Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 6, стр. 793-800

ВВЕДЕНИЕ

В течение многих десятилетий наночастицы благодаря своим уникальным размер-зависимым свойствам получают все большее распространение в различных областях науки и техники, в частности наиболее интенсивно в биологии и медицине, в том числе в сельском хозяйстве [1–3]. Одними из наиболее изученных нанообъектов являются наночастицы золота (Au⁰НЧ) и гибридные органо-неорганические нанокомпозиты на их основе. Au⁰НЧ обладают выраженной антимикробной [4], антималярийной [5], иммуномодулирующей [6] активностью, используются в терапии злокачественных новообразований [7], а также в качестве адъювантов [8] и доставщиков антигенов [9]. Возможные области практического использования Au⁰НЧ постоянно расширяются, что обусловливает необходимость детализированного исследования потенциальных механизмов их влияния на организм. Известно, что в случае попадания наночастиц в кровообращение они неизбежно взаимодействуют с клетками крови, белками и эндотелиальными клетками, а также ключевыми компонентами свертывающей системы крови, такими как тромбоциты и плазменные факторы свертывания, определяя коагуляционно-опосредованную токсичность [10]. Однако каких-либо однозначных выводов о влиянии Au⁰НЧ на систему свертывания крови в настоящее время нет. Согласно [11] цитрат-стабилизированные Au⁰НЧ размером 60 нм не усиливали агонист-индуцированную активацию тромбоцитов. Тогда как другие исследования показали, что Au⁰НЧ-усиленная активация тромбоцитов является размер-зависимой, в частности небольшие наночастицы (в сочетании с индукторами коагуляции) вызывали более жесткую активацию тромбоцитов по сравнению с наночастицами больших размеров [12, 13].

Вследствие того что Au⁰НЧ являются одними из наиболее изученных нанообъектов и обладают комплексом выраженных биологических свойств, обусловливающих перспективность их применения в биомедицинских приложениях, вопрос их токсичности остается открытым и требует детального изучения на примере конкретных биологических тест-систем. Поскольку биологическая активность Au⁰НЧ (в том числе токсичность) определяется их размером, формой, лигандным окружением и способом получения, весьма перспективным является использование для синтеза наночастиц природных нетоксичных соединений (растительные экстракты [14], полисахариды [15]), выполняющих одновременно функции восстановителя и стабилизатора Au⁰НЧ. В частности, в [16] получены и охарактеризованы нанокомпозиты золота на основе κ-каррагинана (κ‑КГ) – природного сульфатированного полисахарида красных морских водорослей. При этом полученные нанокомпозиты характеризуются как свойствами стабилизирующей полисахаридной матрицы (водорастворимость, гелеобразующие свойства, биологическая активность), так и физико-химическими свойствами Au⁰НЧ.

В настоящей работе представлены результаты синтеза и исследования влияния на свертывающую систему крови агрегативно устойчивого водорастворимого Au⁰НЧ-содержащего нанокомпозита, представляющего собой κ-КГ-стабилизированные Au⁰НЧ со средним размером 10.4 нм.

МЕТОДЫ

Материалы. В работе использовали κ-каррагинан марки WR-78 CP Celko, Дания. Элементный анализ, %: C – 34.7, H – 5.9, S – 6.9, Na – 0.96, K – 6.3. Этанол (Реахим), HAuCl₄ (Sigma-Aldrich), NaOH (Реахим) были использованы без дополнительной очистки.

Методы исследования. Микрофотографии Au⁰НЧ в полисахаридной матрице κ-КГ получали на просвечивающем электронном микроскопе “Leo 906 Е” с использованием медных сеток с формваровым слоем в качестве подложки. Подготовку пробы анализируемого композита осуществляли в соответствии с описанной в [17] методикой. Измерение размера частиц выполняли в ручном режиме с использованием программы IPWin45. Статистически-значимая выборка наночастиц и надежность их полученного итогового размерного распределения обеспечивалась обработкой не менее 7–10 микрофотографий разных полей анализируемой подложки для получения данных о размере 900–1000 частиц.

Элементный состав нанокомпозита получен на сканирующем электронном микроскопе Hitachi ТМ 3000, оснащенном с X-ray детектором SDD XFlash 430-4, посредством рентгеновского энергодисперсионного микроанализа и на CHNS-анализаторе Flash 2000 фирмы Thermo Scientific.

Молекулярно-массовые характеристики деполимеризованного κ-КГ-ДП (используемого для синтеза нанокомпозита) и κ-каррагинана в составе синтезированного нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Agilent 1100/1260 с использованием колонок Ultrahydrogel Linear (Waters, США). В качестве элюента использовали водный 0.1 н раствор нитрата натрия. Детекторами служили дифференциальный рефрактометр (RID10A, Shimadzu), установка многоуглового рассеяния света (Mini DAWN TriStar, Wyatt Technology Corporation, США) и спектрофотометрический детектор. Для калибровки колонки в качестве полимерных стандартов использовали узкодисперсные полиэтиленоксиды и пуллуланы PSS (Германия). Обработка результатов ВЭЖХ-анализа проведена с помощью компьютерной программы Astra. Детальное описание методики пробоподготовки образцов полисахарида и нанокомпозита на его основе, а также алгоритм проведения исследования и обработки результатов представлены в [18].

Гидродинамические радиусы (Rh) κ-КГ-ДП и его нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au) определяли методом динамического рассеяния света (ДРС) на корреляционном спектрометре Photocor Compасt-Z (источник света – термостабилизированный полупроводниковый лазер мощностью 20 мВт с длиной волны λ = 638 нм) под углом 90°. Анализ корреляционной функции осуществляли с помощью программы обработки данных ДРС Dynals. Растворы для анализа готовили растворением при комнатной температуре в течение семи часов 5 мг образца в 5 мл дистиллированной воды, предварительно отфильтрованной через шприцевой фильтр. Время каждого измерения составляло не менее 200 с. Измерение проводили в трехкратной повторности.

Электрофоретическую подвижность наночастиц также измеряли на спектрометре Photocor Compасt-Z с использованием протокола PALS (Phase analysis light scattering). Преобразование полученного значения электрофоретической подвижности μE = ν/E в ζ-потенциал было проведено по уравнению Смолуховского μE = εεoζ/ηs, где ε и εo – диэлектрическая проницаемость растворителя и вакуума соответственно. Каждое измерение проводили в трехкратной повторности, результаты усредняли.

ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре (RAM II) Bruker Vertex 70 в таблетках KBr в диапазоне 4000–400 см^–1. Спектры ЯМР ¹³С в D₂O (концентрация составляла 2%) с добавлением CuAc в качестве релаксанта были измерены на “Bruker DPX-400”, работающем на частоте 100.13 МГц при 27°C. Химические сдвиги всех атомов углерода приведены относительно внутреннего стандарта DSS (d = 0.000 ppm).

ИК-спектр κ-КГ-ДП (см^–1): 3449 (ν O–H), 2963, 2823 (ν C–H), 1640, (ν O–H), 1255, 1381 (сложноэфирная сульфатная группа), 934 (3,6-ангидрогалактоза – DA), 847 (галактоза-4-сульфат – G4S).

¹³C ЯМР κ-КГ-ДП (δ ppm): 104.7 (С-1 G4S), 97.0 (С-1 DA), 71.7 (С-2 G4S), 80.7 (С-3 G4S), 81.5 (С-3 DA), 76.0 (С-4 G4S), 80.6 (С-4 DA), 77.0 (С-5 G4S), 78.9 (С-5 DA), 63.5 (С-6 G4S).

Спектры оптического поглощения 0.1%-ного водного раствора нанокомпозита регистрировали на спектрофотометре Perkin Elmer Lambda 35 относительно дистиллированной воды в кварцевой кювете объемом 1 см³ в интервале длин волн 190–1000 нм.

Методика щелочной деполимеризации κ-КГ. Щелочную деполимеризацию κ-КГ осуществляли согласно протоколу, подробно представленному в [19], с незначительными изменениями. Кратко: к 170 мл 2.8%-ного водного раствора κ-КГ приливали 75 мл 1 N водного раствора NaOH. Смесь нагревали на водяной бане при температуре 85–90°С в течение 180 мин при интенсивном перемешивании на верхнеприводном перемешивающем устройстве ЭКРОС-8300 (Россия). По истечении указанного времени в реакционную смесь добавили 1 М водный раствор HCl до рН 6.0–7.0 с последующим высаживанием реакционной смеси в четырехкратный избыток EtOH. Полученный осадок отфильтровывали, промывали этанолом и высушивали на воздухе. Выход деполимеризованного полисахарида (κ-КГ-ДП) составил 84%. Элементный анализ, %: C – 33.1, H – 6.1, S – 6.8, Na – 3.36, K – 3.6.

Методика синтеза нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au⁰). Синтез нанокомпозита осуществляли согласно протоколу, подробно описанному в [16], с незначительными изменениями. Кратко: к 50 мл 1.7%-ного водного раствора κ‑КГ-ДП при температуре 35°С и интенсивном перемешивании добавили 5 мл водного раствора, содержащего 1.36 ммоль HAuCl₄. Смесь выдержали при температуре 35°С в течение 30 мин, после чего увеличили pH среды до 10.42 добавлением 1 N водного раствора NaOH и последующим повышением температуры реакционной среды до 70°C на водяной бане. Время синтеза – 25 мин. Выделение целевого нанокомпозита и очистку его от примесей проводили путем осаждения реакционной среды в четырехкратный избыток EtOH и многократной промывки сформировавшегося осадка фиолетового цвета этанолом с последующей сушкой на воздухе при комнатной температуре. Количественное содержание золота в полученном образце 2.9%. Элементный анализ, %: C – 32.6, H – 5.8, Au – 2.9, S – 6.3, Na – 3.0, K – 3.1.

Определение антикоагулянтной активности. Антикоагулянтную активность исходного κ-КГ, его деполимеризованного производного κ-КГ-ДП и нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au⁰) исследовали in vitro по стандартным методикам определения коагуляционных показателей: АПТВ (активированное парциальное тромбопластиновое время) и ТВ (тромбиновое время) с использованием донорской крови человека. Для определения АПТВ смешивали раствор цитратной плазмы с тестируемыми образцами потенциальных антикоагулянтов с концентрацией 0.013, 0.025, 0.032% и выдерживали в течение 3 мин при 37°С. Далее добавляли 0.1 мл АПТВ – реагента, нагретого до 37°С, и инкубировали полученную смесь в течение 5 мин при 37°С. После этого добавляли 0.1 мл CaCl₂ (0.025 моль/л) и фиксировали время свертывания. Для анализа TВ цитратную нормальную плазму смешивали с растворами тестируемых образцов потенциальных антикоагулянтов и выдерживали в течение 3 мин при 37°С, после чего добавляли экзогенный тромбин и фиксировали время свертывания. Эксперимент выполнен в 15 повторностях.

ОБСУЖДЕНИЕ

κ-КГ представляет собой водорастворимый сульфатированный полисахарид, макромолекулы которого состоят из регулярно чередующихся остатков 3-О-замещенной β-D-галактопиранозы с заместителем в виде сульфогруппы в положении 4 и 4-О-замещенной 3,6-ангидро-α-D-галактопиранозы. Степень сульфатирования при этом составляет ~6%, что соответствует приблизительно наличию одной сульфогруппы на дисахаридное звено макромолекулы κ-КГ [16] (рис. 1).

Рис. 1.

¹³С-ЯМР-спектр (а) и ИК-спектр (б) полисахарида κ-КГ-ДП.

В целях увеличения водорастворимости посредством оптимизации молекулярно-массовых характеристик исходного κ-КГ в [18] была проведена его частичная щелочная деполимеризация, в результате которой получены образцы деполимеризованного каррагинана (κ-КГ-ДП) с M_w 1010 кДа, M_n 565 кДа, довольно широким молекулярно-массовым распределением и полидисперсностью 1.79, используемые в дальнейшем для синтеза нанокомпозита. Синтез Au⁰-содержащего нанокомпозита осуществляли в водной среде в соответствии с разработанной ранее методикой, в основе которой лежит использование природных полисахаридов (арабиногалактана, галактоманнана и κ-КГ) одновременно в качестве как восстановителя ионов металла (в частности Au⁺³) до нуль-валентного состояния, так и стабилизатора формирующихся наночастиц [20]. Сам синтез при этом запускается сдвигом рН реакционной среды в щелочную область с параллельным нагревом до 70°С реакционной среды. Полисахарид в нанокомпозите Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП вследствие деструкционных процессов имеет молекулярную массу М_w 129 кДа и M_n 96 кДа и становится более узкодисперсным (1.35), чем взятый для синтеза исходный κ-КГ-ДП. Следует предположить, что κ-каррагинан достаточно легко подвергается деструкционному процессу щелочной деполимеризации вследствие наличия β-(1→4)-гликозидных связей и регулярного линейного строения [20]. При этом необходимость избытка гидроксид-анионов в реакционной среде для запуска синтеза нанокомпозита, вероятно, обусловлена их непосредственным участием в генерации дополнительных восстанавливающих фрагментов в результате параллельного протекания в реакционной среде при повышенной температуре реакции щелочного пилинга полисахарида с образованием молекул восстанавливающих моносахаров. Кроме того, весьма вероятно, что гидроксид-анионы участвуют в связывании протонов, выделяющихся в результате окислительно-восстановительной реакции [16, 20, 21]. Результатом данного одностадийного синтеза является получение нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП, представляющего собой наночастицы нуль-валентного золота (в количестве 2.9% от массы всего композита), стабилизированные полисахаридной матрицей κ-КГ-ДП.

Согласно данным просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) нанокомпозит Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП формируется в виде распределенных в полисахаридной матрице κ-КГ-ДП-частиц с формой, приближенной к сферической (рис. 2а). Размер наночастиц при этом варьирует в интервале 6–20 нм (рис. 2б) со средним значением 10.4 нм. Приближенность формы наночастиц к сферической, вероятно, обусловлена стремлением к самопроизвольному снижению поверхностной энергии формирующихся частиц и отсутствием в реакционной среде условий для их анизотропного роста [22, 23].

Рис. 2.

Микрофотография (а) и распределение дисперсности наночастиц в композите Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au) (б). Спектр поглощения 0.1%-ного водного раствора нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au) (в). На вставке представлена спектральная зависимость его коэффициента поглощения в координатах Tauc.

Спектр поглощения 0.1%-ного водного раствора полученного нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП характеризуется наличием одного интенсивного максимума плазмонного поглощения в области 540 нм, обусловленного коллективными колебаниями электронов проводимости наночастиц золота, свидетельствуя о сферической форме и нуль-валентном характере присутствующих в составе нанокомпозита частиц золота (рис. 2в).

Исследование водного раствора κ-КГ-ДП методом ДРС позволило установить, что этот коллоид в распределении интенсивности рассеяния характеризуется наличием одной фракции достаточно крупных (Rh 56-112 нм) частиц (рис. 3а). При этом переход к числовому распределению Rh частиц сопровождается сохранением мономодального характера распределения Rh в образце κ-КГ-ДП. Известно, что насыщенность макромолекул полисахаридов (в том числе, κ-КГ) гидроксильными группами способствует вовлечению их в образование водородных связей, а также их участию в ван-дер-ваальсовых взаимодействиях даже в хороших растворителях, что неизбежно приводит к образованию прочных ассоциатов и метастабильных агрегатов [24]. В данном случае присутствие в водном растворе κ-КГ-ДП достаточно крупных частиц со средним значением Rh 70 нм, вероятно, обусловлено агрегационными процессами между его макромолекулами в растворе [25]. Отметим, что характер распределения Rh частиц в полученном нанокомпозите Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au) кардинальным образом отличается от исходного κ-КГ-ДП, свидетельствуя о преобразовании макромолекул каррагинана в процессе синтеза нанокомпозита. Так, исследование водных растворов полученного нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au) методом ДРС позволило установить, что этот коллоид в распределении интенсивности рассеяния частиц характеризуется наличием трех фракций (рис. 3б).

Рис. 3.

Распределение значений интенсивности и числовое распределение Rh частиц в образцах исходного полисахарида κ-КГ-ДП (а) и нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au) (б).

Предположительно, первая быстрая фракция частиц с Rh 4.3–5.4 нм соответствует либо индивидуальным наночастицам золота небольшого размера (6 нм согласно ПЭМ), стабилизированным слоем макромолекул κ-КГ-ДП, либо индивидуальным макромолекулам κ-каррагинана. Однако отсутствие быстрой фракции частиц с данным диапазоном Rh в распределении, полученном от исходного полисахарида κ-КГ-ДП, не позволяет в полной мере утверждать о принадлежности быстрой фракции частиц, выделенной в образце нанокомпозита, исключительно макромолекулам полисахарида. Фракция частиц со значением Rh 44–89 нм, в свою очередь, может соответствовать либо более крупным наночастицам золота (8–20 нм по данным ПЭМ в режиме темного поля), стабилизированным несколькими слоями полисахарида, либо небольшим ассоциатам полисахарид-стабилизированных наночастиц Au⁰ быстрой фракции. Медленная фракция частиц, Rh которых варьирует в интервале 280–811 нм, вероятно, соответствует присутствующим в растворе нанокомпозита агрегатам наночастиц, образовавшимся в водном растворе композита, вследствие активного вовлечения функциональных групп κ-КГ в образование водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий как между “свободными” (не участвующими в стабилизации поверхности наночастиц) макромолекулами κ-каррагинана, так и макромолекулами на поверхности наночастиц.

Переход к числовому распределению Rh частиц идентифицируется присутствием только одной фракции мелких (Rh 3.4–5.4 нм) частиц, преобладающих в растворе. Отсутствие двух других фракций частиц, предположительно соответствующих κ-КГ-ДП-стабилизированным агломератам или скоплениям Au⁰НЧ, может быть обусловлено их небольшим количеством в объеме анализируемого образца [26].

ζ-потенциал водного раствора нанокомпозита исходного κ-КГ-ДП является достаточно высоким – 36.7 мВ, вероятно, вследствие его полианионной природы. Тогда как введение в его состав наночастиц Au⁰ с формированием нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП (2.9% Au) сопровождается увеличением ζ-потенциала до –48.7 мВ вследствие ионизации поверхности твердой фазы Au⁰ в водном растворе и формирования двойного электрического слоя на поверхности частиц, предотвращающего тем самым их агрегацию [27].

Влияние золотосодержащего нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП, а также κ-КГ и κ-КГ-ДП (для сравнения) на свертывающую систему крови исследовали измерением АПТВ и тромбинового времени, которые являются стандартизированными коагуляционными пробами, чувствительными к различным плазменным дефектам свертывания, особенно к дефициту XII, XI, IX, VIII факторов [28]. Определение АПТВ позволяет оценить общую сохранность функций факторов свертывания, выявить дефицит или нарушение функций некоторых факторов свертывания и контактных факторов внутреннего (VIII, IX, XI, XII, прекалликреина, высокомолекулярных кининогенов) и общего пути свертывания (включая факторы II, V, X и I) [29, 30]. Тогда как ТВ позволяет определить продолжительность превращения фибриногена в фибрин в цитратной плазме крови после добавления в нее экзогенного тромбина и кальция [31]. Скорость образования фибринового сгустка зависит главным образом от количества и функциональной полноценности фибриногена и присутствия в крови антикоагулянтов [32]. Увеличение значения АПТВ обусловлено торможением внутреннего пути свертывания цитратной бедной тромбоцитами плазмы, в то время как увеличение значения ТВ указывает на ингибирование активации фибриногена экзогенным тромбином. Для потенциального антикоагулянта необходимым является удлинение времени свертывания (АПТВ) в 2–2.5 раза по сравнению с контролем (в отсутствие антикоагулянта время свертывания – 28–34 с), а время образования сгустка (ТВ) под влиянием антикоагулянта должно вырасти в 4–5 раз при контрольных значениях 16–20 с [33, 34].

Согласно полученным данным все исследуемые образцы Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП, κ-КГ и κ-КГ-ДП увеличивают значения АПТВ и ТВ, проявляя выраженное концентрационно-зависимое антикоагулянтное действие (рис. 4).

Рис. 4.

Диаграмма зависимости АПТВ (а) и ТВ (б) от концентрации нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП, κ‑КГ и κ-КГ-ДП.

Выраженное изменение величин АПТВ и ТВ под действием κ-КГ, κ-КГ-ДП и Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП, предположительно, свидетельствует об их влиянии как на внутренний, так и на внешний путь свертывания крови. Исследование концентрационной зависимости антикоагулянтной активности κ-КГ и κ-КГ-ДП и Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП позволило определить адекватную концентрацию данных объектов, равную 0.025%, так как именно при этой концентрации наблюдались значения АПТВ и ТВ в диапазоне 65–84 и 68–78 с соответственно. В растворах с концентрацией 0.032% величины АПТВ и ТВ варьировали в интервале 80–118 и 68–113 с соответственно, т.е. время свертывания было удлинено более чем 2.5 и 5 раз, требуемого для потенциального антикоагулянта. При наименьшей концентрации растворов, равной 0.013%, удлинение величин АПТВ и ТВ оказалось меньше требуемого значения (рис. 3).

Известно, что антикоагулянтная активность полианионных сульфатированных полисахаридов во многом зависит от наличия и количества сульфатных групп в их составе, которые могут связываться с аминокислотными остатками гепаринсвязывающих протеинов. Также известно, что антикоагулянтная активность сульфатированных галактанов зависит от их структуры, в том числе от молекулярной массы, так как механизм их антикоагулянтного действия включает в себя стадию образования комплекса “ингибитор–тромбин”, при этом галактан выступает в качестве связующего компонента данного комплекса. Неизменность исходного количества отрицательно заряженных сульфоэфирных групп в составе и строении молекул κ-КГ-ДП и нанокомпозита Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП по сравнению с κ-КГ определяет сохранение их антикоагулянтной активности. Тогда как имеющееся отличие величин молекулярной массы данных объектов, вероятно, носит несущественный характер и не обусловливает каких либо заметных изменений антикоагулянтной активности. Введение Au⁰НЧ в полисахаридную матрицу κ-КГ-ДП в количестве 2.9% не приводит к изменению его антикоагулянтной активности, что указывает на преимущественно полисахарид-опосредованность данного вида активности и безопасность его использования для синтеза наноматериалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, с использованием восстанавливающего и стабилизирующего потенциала природного сульфатированного полисахарида κ-каррагинана получена биологически активная наноструктурированная биополимерная система “Au⁰НЧ/полисахарид”. С использованием комплекса современных методов исследования охарактеризованы состав полученного нанокомпозита и его наноморфологические характеристики (размерное распределение, средний размер, форма наночастиц, тип распределения). Впервые установлено, что нанокомпозит Au⁰НЧ/κ-КГ-ДП проявляет выраженную антикоагулянтную активность, влияя на внутренний и внешний путь свертывания крови на уровне полисахаридной матрицы каррагинана без каких-либо эффектов Au⁰НЧ. Продемонстрировано, что перевод золота в нанодисперсное состояние и стабилизация его κ-каррагинаном приводят к расширению диапазона его биологической активности, что обусловливает перспективность применения наноматериалов на его основе в биомедицинских приложениях.

В экспериментах использовали материалы и оборудование БАЦКП Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН. Микрофотографии образца получены на оборудовании ЦКП “Ультрамикроанализ” Лимнологического института СО РАН.