Российские нанотехнологии, 2022, T. 17, № 3, стр. 415-423

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в биомедицине значительное внимание уделяется поиску новых эффективных инструментов для диагностики и лечения онкологических заболеваний. Одним из таких подходов является фототермическая терапия с применением золотых наночастиц (НЧ) [1].

НЧ золота обладают высокой биосовместимостью в широком диапазоне размеров и концентраций [2] и за счет возбуждения локализованного плазмонного резонанса излучают тепло при поглощении света определенных длин волн. Для эффективного преобразования оптической энергии в тепло НЧ золота должны обладать определенным значением эффективного сечения экстинкции. Оно должно быть достаточным для преобладания поглощательных процессов над процессами рассеяния и оптимальным с точки зрения спектрального положения резонанса, совпадающим с окнами прозрачности для биологических тканей. На длинах волн от 700 до 900 нм ткани тела человека являются менее оптически плотными, а толщина скин-слоя оптического излучения достигает нескольких сантиметров [3]. При диаметрах менее 30 нм НЧ золота представляют собой идеальные плазмонные поглотители оптического излучения, в которых длина волны, где наблюдается возбуждение плазмонного резонанса, составляет около 520 нм. Спектральный сдвиг пика плазмонного резонанса в сторону больших длин волн может быть достигнут за счет изменения формы НЧ или состава окружающей их среды. К примеру, смещения спектрального положения плазмонного резонанса в красную область можно достичь за счет увеличения диэлектрической проницаемости окружающей среды ε_ex [4]. Добиться увеличения ε_ex можно, покрывая НЧ золота оптически более плотным ферромагнитным материалом [5–10], в роли которого может выступить феррит кобальта, формируя нанокомпозитный материал.

Кобальтовый феррит (CoFe₂O₄ или CFO) обладает свойствами, позволяющими использовать его в биомедицине: высокая магнитокристаллическая анизотропия (~200 кДж/м³), температура Кюри T_C ~ 793 K, относительно высокая намагниченность насыщения (до 90 А м²/кг), а также высокая термическая стабильность [11]. CFO принадлежит семейству шпинелевых ферритов типа M²⁺Fe$_{2}^{{3 + }}$O₄, где M²⁺ – двухвалентный металл. Магнитными свойствами CFO можно управлять, контролируя его химический состав. Например, использование НЧ легированного цинком кобальтового феррита (CFO_Zn) позволяет увеличить магнитную анизотропию [12, 13]. Также НЧ CFO оказывают слабый цитотоксический эффект при условии, что они синтезированы с биосовместимым покрытием и используются в невысоких концентрациях [14–16].

Благодаря сочетанию плазмонных и магнитных свойств нанокомпозиты из НЧ золота и CFO могут быть использованы, например, для усиления контраста при магнитно-резонансной томографии, детектирования специфических химических процессов и адресной доставки лекарственных препаратов [17–19]. Как терапевтический агент нанокомпозиты могут применяться для лечения раковых заболеваний [20, 21], чему способствует их высокая фотостабильность [22, 23]. В частности, с учетом свойств обоих компонентов нанокомпозитов их можно использовать для комбинированной фототермической терапии [24, 25] и магнитной гипертермии [26, 27].

Цитотоксичность и влияние отдельных составляющих нанокомпозита и самого нанокомпозита на биологические объекты могут различаться при их использовании с разными видами клеточных культур. Так, при тестировании НЧ CFO, покрытых диоксидом кремния, на клеточной линии Jurkat было выявлено незначительное кратковременное снижение пролиферативной активности культуры, что может свидетельствовать о цитотоксичности применяемого материала [28]. С другой стороны, легирование НЧ CFO цинком не оказывало влияния на пролиферативную активность фибробластов [29]. Отметим, что при небольших концентрациях НЧ CFO диаметром менее 10 нм практически не влияют на пролиферативную активность клеток рака поджелудочной железы и рака яичников, хотя продолжают в них накапливаться [30]. Однако при увеличении диаметра НЧ CFO оказывает на них токсическое действие [30]. Для потенциального применения наноматериалов в биомедицинских приложениях необходимо исследовать их эффект на клетки не только в патологическом состоянии (например, клетки Jurkat – клетки Т-лимфобластной лейкемии), но и в их нормальном, физиологическом состоянии (клетки МНК – мононуклеарные клетки крови человека). Такой подход помогает оптимально подобрать необходимые материалы для изготовления НЧ и концентрации введения в клеточную среду для их эффективного применения. Формирование нанокомпозитных структур из НЧ золота и CFO может быть выполнено в виде структуры ядра/оболочки [31–34] или в виде кластерной структуры [34, 35]. Основными подходами к формированию нанокомпозитов являются:

– осаждение золота на НЧ CFO путем его восстановления из раствора тетрахлороаурата водорода (HAuCl₄) с образованием структуры ядро/оболочка [36];

– адсорбция затравок или НЧ золота на поверхности CFO с последующим образованием кластеров НЧ золота на поверхности магнитных НЧ [35, 37].

Однако данные методы синтеза сложны и требуют точного контроля роста НЧ золота. Так, раздельный синтез НЧ CFO и наночастиц золота с дальнейшим объединением их в композитную структуру с помощью органических покрытий является более простым и оптимальным способом синтеза таких наноматериалов [35, 38, 39].

В данной работе предложен протокол синтеза нанокомпозитной структуры, которая может быть использована для проведения фототермической терапии. Нанокомпозит представляет собой НЧ золота диаметром ~10 нм, покрытые аргинином, окруженные НЧ CFO, допированного цинком, диаметром ~5 нм, покрытыми дигидрокафеиновой кислотой. Результаты исследования структурных, магнитных и оптических свойств полученного композита, а также его влияния на пролиферативную активность клеточных культур показывают возможность его применения в биомедицине.

МЕТОДЫ

Синтез нанокомпозита. Для создания магнитной составляющей нанокомпозита – наночастиц кобальтового феррита, легированного цинком в соотношении 1 : 1 (СFO_Zn), 0.5 ммоль нитрата цинка, 0.5 ммоль нитрата кобальта и 2 ммоль нитрата железа были растворены в 2 мл дистиллированной воды, а затем подвергнуты автоклавированию. Дальнейший синтез нанокомпозита Au/CFO_Zn был проведен согласно методике [40]. Покрытие наночастиц СFO_Zn дигидрокафеиновой кислотой придает поверхности гидрофильные свойства [41], что позволяет коллоидной суспензии оставаться стабильной в водных средах, что необходимо при использовании в биомедицине. Поверхность частиц, покрытых дигидрокафеиновой кислотой, обладает отрицательным поверхностным зарядом, в то время как покрытие аргинином придает поверхности частиц положительный заряд [24]. Наличие частиц с отрицательным и положительным зарядами поверхностей приводит к их взаимодействию между собой и объединению в нанокомпозит. Полученный нанокомпозит, состоящий из НЧ золота, покрытых аргинином, и окружающих их CFO_Zn, покрытых дигидрокафеиновой кислотой, в дальнейшем обозначается как Au/CFO_Zn.

Методики исследования. Форма и размер НЧ в синтезированном нанокомпозите Au/CFO_Zn были изучены с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) JEM-2100 (фирма JEOL) с ускоряющим напряжением 200 кВ. Для этого порошок композитных НЧ разбавляли в н-гексане и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин для предотвращения агломерации. Затем суспензию НЧ наносили на покрытую углеродом медную сетку и сушили на воздухе. Распределение НЧ по размерам выполнено с использованием программного обеспечения (ПО) ImageJ.

Элементный состав наночастиц CFO_Zn исследовали методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) с помощью спектрометра iCAP 6300 DUP ICP-OES от Thermo Scientific, а элементный состав нанокомпозита Au/CFO_Zn – методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДС) на приборе EDX Bruker Quantax 75. Анализ результатов ЭДС проведен с использованием ПО ESPRIT Compact.

Структуру наночастиц CFO_Zn и нанокомпозита Au/CFO_Zn исследовали методом рентгеноструктурного анализа (РСА) на настольном порошковом рентгеновском дифрактометре AXRD (PROTO Manufacturing). Данные РСА были записаны в диапазоне 2θ от 30° до 90° с шагом 0.015 и временем вычисления 5 с/шаг на излучении CuK_α с длиной волны 1.54184 Å. Результаты проанализированы с помощью ПО QualX.

Магнитные свойства нанокомпозита Au/CFO_Zn исследовали с помощью вибрационного магнитометра LakeShore VSM 7400. Петли гистерезиса НЧ измеряли при комнатной температуре в поле до 1 Тл. Уровень шума вибрационного магнитометра составил 10^–6 э.м.е. при усреднении сигнала 3 с на точку.

Оптические свойства нанокомпозита Au/CFO_Zn изучали в диапазоне длин волн от 370 до 850 нм методом спектроскопии поглощения видимого света. Экспериментальная установка состояла из галогенной лампы и монохроматора MS5204i в качестве источника света, оптомеханического чоппера с частотой 423 Гц, квадратной кварцевой кюветы емкостью 3500 мкл с длиной оптического пути 10 мм и фотоумножительной трубки PMM02 с синхронным усилителем SR830 в качестве системы детектирования. Нанокомпозит Au/CFO_Zn диспергировали в дистиллированной воде до получения трех концентраций: 10, 50 и 100 мкг/мл. По закону Бугера–Ламберта–Бера рассчитаны спектры поглощения полученных суспензий наночастиц:

где А – поглощенная интенсивность, I₀ – интенсивность падающего света, I – интенсивность света, прошедшего через кювету с водной суспензией нанокомпозита. Для получения спектра поглощения нанокомпозита из полученных данных вычитали спектр поглощения кварцевой кюветы с водой.

Моделирование спектральных зависимостей сечений поглощения частиц золота и синтезированного нанокомпозита было выполнено численным методом конечных разностей во временной области. Данный алгоритм основан на дискретизации уравнений Максвелла, записанных в дифференциальной форме, и относится к общему классу сеточных методов решения дифференциальных уравнений. Модель построена на основе размеров НЧ золота и CFO, определенных из ПЭМ-изображений нанокомпозита. Расчеты сечений поглощения представлены в виде спектральных зависимостей поглощенной мощности нормированной на площадь поверхности отдельной составляющей нанокомпозита. Моделирование проводили с помощью ПО Lumerical FDTD Solutions (v.8.26.2834, Lumerical Inc.).

Исследование цитотоксичности. Исследовали влияние нанокомпозита на жизнеспособность двух клеточных культур: Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat) и мононуклеарных клеток крови человека (МНК). Четвертый и пятый пассажи клеток культуры Jurkat, полученной из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия), использовали для проведения эксперимента. МНК были выделены из цельной гепаринизированной крови здоровых доноров (разрешение № 5 от 16 мая 2016 г.; Местный этический комитет, Инновационный парк “Фабрика”, Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта). Цельная гепаринизированная кровь объемом 5 мл была разбавлена в 15 мл фосфатно-солевого буферного раствора, а затем добавлена отдельным слоем на 15 мл фиколла (Диакол, Диаэм, Россия) в конической пробирке объемом 50 мл. Образец центрифугировали в течение 40 мин при 400 g без резкого торможения. Слой МНК был аккуратно собран в новую пробирку и дважды промыт в фосфатно-солевом буферном растворе. Обе клеточные культуры культивировали в питательной среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 0.3 мг/мл L-глутамина (все Sigma, США), 1% пенициллина и стрептомицина в атмосфере с 5% CO₂ при 37°С.

Влияние трех концентраций Au/CFO_Zn (10, 50 и 100 мкг/мл) в клеточной среде на жизнеспособность клеточных линий определяли с помощью теста WST-1 (Roche Diagnostics GmbH, Германия) через 2, 4, 8, 24 и 48 ч. Данный тест основан на реакции восстановления соли тетразолия WST-1 до формазана, концентрация которого прямо пропорциональна концентрации живых клеток. При этом цвет раствора меняется от светло-красного до ярко-желтого, что влияет на изменение его оптической плотности.

Для проведения эксперимента использовали 96-луночные микропланшеты. В контрольные лунки высевали 5 × 10⁵ клеток в 100 мкл (Control). В экспериментальные лунки c клетками добавляли нанокомпозит (Experiment). Чтобы исключить влияние НЧ и клеточной среды на результат исследования, вместе с экспериментальными и контрольными лунками дополнительно использовали лунки с клеточной средой (Control blank) и суспензиями нанокомпозита в клеточной среде (Experimental blank). Каждый эксперимент проводили с шестикратной повторяемостью. В течение последних двух часов выдержки каждого эксперимента было проведено окрашивание WST-1. Оптическую плотность среды измеряли при 450 нм в планшетном спектрофотометре Bio-Rad 680. Результаты эксперимента получены вычитанием оптической плотности Experimental blank из оптической плотности Experiment, результаты контрольных измерений – вычитанием оптической плотности Control blank из оптической плотности Control.

Статистический анализ. Все результаты исследования жизнеспособности клеточных культур Jurkat и МНК относительно контрольных измерений представлены в виде среднего значения с указанием стандартного отклонения. Тест Краскела–Уоллиса с последующим тестом Данна использовали для статистического анализа каждой экспериментальной группы с контрольной с помощью ПО GraphPadPrism v.7.04.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Физические и физико-химические свойства нанокомпозита. На начальном этапе синтеза нанокомпозита Au/CFO_Zn были получены наночастицы CFO_Zn, покрытые дигидрокафеиновой кислотой. Методом ИСП-МС проведен анализ их состава. Результаты показали соотношение кобальта : железа : цинка в пропорции 0.52 : 1.93 : 0.55.

Спектр ЭДС нанокомпозита Au/CFO_Zn показал наличие пиков железа, кобальта, кислорода, углерода, алюминия и натрия. Пик натрия связан с гидроксидом натрия, используемого в качестве одного из прекурсоров синтеза магнитной фазы, а пики алюминия и углерода вызваны алюминиевым держателем образца и углеродной ленты, на которых проводилось измерение. Результаты исследований нанокомпозита Au/CFO_Zn с помощью ПЭМ, вибрационного магнитометра и рентгеновского дифрактометра показаны на рис. 1.

На ПЭМ-изображении образца Au/CFO_Zn показаны наночастицы CFO_Zn (светло-серые сфероиды) со средним размером 5.7 ± 1.2 нм. Магнитные НЧ находятся в тесном контакте с НЧ золота (темные сфероиды), средний диаметр которых 9.6 ± 2.3 нм. Фазовый состав нанокомпозита, полученный методом РСА, показал наличие пиков золота на 2θ = 38.2°, 44.4°, 64.7°, 77.6° и пиков титана при 2θ = 35.5°, 40.4°, 53.4°, 71.2°, 81.9°. Титан является стандартной примесью при сонохимическом синтезе НЧ, получаемой при разрушении ультразвуковой обработкой титанового наконечника. Пики дифрактограммы титана были получены на тех же углах, что и пики шпинели – фазы, характерной для CFO.

Наличие ферромагнитной фазы в нанокомпозите Au/CFO_Zn было также подтверждено результатами исследования магнитных свойств методом вибрационной магнитометрии. Полученная зависимость магнитного момента от напряженности приложенного поля для нанокомпозита является практически безгистерезисной (суперпарамагнитной) петлей с коэрцитивной силой менее 1 мТл. Эти данные согласуются с данными [12] для однодоменных НЧ CFO диаметром ~5 нм. НЧ с подобными магнитными свойствами могут быть использованы, например, для магнитной гипертермии [42, 43].

Спектральное положение и интенсивность пика локализованного плазмонного резонанса, обеспечивающего возможность фототермического преобразования, выявлены методом спектроскопии поглощения света оптического диапазона длин волн. Экспериментальные спектры поглощения (рис. 2а) для трех различных концентраций композитных наночастиц Au/CFO_Zn имеют характерный пик локализованного поверхностного плазмонного резонанса на длине волны ~600 нм. Интенсивность пика уменьшается при снижении концентрации НЧ в суспензии. В сравнении с характеристическими спектрами поглощения для НЧ золота диаметром менее 20 нм наблюдаемый пик стал шире и сдвинулся в красную область спектра [20, 44, 45]. Подобное уширение и сдвиг пика могут быть объяснены изменением диэлектрической проницаемости среды, окружающей НЧ золота. Для проверки данного предположения было выполнено моделирование спектральных зависимостей сечения поглощения для частицы золота и частицы золота, окруженной ферромагнитными НЧ в водной среде (рис. 2б). Наличие ферромагнитных частиц в окружении частицы золота приводит к сильному изменению формы и интенсивности пика поглощения, а также сдвигает его в область красных длин волн, что согласуется с представленными экспериментальными данными. Сдвиг пика поглощения в область красных длин волн происходит за счет увеличения действительной части диэлектрической проницаемости вокруг частиц золота и согласуется с данными [5–10]. В то же время увеличение абсолютного значения мнимой части диэлектрической проницаемости приводит к уширению и уменьшению интенсивности пика локализованного плазмонного резонанса за счет добавления канала туннелирования электронов зон проводимости между золотыми и ферромагнитными НЧ [46].

Для фототермических эффектов важно как увеличение сечения поглощения, так и смещение локализованного плазмонного резонанса в красную область. Увеличение поглощения влияет на тепловыделение, в то время как смещение в красную область может использоваться для перемещения спектрального положения резонанса ближе к окнам биологической прозрачности. Полученные магнитные и оптические свойства делают нанокомпозит Au/CFO_Zn подходящим для фототермической терапии.

Биосовместимость Au/CFO_Zn. НЧ золота – ядра нанокомпозита – активно применяются в различных областях биомедицины [47]. Более того, НЧ золота были утверждены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в качестве агента для фототермической терапии [48].

Цитотоксичность CFO, замещенного цинком, была исследована на фибробластах [29]. Результаты показали снижение жизнеспособности клеток с увеличением концентрации НЧ. Существенно снизить цитотоксичность CFO помогает использование различных биосовместимых покрытий [49–52], поэтому от Au/CFO_Zn можно ожидать как цитотоксичного, так и нетоксичного эффекта. В [53] показано, что токсичность CFO зависит и от чувствительности клеток различных клеточных культур. Так, наиболее чувствительными к воздействию НЧ CFO оказались лейкоциты культуры TK6 [53].

Базовые исследования цитотоксичности различных материалов in vitro обычно проводятся на лейкоцитах и других иммуномодулирующих клеточных культурах, что связано с их естественной способностью к фагоцитозу [54]. В настоящей работе цитотоксичность нанокомпозита Au/CFO_Zn исследовали на двух различных типах культур лейкоцитов: Jurkat (лейкемия) и МНК (лейкоциты здоровых доноров). Нанокомпозиты Au/CFO_Zn в трех концентрациях (10, 50, 100 мкг/мл) инкубировали с клетками Jurkat в течение 2, 4, 8, 24 и 48 ч. Первичные результаты (рис. 3а) показали тенденцию к снижению жизнеспособности с увеличением концентрации Au/CFO_Zn. Статистически достоверный цитотоксический эффект был виден при воздействии 50 мкг/мл нанокомпозита Au/CFO_Zn на Jurkat при инкубации клеток в течение 8, 24 и 48 ч. Среди всех проведенных экспериментов с различным временем выдержки суспензии Au/CFO_Zn с клеточной культурой Jurkat эксперименты длительностью 24 ч дают наиболее статистически значимые результаты (p < 0.0021). Поэтому все последующие исследования проводили с этим временем выдержки.

Зависимости относительной жизнеспособности клеточных линий Jurkat и МНК от концентрации нанокомпозита представлены на рис. 3б и 3в соответственно. Жизнеспособность клеток лейкемии Jurkat снижается с увеличением концентрации нанокомпозита, причем концентрации 50 и 100 мкг/мл показывают статистически достоверные значения цитотоксичности в 88 и 84% соответственно. Однако при исследовании Au/CFO_Zn на клеточной культуре МНК (рис. 3в) результаты не показывают достоверного изменения жизнеспособности, что позволяет сделать вывод о том, что данный вид клеток менее чувствителен к воздействию нанокомпозита. Таким образом, можно предположить, что цитотоксичность Au/CFO_Zn будет усиливать эффект от фототермальной терапии на клетки Jurkat, в меньшей степени воздействуя на здоровые мононуклеарные клетки крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложен новый подход к изготовлению композитных НЧ золота, окруженных наночастицами CFO, легированного цинком. Синтезированный нанокомпозит Au/CFO_Zn характеризуется узким распределением частиц по размерам, а также структурной и морфологической стабильностью во времени, что было подтверждено комплексом исследований (ПЭМ, РСА, ЭДС). Магнитные свойства обусловлены суперпарамагнитным состоянием наночастиц CFO_Zn, а оптические – локализованным плазмонным резонансом НЧ золота. Au/CFO_Zn в концентрациях 50 и 100 мкг/мл показал значительное снижение пролиферативной активности клеток раковой культуры Jurkat. Предполагается, что цитотоксический эффект на раковые клетки усилится, не оказывая значительного влияния на здоровые моноциты крови, при комбинировании фототермической и других видов терапии на основе магнитных эффектов, таких как лечение адресно доставленными лекарственными средствами или магнитная гипертермия.

Авторы выражают благодарность Н.Д. Газатовой и Л.С. Литвиновой (БФУ им. И. Канта, Российская Федерация) за предоставленную донорскую кровь для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (Разрешение № 5 от 16 мая 2016 г.; Местный этический комитет, Инновационный парк, Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта), А.С. Омельянчику за консультативную поддержку и помощь в анализе полученных результатов, С.Е. Пшеничникову за помощь в проведении анализа на цитотоксичность, а также Д.В. Мурзину за помощь в анализе литературы и общей концептуализации статьи.

При финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 21-72-20158) выполнены моделирование и экспериментальные исследования оптических свойств; магнитные измерения; частичная характеризация образцов (рентгеноструктурный анализ); биологические исследования. Работа С. Йованович выполнена при финансовой поддержке Министерства высшего образования, науки и технологий Республики Словения (грант № P2-0091) и Словенского исследовательского агентства (грант № J2-8169) в части синтеза нанокомпозитов и характеризации образцов (получение ПЭМ-изображений).