Российские нанотехнологии, 2024, T. 19, № 2, стр. 238-245

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы значительно возрос интерес к изучению металлоорганических соединений и образуемых ими надмолекулярных структур [1–6], что в первую очередь связано с широкими возможностями их применения в индустрии и биомедицине. Среди технологических применений таких материалов можно перечислить нелинейные оптические устройства, светоизлучающие диоды, электрохимические датчики, молекулярные магниты, тонкопленочные транзисторы, жидкие кристаллы и т.д. Металлсодержащие полимеры могут применяться в качестве средств доставки лекарств, биосенсоров, для биовизуализации, для создания металлсодержащих полимерных препаратов и биоцидов, в том числе противомикробных и противовирусных средств, противораковых препаратов, средств фотодинамической и лучевой терапии [4, 7]. Особый интерес представляют макромолекулы с возможностью варьирования количества и типа ионов металлов по всей длине полимерной цепи.

В настоящее время возможно получать довольно широкий спектр металлсодержащих полимеров с хорошо контролируемой молярной массой и узкой дисперсностью. Существует целый набор методов синтеза полимеров, имеющих металлсодержащие группы как в основной, так и в боковой цепи. Боковые цепи при этом могут состоять из металлоценовых звеньев или содержать координационный комплекс, образованный хелатирующими единицами. Этот набор методов включает в себя стратегии живой и контролируемой полимеризации, а также методы поверхностной иммобилизации [8].

Отметим, что синтез полимеров, содержащих ферроцен (Fc) в основной цепи, представляет собой довольно непростую задачу. Это связано с необходимостью создания дифункционализированной Fc-группы на стадии синтеза мономера [9]. Наиболее успешные результаты в этой области достигаются при синтезе олигомеров [10].

В то же время в области металлополимеров ферроцен занимает особое место благодаря своим уникальным свойствам [11, 12]. Сильное взаимодействие Fe(II) с циклопентадиенильными кольцами придает Fc прекрасную термическую стабильность и устойчивость к кислороду, что существенно облегчает синтез разнообразных его производных [5, 13]. В этом контексте полимеры, содержащие координационные единицы и Fc в боковых цепях, занимают важное место, являясь основой для создания нового класса функциональных наноматериалов с широким спектром возможных применений [5]. Они могут использоваться для хранения, обнаружения газов, катализа, адсорбции загрязнителей и в электрохимических процессах, способствуя будущему развитию полезного оборудования и новых технологий [14].

Существует ряд работ по структурному анализу металлсодержащих полимеров [15–18], однако точная характеристика таких макромолекул остается сложной задачей, при решении которой важно обращать внимание на взаимную согласованность между молекулярными характеристиками и параметрами, полученными независимыми методами. Также необходимо учитывать термодинамическое качество использованных растворителей. Таким образом, детальную характеристику полимеров с Fc-содержащими звеньями в растворах можно рассматривать как отдельную задачу, обязательно предшествующую интерпретации данных о более сложных структурах на их основе.

Цели настоящей работы – синтез гомологического ряда новых полимеров, содержащих ферроцен в боковых цепях (полиферроценоилэтилметакрилатов), в широком диапазоне молекулярных масс и проведение детального конформационного анализа их макромолекул, что создаст основу для дальнейшего изучения более сложных полимерных структур, в том числе с содержанием различных металлических и/или координационных центров. Также в работе методами электронной микроскопии и динамического рассеяния света (ДРС) исследованы Fc-содержащие наночастицы, полученные нанопресипитацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Аналитическое ультрацентрифугирование. Эксперименты по скоростной седиментации проводили с помощью аналитической ультрацентрифуги ProteomeLab XLI AUC (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США) в центробежном поле при скорости вращения ротора 50 000 об./мин с использованием двухсекторных алюминиевых сердечников с длиной оптического пути 12 мм и четырехъячеечного ротора (An–60Ti), позволяющего одновременно проводить эксперимент с тремя независимыми концентрациями образца. Ячейки заполняли 440 и 420 мкл растворителя и раствора соответственно. До начала эксперимента ротор термостатировали при температуре T = 20.0°C не менее часа. Профили седиментационных кривых снимали при помощи интерференционной оптической системы. Данные экспериментов обрабатывали при помощи программы Sedfit [19].

Вискозиметрия. Измерения выполнены на вискозиметрах Microviscometer LOVIS 2000 M (Anton Paar, Грац, Австрия). Капилляр с внутренним диаметром 1.59 мм оснащен шариком с золотым покрытием, диаметр шарика 1.50 мм. Значения характеристической вязкости определяли при последовательном разбавлении по методам Хаггинса [20] и Кремера [21]. Соответствующие времена прохождения шарика измеряли при температуре Т = 20.0°С.

Динамическое рассеяние света. Автокорреляционные функции интенсивности рассеянного света получали на установке “PhotoCor Complex” (фирма “Фотокор”, Россия) с коррелятором на 288 каналов (минимальное время задержки 10 нс) и одномодовым твердотельным лазером (λ = 654 нм). Автокорреляционные функции регистрировали в диапазоне углов от 30° до 130°, что соответствовало волновым векторам от 6.62 × 10^–3 до 23.18 × 10^–3 нм^–1. Обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы “DynaLS” методами обратного преобразования Лапласа и кумулянтов.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Исследования проводили на сканирующем электронном микроскопе Zeiss Merlin (Carl Zeiss Group, Германия). Размеры были получены с помощью программного обеспечения ImageJ [22]. Капли водной суспензии изучаемых частиц наносили на кремниевую пластину и высушивали. Ускоряющее напряжение составляло 10 кВ.

СИНТЕЗ МОНОМЕРА И ПОЛИМЕРА

Синтез мономера. Ферроценсодержащий мономер ферроценоилоксиэтилметакрилат (Fc-monomer) синтезировали, как описано в [23], по реакции ферроценкарбоновой кислоты с 2-гидроксиэтилметакрилатом в присутствии дициклогексилкарбодиимида и 4-диметиламинопиридина. В отличие от других испробованных способов активации ферроценкарбоновой кислоты (хлористым тионилом, оксалилхлоридом, карбонилдиимидазолом) в данном случае целевой продукт получается с выходом 75–80% без образования побочных смолообразных продуктов, что существенно упрощает выделение и очистку.

1.30 г (5.7 мМоль) ферроценкарбоновой кислоты, 1.27 г (6.2 мМоль) дициклогексилкарбодиимида, 0.75 г (6.1 мМоль) 4-диметиламинопиридина и 1.2 мл (10 мМоль) гидроксиэтилметакрилата смешивали в 20 мл хлористого метилена при комнатной температуре, после 2 ч перемешивания отфильтровали выпавшую дициклогексилмочевину и оставили на двое суток при перемешивании на магнитной мешалке. После этого прибавили одну каплю уксусной кислоты, перемешивали еще 40 мин, затем отфильтровали от дициклогексилмочевины и упарили на роторном испарителе. Остаток растворили в 100 мл смеси петролейный эфир/бензол (3/1) и промыли 0.5 М HCl и водой от 4-димеиламинопиридина, высушили над сульфатом натрия. Упаривали на роторном испарителе и перекристаллизовывали из пентана (оранжевые иглы). Выход – 1.4 г (75%). Перед синтезом полимера ферроценоилоксиэтилметакрилат (Fc-monomer) был перекристаллизован из смеси пентан/гексан в соотношении по объему 5/1 в СDCl₃. ¹H ЯМР-спектр полученного мономера и его структурная формула представлены на рис. 1.

Синтез полимера. Для полимеризации полученного ферроценоилоксиэтилметакрилата использовали метод RAFT-полимеризации в присутствии двух RAFT-агентов (DDMAT (2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid) и CPPA (4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid, 4-циано-4-(фенилкарботиоилтио)пентановая кислота)) (табл. 1). Процедура полимеризации включала в себя подготовку полимеризационного раствора в свежеперегнанном диоксане (RAFT – агент и мономер взвешивали в реакционный сосуд, инициатор добавляли из предварительного подготовленного раствора азобиизобутиронитрила (AIBN) в диоксане). Далее полимеризационный раствор помещали в ампулу и подвергали тройному циклу: замораживание в жидком азоте; вакуумирование (p = 0.015 мм. рт. ст.); оттаивание при разрежении и заполнение аргоном. Далее ампулу под вакуумом отпаивали от установки и помещали в термостат (80°С) на заданное время (табл. 1). После синтеза наблюдали увеличение вязкости растворов, диоксан удаляли лиофильной сушкой, лиофилизат анализировали методом ¹Н ЯМР для установления конверсии С=С-связей мономера (сигналы в ¹H ЯМР 6.18, 5.56 ppm). Полимерный продукт растворяли в минимальном количестве хлористого метилена и очищали, осаждали в избыток метанола. Процедуру повторяли 2 раза, добиваясь наличия мономера в полимерном образце на уровне 2–5% согласно ¹Н ЯМР. Для примера на рис. 2 приведен ¹Н ЯМР-спектр в СDCl₃ полимера Fc-RAFT 1, очищенного двукратным переосаждением, а также его структурная формула. Спектры остальных образцов аналогичны данному (с учетом другой концевой группы для образцов Fc-RAFT 5, 6).

Нанопреципитация. Процедуру нанопреципитации [24] проводили с растворами полимеров (Fс-RAFT 4 и Fс-RAFT 5) в тетрагидрофуране при концентрации с = 1 мг/мл путем добавления воды в отношении 1:1 при постоянном перемешивании. По мере образования суспензии наблюдалось появление опалесценции. Виалы с полученными суспензиями оставляли открытыми до испарения тетрагидрофурана (24–48 ч), таким образом получали суспензии наночастиц в водной среде.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-конформационный анализ. Для детального изучения молекулярных и конформационных свойств Fc-содержащих гомополимеров на основе полиметилметакрилата (полиферроценоилоксиэтилметакрилат) применяли классические методы молекулярной гидродинамики, а именно седиментационно-диффузионный анализ, вискозиметрию и денситометрию. На рис. 3 представлены дифференциальные распределения коэффициентов седиментации исследованных образцов. В целом распределения носят унимодальный характер с тенденцией к уширению при увеличении молярной массы полимера. Все образцы исследовали в широком диапазоне концентраций, а данные о коэффициентах седиментации и диффузии экстрпаполировали к нулевой концентрации. Коэффициенты диффузии определяли методом численного решения уравнения Ламма с использованием программы Sedfit, данные приведены в табл. 2. Молярные массы исследованных образцов определяли по уравнению Сведберга:

где R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная температура, ${v}$ – удельный парциальный объем, ρ₀ – плотность растворителя, ${{s}_{0}}$ – коэффициент седиментации, ${{D}_{0}}$ – коэффициент диффузии.

Удельный парциальный объем, необходимый для вычисления молярной массы, был определен методом вариации плотности растворителя посредством сравнения коэффициентов седиментации в обычном и дейтерированном тетрагидрофуране по данным экспериментов скоростной седиментации [25] и составил 0.68 ± 0.02 см³ г^–1, что хорошо согласуется со значениями, полученными в [2, 3].

Самосогласованность экспериментальных данных была установлена на основе концепции гидродинамического инварианта A₀ [26]:

где $R$ – универсальная газовая постоянная, $\left[ s \right] \equiv \frac{{{{s}_{0}}{{{{\eta }}}_{0}}}}{{\left( {1 - {v}{{\rho }_{0}}} \right)}}$ и $\left[ D \right] \equiv \frac{{{{D}_{0}}{{{{\eta }}}_{0}}}}{T}$ – характеристические значения коэффициента седиментации и коэффициента диффузии соответственно, ${{s}_{0}}$ – коэффициент седиментации, ${{{{\eta }}}_{0}}$ – вязкость растворителя, ${{{{\rho }}}_{0}}$ – плотность растворителя, ${{D}_{0}}$ – коэффициент диффузии, $T$ – абсолютная температура.

Малые отклонения гидродинамического инварианта от средних значений, присущих данному типу полимерных цепей, свидетельствуют об удовлетворительной согласованности гидродинамических характеристик и молярной массы образцов. Для исследованных образцов среднее значение A₀ = $\left( {3.0 \pm 0.2} \right) \times {{10}^{{ - 10}}}$ г см с⁻² K⁻¹ моль^−1/3 является характерным для гибкоцепных полимеров и подтверждает правильность оценки молярной массы исследованных полимеров.

Используя согласованные между собой измеренные значения гидродинамических параметров и адекватные оценки молярных масс, можно определить наиболее вероятную конформацию полимерных цепей в растворе на основе скейлинговых построений типа Марка–Куна–Хаувинка–Сакурады, имеющих общий вид

где ${{P}_{{{\alpha }}}}$ – одна из гидродинамических характеристик ($\left[ {{\eta }} \right]$, ${{s}_{0}}$, ${{D}_{0}}$), ${{P}_{{{\beta }}}}$ – другая гидродинамическая характеристика из представленного списка или молярная масса $M$.

Соответствующие логарифмические зависимости представлены на рис. 4 и имеют линейный характер. В результате получены следующие уравнения: $\left[ {{\eta }} \right] = 0.07~{{M}^{{0.46 \pm 0.05}}}$, ${{s}_{0}} = 0.02~{{M}^{{0.56 \pm 0.03}}}$, ${{D}_{0}} = 1.500~{{M}^{{ - 0.44 \pm 0.03}}}$.

Значения скейлинговых индексов в пределах погрешности достаточно хорошо согласуются между собой и указывают на гауссову конформацию полимерных цепей в растворе.

Фундаментальными конформационными характеристиками макромолекул в растворе являются равновесная жесткость (длина статистического сегмента или длина сегмента Куна) A и эффективный гидродинамический диаметр полимерной цепи d. Эти характеристики определяют конформацию полимера и его свойства в растворе и могут быть оценены с использованием различных гидродинамических модельных теорий.

Для оценки равновесной жесткости применяли построение Кови–Байотера [27], позволяющее использовать данные о поступательном трении макромолекул согласно выражению

где – молярная масса единицы длины полимерной цепи (${{M}_{0}} = 368$ г/моль – молярная масса мономерного звена, а λ = 2.52 × 10^–8 см – длина проекции длины мономерного звена на направление роста цепи), константа ${{P}_{\infty }} = 5.11$, B – параметр, характеризующий взаимодействия полимер/растворитель, А – равновесная жесткость.

Помимо данных о поступательном трении (коэффициент диффузии D, рис. 5) для анализа конформации изученного полимера использовали значения характеристической вязкости [η] и среднее значение гидродинамического инварианта A₀ = $\left( {3.0 \pm 0.2} \right) \times {{10}^{{ - 10}}}$ г см с⁻² K⁻¹ моль^−1/3. С этой целью для определения равновесной жесткости (рис. 5) использовали коэффициент диффузии $~{{D}_{{{\eta }}}}$, рассчитанный по формуле

Согласно сделанным оценкам равновесная жесткость ферроценоилоксиэтилметакрилата составила A = 5.8 нм. Зависимость, представленная на рис. 5, является практически горизонтальной, что означает, что коэффициент B близок к нулю. Это характерно для полимеров в растворах в термодинамических условиях, близких к идеальным, что хорошо коррелирует с выводами об общей конформации, сделанными по скейлинговым построениям. Гидродинамический диаметр d, полученный с использованием соотношения $d = \sqrt {\frac{4}{\pi }\frac{{{{M}_{0}}{\bar {v}}}}{{\lambda ~{{N}_{{\text{A}}}}}}} $, равен 1.5 нм, что хорошо коррелирует с химической структурой данного полимера.

Наночастицы на основе ферроцена вызывают значительный интерес как чувствительные к активным формам кислорода наноносители противораковых препаратов, средств визуализации и т.д. [12, 28]. Для получения полимерных частиц использовали метод нанопреципитации, его принцип основан на смене термодинамического качества растворителя, при котором в растворе происходит микрофазное разделение с возможностью образования полимерных частиц. Отметим, что данный подход может быть реализован только при условии хорошей смешиваемости растворителей. В работе использовали исходные растворы Fc-полимеров в тетрагидрофуране с концентрацией 1 мг/мл, к которым при постоянном перемешивании добавляли воду, при этом в растворах наблюдалось появление опалесценции. Полученные водные дисперсии оставляли на период от 24 до 48 ч в открытой емкости при комнатной температуре, за это время большая часть тетрагидрофурана испарялась.

Для анализа распределения по гидродинамическим радиусам наночастиц методом ДРС полученные дисперсии разбавляли водой в 3 раза.

Для формирования наночастиц были выбраны два образца Fc-RAFT 4 и Fc-RAFT 5, которые в рамках исследованной полимер-гомологической серии различаются по молярной массе больше всего.

Согласно данным СЭМ (рис. 6) полученные наноразмерные полимерные частицы обладают сферической формой. Помимо индивидуальных частиц заметны их скопления, в которых они объединяются друг с другом с формированием межчастичных тяжей. Наночастицы, полученные из образца Fc-RAFT 4, обладают средним радиусом 62 нм, а из образца Fc-RAFT 5–45 нм (рис. 7а, 7б). Согласно анализу гистограмм среднеквадратичное отклонение для частиц на основе Fc-RAFT 4 составило 11 нм, а для частиц на основе Fc-RAFT 5–9 нм. Из этого можно заключить, что различие в молярной массе исходных полимеров более чем на порядок не приводит к существенному изменению размеров полимерных наночастиц.

Гидродинамический радиус R_h наночастиц, полученных из раствора образца Fc-RAFT 4, согласно ДРС, составлял 124 нм. Распределения интенсивности рассеяния по гидродинамическим радиусам дисперсии наночастиц, полученной из раствора образца Fc-RAFT 4, характеризовались одним основным пиком (рис. 7в). Зависимость обратного времени релаксации флуктуаций концентрации 1/τ от квадрата волнового вектора q² имела линейный характер и проходила через начало координат (рис. 7г), что позволяет интерпретировать данный процесс как поступательную диффузию. В этом случае наклон указанной выше зависимости соответствует коэффициенту поступательной диффузии D, который составил 1.98 × 10^–8 см²/с. Согласно уравнению Стокса–Эйнштейна $\left( {{{R}_{h}} = \frac{{kT}}{{6{{\pi }}{{{{\eta }}}_{0}}D}}} \right)$ гидродинамический радиус исследуемых частиц составил 124 нм. Кумулянтный анализ данных ДРС показал, что гидродинамический радиус R_hcum составляет 130 нм, а индекс дисперсности PDI – 0.1. Хорошее соответствие R_h и R_hcum и низкая величина индекса дисперсности свидетельствуют о том, что получаемые наночастицы имеют узкое распределение по размерам. Тот факт, что данные, полученные из ДРС и СЭМ, не имеют полного количественного соответствия, можно объяснить возможной агрегацией наночастиц в водной суспензии. На агрегацию также указывает присутствие на распределениях интенсивности рассеяния по гидродинамическим радиусам малого пика, близкого к радиусам в 1 мкм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом RAFT-полимеризации синтезирован гомологический ряд полиферроценоилэтилметакрилатов в более чем десятикратном диапазоне молярных масс. Полученные полимеры изучали с помощью методов молекулярной гидродинамики. Определены их основные молекулярные и гидродинамические характеристики, а также проведен их конформационный анализ. Сделано заключение о гауссовой конформации исследованных макромолекул в растворе. Определен основной конформационный параметр полимерных цепей (термодинамическая жесткость) на основе данных по поступательному и вращательному трению макромолекул в растворах. На основе ферроценсодержащих полимеров были приготовлены суспензии наночастиц. Установлено, что полученные наночастицы имеют сферическую форму, а их размеры, согласно данным СЭМ, практически не зависят от молярных масс исходных полимеров.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Немецкого научно-исследовательского сообщества в рамках научного проекта № 21-53-12034 (The reported study was funded by RFBR and DFG, project number 21-53-12034).

Результаты получены с использованием Научного парка СПбГУ, а именно Междисциплинарного ресурсного центра по направлению “Нанотехнологии”, ресурсных центров “Центр диагностики функциональных материалов для медицины, фармакологии и наноэлектроники” и “Магнитно-резонансные методы исследования”.