Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 1, стр. 121-128

ВВЕДЕНИЕ

Антибиотики интенсивно применяют с середины XX века в медицине, сельском хозяйстве, пищевой индустрии. Длительное, чрезмерное и зачастую бесконтрольное использование этих препаратов, их накопление в почве и воде привело к появлению и развитию микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) [1]. Патогенные микроорганизмы выработали устойчивость практически ко всем известным видам антибиотиков, при этом за последние годы не было открыто принципиально новых классов противомикробных средств [2]. Появление микроорганизмов с МЛУ происходит за счет возникновения мутаций в хромосомной или плазмидной ДНК при действии на клетки антимикробного средства либо путем горизонтального переноса генов устойчивости. ВОЗ объявила устойчивость к противомикробным препаратам одной из “самых больших угроз глобальному здравоохранению” [3]. Таким образом, в мире существует запрос на создание новых типов противомикробных средств, устойчивость к которым развивалась бы с низкой эффективностью.

Развитие отрасли нанотехнологии, получение наноматериалов различного химического состава, возможность их применения в медицине дают основания для поиска антимикробных агентов нового поколения. В качестве альтернативы и дополнения традиционным антибиотикам исследуется биоцидная активность наночастиц (НЧ) металлов, их оксидов и сульфидов. Появился термин “наноантибиотики”, обозначающий материал наноразмерного ряда (от 1 до 100 нм), проявляющий биоцидную активность против патогенных микроорганизмов [4, 5], либо повышающий эффективность действия антибиотиков в составе НЧ [6].

Установлено, что НЧ воздействуют одновременно на различные процессы жизнедеятельности микроорганизмов, и для развития устойчивости к биоцидной активности НЧ в клетке должно произойти одновременно множество мутаций [7, 8]. Основным механизмом антимикробного действия наноматериалов является фотокаталитическое образование активных форм кислорода (АФК), которые повреждают клеточные структуры, в первую очередь бактериальную стенку/мембрану, далее происходит прерывание процесса передачи энергии, ингибирование активности ферментов и синтеза ДНК, что приводит к гибели клеток. Антимикробную активность нанокристаллов часто объясняют их адгезией к клеточной стенке, обусловленной разницей в электрических зарядах отрицательно заряженной мембраны и НЧ. Такое взаимодействие приводит к конформационным и морфологическим изменениям – усадке цитоплазмы, отслоению мембраны с нарушением проницаемости клеток. Оказавшись внутри клетки, НЧ негативно воздействуют на ферментативные процессы и ДНК с необратимым повреждением трансляции белка, что приводит к гибели клеток [9]. В [7] подробно рассмотрены механизмы антимикробного действия НЧ серебра, оксидов цинка и титана, типы повреждений, а также возможности их практического применения.

Среди НЧ металлов и их производных особую нишу занимают халькогениды металлов, в том числе наночастицы сульфида кадмия (NPsCdS) с характеристиками квантовых точек (КТ). Для этих полупроводниковых материалов характерны высокий квантовый выход, узкий и симметричный пик люминесценции, большая ширина запрещенной зоны, высокая фотостабильность, что обеспечивает применение этих соединений в различных областях промышленности. Подобные материалы предлагается использовать также в биомедицине. Действительно, НЧ халькогенидов металлов нашли применение in vivo для визуализации, мечения клеточных компонентов и белков, диагностики рака [10, 11]. Физико-химические методы получения НЧ сложны и энергозатратны, предполагают участие синтетических поверхностно-активных веществ (ПАВ) для стабилизации наноструктур, органических растворителей, агрессивных реагентов, действие которых может привести к образованию токсичных побочных продуктов, что нарушает экологическую безопасность. Показано, что NPsCdS с покрытием поверхности химическими ПАВ оказывают значительное цитотоксическое повреждение эукариотических и прокариотических организмов [12, 13].

Механизм биоцидного действия NPsCdS связывают с высвобождением ионов кадмия (Cd²⁺) из NPsCdS в клеточную среду и образованием АФК. Относительно механизма высвобождения Cd²⁺ из NPsCdS было постулировано, что атомы серы (S), расположенные на поверхности КТ NPsCdS, могут окисляться молекулами О₂ с образованием ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$, с последующей их десорбцией в раствор и генерацией свободных ионов Cd²⁺. Известно, что активаторами образования АФК являются ионы тяжелых металлов, в том числе Cd²⁺, которые также могут легко связываться с SH-группами белков, приводя к нарушению функции и конформационной структуры ферментов, что негативно сказывается на метаболизме и физиологии клетки, приводя ее к гибели [14, 15].

Важным направлением современных исследований по созданию НЧ различного химического состава является разработка экологически безопасного синтеза наноматериала с использованием биологических субстанций, в частности микроорганизмов. Природная способность микробов эффективно восстанавливать ионы металлов до нерастворимых соединений в наноразмере, большое разнообразие и доступность коллекций микроорганизмов делают их перспективными для биогенного синтеза НЧ [16–18]. Наличие на поверхности НЧ молекул белков, аминокислот, полисахаридов, выделяемых микроорганизмами в процессе биосинтеза, определяет стабильность, биосовместимость и биологическую активность наноматериала [19]. Адсорбированный слой биомолекул может снижать количество активных ионов на поверхности биогенных нанокристаллов, контактирующих с клеточной стенкой бактерий [5].

Сравнительный анализ токсического действия КТ сульфида кадмия (CdSQDs), полученных химическим и биогенным синтезом с применением микроскопического гриба Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici, в отношении бактерий Escherichia coli и ростков Lactuca sativa L. показал, что химические CdSQDs подавляли рост E. coli дозозависимым образом в отличие от биогенных CdSQDs, которые проявляли антибактериальную активность только при самой высокой концентрации. Биогенные КТ не ингибировали прорастание семян L. sativa L. в отличие от химических CdSQDs. Согласно [20] биологическое покрытие биогенных CdSQDs снижает их токсическое действие на бактерии и семена растений. Отметим, что важную роль в определении уровня антибактериальной и цитотоксической активности биогенного наноматериала играет выбор микроорганизмов, используемых для синтеза НЧ. Так, использование микроорганизмов Shewanella oneidensis [21] и Aspergillus niger [22] позволило синтезировать NPsCdS с антимикробной и цитотоксической активностями. Приводятся данные об антимикробном действии биогенных NPsCdS, в том числе в отношении МЛУ [9]. В исследованиях [23–25] показано влияние бактерий различных таксономических групп, использованных для биосинтеза NPsAg₂S, NPsZnS, NPsCdS, на их физико-химические характеристики.

Целью данной работы являлась оценка влияния S. oneidensis MR-1 и Bacillus subtilis 168, использованных  для  микробного   синтеза NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus, на уровень биоцидной активности биогенных НЧ в отношении бактерий, микроскопических грибов – дрожжей и плесневых грибов. Исследование количественного соотношения компонентов NPsCdS – содержания элементов Cd, S и белковой фракции в составе образцов NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus, уравненных по массе, для определения роли S. oneidensis MR-1 и B. subtilis 168 в формировании структуры NPsCdS–белок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Микробный синтез НЧ с использованием бактерий разных видов (S. oneidensis MR-1 и B. subtilis 168) позволяет получать NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus с характеристиками нанокристаллов сферической формы размерами 5 ± 1 нм. Однако физико-химические и оптические характеристики – гидродинамический диаметр, величина ζ-потенциала, интенсивность флуоресценции, а также состав белкового слоя на поверхности биогенных NPsCdS – зависят от применяемого для биосинтеза штамма [25].

Способность НЧ проявлять биоцидную активность в отношении тест-культур микроорганизмов является одной из функциональных характеристик наноматериала. Для определения уровня биоцидной активности NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus была оценена величина МИК наночастиц обоих типов. Методы определения МИК противомикробных веществ, как антибиотиков, так и НЧ, основаны на подавлении ими роста клеток тест-культур в жидкой среде со снижением КОЕ или при диффузии в агаризованную среду с образованием зон ингибирования. Значения МИК в жидкой и агаризованной средах могут различаться в связи с разной степенью диффузии биоцидного агента в жидкую и агаризованную среды и контакта с клетками [29, 30].

Определение   МИК   NPsCdS/Shewanella   и NPsCdS/Bacillus в жидкой среде. В качестве тест-культуры использовали грам(+) бактерию B. licheniformis. Титр клеток B. licheniformis после 24 ч инкубации в отсутствие NPsCdS составлял (2‒3) × 10⁹ кл/мл. Показано, что рост бактерии не ингибируется в реакционных образцах при концентрациях NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus, составляющих 2, 3, 4 и 10 мкг/мл. Установлено, что МИК для NPsCdS/Bacillus составляет 20 мкг/мл, при этом КОЕ = (7–8) × 10⁸ кл/мл, а для NPsCdS/Shewanella – 30 мкг/мл, КОЕ = (7.7–8.5) × 10⁸ кл/мл. При концентрации 40 мкг/мл титр клеток снижается примерно на 1.5 порядка для обоих типов NPsCdS. Таким образом, значения МИК NPsCdS, при которых подавляется рост клеток B. licheniformis, различаются для NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus, что подтверждает влияние штаммов, использованных для биосинтеза, на функциональную активность НЧ.

Эффективность   биоцидной   активности NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus в агаризованной среде. Сравнительный анализ антимикробной активности NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus был проведен в отношении широкого круга микроорганизмов, принадлежащих различным таксонам, методом диффузии наночастиц в LBA-среде, содержащей клетки тест-культур. Как видно из представленных в табл. 1 результатов, для всех исследуемых и чувствительных к действию наноматериала тест-культур уровень антимикробной активности NPsCdS/Bacillus оказался выше по сравнению с NPsCdS/Shewanella на 25–35% в зависимости от штамма. Это доказывает влияние биологической субстанции, в данном случае штаммов B. subtilis и S. oneidensis, на уровень функциональной биоцидной активности синтезированных НЧ. В [31] на примере NPsAg, полученных в присутствии трех микроорганизмов из разных таксонов, также было продемонстрировано различие в уровне антимикробной активности в отношении грам(+) и грам(–) бактерий, что подтверждает эффект влияния штаммов, использованных для получения наноматериала, на уровень ингибирующего воздействия.

Антимикробная активность NPsCdS установлена для большинства исследуемых штаммов, однако их восприимчивость к действию наноматериала варьирует (рис. 1, табл. 1). Среди бактериальных тест-культур наиболее чувствительными к действию НЧ обоих типов оказалась группа грам(+) бактерий с максимумами зон ингибирования, зафиксированными для B. licheniformis и S. salivarius. Из представителей грам(–) бактерий только P. putida оказалась чувствительной к NPsCdS. Разница в восприимчивости бактерий различных таксономических групп к действию НЧ может находить объяснение в структуре клеточной стенки микроорганизмов, определяющей проницаемость. Так, во внешней мембране грам(–) бактерий присутствует слой липополисахаридов, препятствующий проникновению различных макромолекул и других гидрофильных молекул. Напротив, клетки грам(+) бактерии имеют в составе многослойный пептидогликан и отрицательно заряженные глицериновые цепочки (тейхоевая кислота), притягивающие катионы металлов из раствора. Это приводит к накоплению и повышенному поглощению катионов, которые затем вызывают внутриклеточное повреждение [5, 22].

Рис. 1.

Антимикробная активность на примере тест-культур грам(+) бактерий и плесневых грибов: 1 – NPsCdS/Shewanella, 2 – NPsCdS/Bacillus, К – стерильная вода.

В ряде случаев устойчивость микроорганизмов к действию НЧ может определяться средой их обитания. Так, металловосстанавливающий штамм S. oneidensis MR-1 может существовать в условиях высокой концентрации солей металлов [18] и его устойчивость к действию NPsCdS продемонстрирована в проведенном исследовании. Показано, что для Candida sp. характерна природная устойчивость к катионам тяжелых металлов [32]. В настоящей работе штамм C. albicans показал высокий уровень устойчивости к действию NPsCdS. На примере этого штамма показательны различие антимикробного эффекта NPsCdS/Bacillus (зона ингибирования 14 ± 1 мм) и отсутствие подавления роста при NPsCdS/Shewanella, что еще раз подтверждает важность биологической субстанции для получения наноматериала с различными характеристиками. При этом для NPsCdS наблюдается высокая активность в отношении дрожжей S. cerevisiae, что демонстрирует селективность ингибирования NPsCdS/Bacillus и NPsCdS/Shewanella определенных видов микроорганизмов. Полученные результаты могут лечь в основу применения биогенных NPsCdS в качестве противомикробных агентов направленного действия.

Значительный интерес представляет изучение действия НЧ на представителей микроскопических грибов (плесеней), вызывающих заболевания сельскохозяйственных культур и устойчивых к действию антибактериальных антибиотиков (рис. 1). Для исследования были выбраны штаммы: A. niger, вызывающий заболевания хлопчатника; C. cucumerinum – патоген, поражающий представителей семейства тыквенных; F. graminearum – возбудитель фузариозной гнили злаковых культур, кукурузы, плесени семян. Отметим, что для оценки фунгицидной активности НЧ была использована питательная среда с увеличенным содержанием агара (1.5%), что связано с отсутствием роста культур грибов на среде с содержанием агара 0.8%, применяемой для тест-культур бактерий и дрожжей. Концентрация NPsCdS была увеличена до 8.0 мг/мл, поскольку диаметр зон ингибирования тест-культур грибов на среде с большим содержанием агара может быть уменьшен из-за снижения процесса диффузии НЧ в  слой  агара. В эксперименте использовали NPsCdS/Bacillus как более активные по антимикробным свойствам в отношении бактериальных штаммов (табл. 1). Показано, что все исследуемые виды плесневых грибов чувствительны к действию NPsCdS/Bacillus, среди которых наиболее восприимчивыми являются A. niger и C. сucumerinum. Полученные результаты свидетельствуют о возможности апробации биогенных NPsCdS в качестве функционального наноматериала фунгицидного действия.

Определение элементного содержания кадмия и серы в образцах NPsCdS. Одной из задач работы являлось определение количественного содержания элементов Cd и S в составе NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus, концентрация которых по массе была одинаковой, 3.1 мг/мл. Установлено, что суспензия NPsCdS/Bacillus содержит 0.14% Cd и 0.041% S (или 1.4 мг/мл Cd и 0.41 мг/мл S) против 0.10% Cd и 0.023% S (1.0 мг/мл Cd и 0.23 мг/мл S) для NPsCdS/Shewanella. Таким образом, доля Cd в образцах NPsCdS/Bacillus превышает в 1.4 раза данный показатель для NPsCdS/Shewanella, при этом доля S в образце NPsCdS/Bacillus также увеличена.

Методом денситометрического анализа электрофореграмм было установлено различие в долевом содержании белка в образцах NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus, составившее 1.05 и 0.15 мг/мл соответственно. В перерасчете на 1 мг НЧ установлено, что образцы NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus содержат 0.34 и 0.05 мг белка соответственно. Таким образом, содержание белка в образце NPsCdS/Shewanella составляет ~34% от общей массы НЧ и ~5% для NPsCdS/Bacillus. Это свидетельствует о снижении доли белка и увеличении содержания Cd в составе образца NPsCdS/Bacillus.

Различие в количественном соотношении компонентов NPsCdS – доли неорганического ядра CdS и белковой фракции – может быть причиной разного уровня антимикробной активности NPsCdS/Bacillus и NPsCdS/Shewanella. Так, увеличение содержания Cd у NPsCdS/Bacillus может привести к повышению концентрации Cd²⁺ и образованию АФК, что в свою очередь увеличивает уровень биоцидной активности NPsCdS/Bacillus. Такой вывод согласуется с другими данными о зависимости токсичности НЧ от их концентрации: чем больше концентрация НЧ, тем больше ионов высвобождается, что приводит к снижению жизнеспособности микроорганизмов [20, 30–32].

Определение роли долевого соотношения компонентов биогенных NPsCdS и связь этого параметра с уровнем их биоцидной активности имеет приоритетное значение для создания биогенного наноматериала с необходимыми свойствами. Полученные результаты экспериментов свидетельствуют о возможности применения биогенных NPsCdS в качестве самостоятельных биоцидных агентов нового поколения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биогенные NPsCdS получены микробным синтезом по оптимизированной методике с использованием бактерий S. oneidensis MR-1 и B. subtilis 168. Проведена оценка влияния бактериальных штаммов на уровень биоцидной активности NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus как функциональной характеристики наноматериала в отношении грам(+), грам(–) бактерий, микроскопических грибов (дрожжей) и плесневых грибов. Показано существенное различие по величине минимальной ингибирующей концентрации NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus для тест-культуры B. licheniformis. Установлено, что уровень биоцидной активности NPsCdS/Bacillus по сравнению с NPsCdS/Shewanella выше на 25–35% для всех чувствительных к действию наноматериала тест-культур. Выявлена вариабельность ингибирования роста штаммов микроорганизмов наночастицами в зависимости от их таксономической принадлежности. Грам(+) бактерии и представители микроскопических плесневых грибов наиболее чувствительны к действию NPsCdS. Методами АЭС и денситометрического анализа электрофореграмм белка было продемонстрировано значительное различие в количественном соотношении доли неорганического ядра CdS и белковой фракции для NPsCdS/Shewanella и NPsCdS/Bacillus. Установлено, что в составе NPsCdS/Bacillus увеличено содержание Cd со снижением доли белка. Следствием этого может быть повышение концентрации Cd²⁺, что приводит к более высокому уровню биоцидной активности NPsCdS/Bacillus. Доказаны важность и необходимость отбора бактериальных штаммов для создания функционально активных НЧ с необходимыми свойствами. Результаты работы подтверждают перспективность исследования биогенных NPsCdS в качестве антимикробных агентов нового поколения.

Авторы выражают благодарность Национальному биоресурсному центру – Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ “Курчатовский институт” за предоставление штаммов микроорганизмов. Аналитические исследования, атомно-эмиссионная спектроскопия выполнены с использованием научного оборудования ЦКП НИЦ “Курчатовский институт” – ИРЕА при финансовой поддержке проекта Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, соглашение № 075-15-2022-1157 от 16.08.2022.

Исследование выполнено в рамках государственного задания НИЦ “Курчатовский институт” № АААА-А20-120093090016-9.