукавах, количество заходов в открытые рукава и латентный период выхода из центра в открытые рукава для оценки тревожности, вызванной открытым пространством и высотой.

Анализ результатов поведенческих тестов проводили с помощью программного обеспечения Noldus Ethovision.

Протокол исследования. После двухнедельного карантина до получения НЭ изучали поведение мышей в группах “5XFAD фон”, “5XFAD 12 мес” и C57Bl в тестах ПКЛ и ОП. Данные группы “5XFAD фон” использовали как контроль в динамике: далее эту группу разделили на три группы, которые получали следующие НЭ: S75:АСТ (группа “АСТ”, 15 особей), S75:эфиры (группа “эфиры”, 16 особей) и S75 (группа “S75”, 14 особей). НЭ давали в течение двух месяцев перорально вместе с кормом 5 раз в неделю (4 раза однократно, а 1 раз животные получали двойную дозу: 300 мкл НЭ наносили на кусочек корма так, чтобы доза АСТ или его эфиров составляла 2 мг/кг веса (доза липидов при этом была 20 мг/кг). Группу “5XFAD 12 мес” использовали в качестве контроля глубокого развития БА, группу С57Bl – в качестве здорового контроля. По прошествии двух месяцев поведенческие тесты повторили для каждой группы. Данные о весе животных представлены в табл. 1.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета программ Stat Soft Statistica 10.0. Межгрупповые различия считали по следующим непараметрическим критериям: для независимых групп применяли U-критерий Манна–Уитни, для зависимых (при оценке действия препаратов по сравнению с фоном) – критерий Вилкоксона. Достоверными различия считали при p < 0.05. Все значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве модели для БА использовали самцов трансгенных мышей 5XFAD в возрасте 4.5 мес и 1 года. В качестве контроля выступали мыши C57Black (4.5 мес). До начала эксперимента всем мышам проводили поведенческие тесты ОП и ПКЛ. Тест ОП измеряет двигательную и исследовательскую активность мышей, а также может служить для предварительной оценки тревожности [14]. Тест ПКЛ используется для оценки тревожности и основан на естественном страхе мышей перед открытыми участками и высотой, а также на их естественном исследовательском поведении в новой среде [15]. В нормальном состоянии мышам свойственен тигмотаксис: они стремятся оказаться в периферийной (пристеночной) зоне ОП и меньше времени проводят на открытых участках ПКЛ [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТА ПКЛ

Результаты ПКЛ до получения НЭ. Оценивали ЛП захода в открытые рукава, число заходов и время, проведенное в них (рис. 2).

Рис. 2.

Результаты теста ПКЛ. Возраст животных на момент проведения теста: “5XFAD фон” – 4.5 мес, “5XFAD 12 мес” – 12 мес, С57Bl – 4.5 мес. Представлены средние значения ± SEM; а – время, проведенное в открытых рукавах; б – число заходов в открытые рукава; в – латентный период выхода в открытые рукава. * – достоверные отличия от группы C57Bl (p < < 0.05 по U-критерию Манна–Уитни для независимых групп).

Время в открытых рукавах зависит от возраста мышей с БА (т.е. в том числе от выраженности болезни): группа “5XFAD 12 мес” находится в открытых рукавах дольше всего, хотя заходит туда не чаще и не быстрее, чем остальные группы. Можно сделать вывод, что БА у мышей приводит к уменьшению двигательной активности и снижению тигмотаксиса. Эти данные соответствуют данным теста ОП. Статистически незначимая тенденция к увеличению ЛП у группы “5XFAD фон” не является показательной, так как параметр иллюстрирует большой разброс данных (стандартное отклонение – 78.8, тогда как у групп С57Bl и “5XFAD 12 мес” – 41.3 и 24.0 соответственно).

Результаты теста ПКЛ после получения НЭ. Оценивали ЛП захода в открытые рукава, число заходов и время, проведенное в них (рис. 3). Все группы, получавшие НЭ, впервые заходили в открытые рукава достоверно быстрее, чем “5XFAD фон” (p = 0.028, 0.013 и 0.0015 для “АСТ”, “эфиры” и “S75” соответственно). Возможно, это следствие того, что установка предъявляется животным во второй раз и является для них знакомой, так как различий по ЛП у групп, не получавших НЭ, не наблюдалось (рис. 2). Различий по числу заходов туда при этом не наблюдалось у всех рассматриваемых групп. Все группы 6.5-месячных мышей – “АСТ”, “эфиры” и “S75” – проводили в открытом рукаве достоверно больше времени, чем 4.5-месячные “5XFAD фон” (p = = 0.011, 0.00094 и 0.0019 соответственно), но только у группы “АСТ” наблюдалось достоверное снижение количества времени по сравнению с контрольной “S75” (p = 0.026). В случае группы “эфиры” достоверных различий с контрольной группой не выявлено, хотя тенденция к улучшению, т.е. снижению времени есть (p = 0.077).

Рис. 3.

Влияние АСТ и его эфиров на поведение в тесте ПКЛ. Группы “АСТ”, “эфиры” и “S75” в течение двух месяцев получали соответствующие НЭ, возраст мышей 6.5 мес. Представлены средние значения ± ± SEM; а – время, проведенное в открытых рукавах; б – число заходов в открытые рукава; в – латентный период выхода в открытые рукава; ^ – достоверные различия групп “АСТ” и “S75” (p < 0.05 по U-критерию Манна–Уитни для независимых групп); ** – достоверные отличия по критерию Вилкоксона для зависимых групп (p < 0.05): группы “АСТ”, “эфиры” и “S75” по сравнению с их фоном.

Отметим, что параметр времени пребывания в открытом рукаве группы “S75” приближается к таковому у группы “5XFAD 12 мес” (176.5 ± 11.2 с), при том что мыши этой группы почти вдвое старше, что может свидетельствовать о достаточном развитии БА у трансгенных мышей к возрасту 6.5 мес.

Учитывая изложенные выше данные и принимая, что БА у мышей приводит к уменьшению двигательной активности и снижению тигмотаксиса, можно сделать предположение, что АСТ снижает развитие БА у трансгенных мышей, так как приближает параметры к норме.

Обобщая данные обоих тестов, можно сделать вывод, что компенсация развития БА проявляется как при получении животными эфиров, так и АСТ: в тесте ОП лучше себя проявили эфиры, а в ПКЛ – АСТ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

БА развивается, как правило, в пожилом возрасте, для которого характерны снижение активности иммунной и нейрональной систем и развитие так называемого старческого стерильного воспаления, которое сопровождается окислительным стрессом. При развитии БА активируется провоспалительный путь передачи внутриклеточного сигнала через транскрипционный фактор NF-κB и увеличивается секреция провоспалительных цитокинов [19], развивается окислительный стресс, при котором усиливается перекисное окисление липидов, белков и низкомолекулярных антиоксидантов, в первую очередь глутатиона, и снижается активность ферментов противооксидантной защиты. В условиях развивающейся нейродегенерации введение антиоксиданта АСТ оказывает многофакторное воздействие: не только уменьшается содержание продуктов перекисного окисления липидов, но и повышается активность ферментов супероксиддисмутазы и каталазы, а также восстанавливается нормальное соотношение пары окисленный/восстановленный глутатион [9]. Помимо антиоксидантного действия АСТ оказывает противовоспалительный эффект: понижает активацию глии и выброс противовоспалительных цитокинов, что является важным фактором защиты нейронов [20]. Противовоспалительный эффект может быть обусловлен ингибирующим действием АСТ на активность NF-κB и уменьшением экспрессии провоспалительных медиаторов в стимулированных липополисахаридом клетках RAW264.7 и в первичных макрофагах [21]. В [22] было показано, что АСТ активирует образование комплексов транскрипционного фактора Nrf2 и увеличивает высвобождение гемоксигеназы-1. В [11] предложен еще один механизм действия АСТ, согласно которому каротиноид опосредованно влияет на процесс слияния и деления митохондрий, нарушенный в синапсах при БА. АСТ способен преодолевать гематоэнцефалический барьер [23]. Как показали исследования на Сасо-2 клетках, проникновение АСТ через мембрану клетки может происходить с помощью специального белка, выполняющего функции транспортера [24].

При исследовании влияния АСТ на поведение мышей APP/PS1 [11] и крыс с хирургической БА [9, 25] отмечалось улучшение когнитивных способностей, обучения и памяти по результатам водного лабиринта Морриса, теста на распознавания нового объекта и других тестов, а также снижение содержания амилоида в гиппокампе.

В экспериментальных работах на животных обращает на себя внимание тот факт, что, как правило, сведения о природе и чистоте используемого препарата, а также о форме, в которой его получали животные, недостаточны. В некоторых случаях используется коммерческий АСТ, в некоторых – экстракт из микроводорослей или криля, в которых основным компонентом являются моноэфиры АСТ. Однако при сравнении действия свободной формы АСТ и его синтетического диэфира было установлено, что именно эфиры АСТ эффективнее [10].

Целью исследования было продемонстрировать на примере поведенческих тестов ОП и ПКЛ изменения в поведении и тревожности мышей 5XFAD с ранним и поздним развитием БА (молодые и старые мыши) и изучить влияние АСТ и его эфиров, включенных в НЭ из фосфатидилхолина, на поведение молодых мышей 5XFAD. Для этого проводили тесты с мышами 5XFAD в возрасте 4.5 мес (фон), одного года (“5XFAD 12 мес”), а также 4.5 мес (С57Black). Далее молодые мыши c БА в течение двух месяцев получали НЭ, содержащие АСТ или его эфиры (дозировка 2 мг/кг), или НЭ, не содержащие каротиноидов (S75). По истечении этого срока тесты повторяли.

С помощью этих тестов исследуют реакцию мышей на незнакомую среду, попав в которую, животное начинает перемещаться и исследовать пространство. С другой стороны, мыши стремятся избегать ярко освещенных и открытых мест [26]. Литературные данные по двигательной активности в тестах ОП у мышей с генетической моделью БА и относительно здоровых мышей противоречивы. Не было обнаружено различий между мышами генотипа B6C3 и мышами дикого типа (возраст 8–9 мес) [27], а также между мышами генотипа B6SJL и дикого типа (возраст 9–12 мес) [28]. Не было показано и различий по двигательной активности (и по времени нахождения в различных зонах) у мышей 5XFAD (Tg6799) и мышей линии CD-1 (возраст 3–6 мес) [29]. В [30] хотя и не было показано отличий мышей 5XFAD от здоровых (без указания линии) животных, но наблюдалась, во всяком случае, тенденция к уменьшению пройденной в тесте ОП дистанции у мышей с другой генетической моделью БА – TauP301S. В [16] показано снижение двигательной активности у мышей 5XFAD (B6SJL-Tg) в сравнении с мышами дикого типа в возрасте 12–13 мес, но не ранее. Снижение двигательной активности в молодом возрасте (3–6 мес) с прогрессированием к 9 мес было продемонстрировано в [31]. В настоящем исследовании выявлено, что двигательная активность у мышей 5XFAD снижается уже к 4.5 мес. В целом уменьшение двигательной активности в тесте ОП при развитии БА установлено в разных работах, но не является ярким и несомненным признаком.

В [17] при оценке уровня тревожности и исследовательского интереса в тесте ОП наблюдали аналогичную наблюдаемой в настоящей работе картину по времени нахождения в периферической зоне у мышей 5XFAD относительно С57Black. Снижение времени, проведенного в периферической зоне, у молодых мышей с БА относительно здоровых животных не объяснялось, а увеличение этого параметра у старых связывали с повышенной тревожностью. В [17] не рассматривали параметр времени, проведенного в периферической зоне, в совокупности с числом заходов в зоны и другими параметрами. Объяснение, полученное в настоящей работе, представляется более полным: на ранней стадии развития болезни у мышей двигательная активность снижается не намного, но уже нарушается тигмотаксис, а у старых мышей двигательная активность настолько сильно снижена, что отчасти маскирует нарушения тигмотаксиса. Схожие результаты были получены в [27]: мыши 5XFAD показали возрастную зависимость по времени, проведенному в центральной зоне теста ОП, по сравнению с мышами дикого типа. Это явление объясняют снижением тревожности по мере развития БА [27]. Учитывая литературные и полученные в исследовании данные, можно сделать вывод о чувствительности использованной методики к линейным различиям животных.

При анализе поведения мышей в тесте ПКЛ исследователями неоднократно отмечалось, что с возрастом у мышей 5XFAD увеличивается время, проведенное в открытых рукавах, однако трактовка этого явления разнится. Так, в [17] отмечают, что увеличение времени происходило за счет замирания, и объясняют такой результат повышением уровня тревожности при развитии БА. В [27, 30], напротив, возрастную зависимость объясняли снижением уровня тревожности по мере развития заболевания. Эти данные согласуются с полученными результатами по тестам ПКЛ и ОП. В первом тесте лучше себя проявил АСТ, а во втором – его эфиры. Возможно, обе формы действуют по-разному, так как эфиры АСТ имеют в своем составе один (моноэфиры) или два остатка (диэфиры) жирной кислоты в отличие от АСТ, в молекуле которого две незамещенные гидроксильные группы (рис. 1). В связи с этим эфиры АСТ являются более гидрофобными соединениями по сравнению со свободной формой. Можно предположить, что благодаря различию в гидрофобности эфиры легче проникают через мембрану нейрональных клеток.

Многие исследователи показывают положительное влияние АСТ в экспериментах in vivo, обходя при этом вниманием эфиры АСТ. Проведенная работа показала, что последние также эффективны в отношении терапии БА.

Авторы выражают благодарность сотруднику Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова А.В. Крючковой за большой вклад в оценку результатов и текст этой статьи, М.Ю. Копаевой (Ресурсный центр нейрокогнитивных исследований НИЦ КИ) за помощь в работе с лабораторными животными, Ресурсный центр нейрокогнитивных исследований НИЦ КИ за обеспечение оборудованием, А.В. Сымона (Представительство Lipoid AG в Москве) за предоставление фосфолипидов

Работа выполнена при поддержке НИЦ “Курчатовский институт” (НИР “Биомедицинские технологии”, подтема 2, приказ № 1059 от 2 июля 2020).