Нейрохимия, 2019, T. 36, № 4, стр. 339-345

ВВЕДЕНИЕ

Эпилепсия является одним из наиболее распространенных заболеваний нервной системы [1]. Анализ литературных данных позволяет характеризовать эпилепсию как свободнорадикальную патологию [2], которая не только генетически предопределяет возникновение повышенной судорожной активности, но и постоянно инициирует ее проявление.

В основе современных представлений на патофизиологию эпилептического пароксизма лежит положение о гиперактивности группы нейронов, составляющих эпилептический очаг и обладающих особыми морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими свойствами. Причиной припадка является дисбаланс воздействия на эпилептический очаг возбуждающих и тормозных влияний с преобладанием возбуждения над торможением. В механизмах эпилептогенеза важная роль отводится мембранозависимым процессам. Некомпенсированная активация ПОЛ, наблюдаемая при судорогах, может быть следствием многих причин, в том числе – дисфункции ферментных систем [1]. Образование свободных радикалов контролируется многоступенчатой АОС. Она состоит из ферментных (СОД, ГПО, каталаза) и неферментных (витамины Е и С, убихиноны, каротиноиды, липоевая кислота) антиоксидантов. При нарушении равновесия между оксидантной и антиоксидантной системами и недостаточной эффективностьи антиоксидантов возникает оксидантный стресс, который приводит к перекисному окислению липидов мембран, энергетическому дефициту в митохондриях и повреждению клеток. Основными причинами уязвимости головного мозга к воздействию свободных радикалов являются высокий уровень потребления кислорода (20%); большое количество митохондрий в клетках; высокое содержание фосфолипидов, олеиновой кислоты, ионов железа; низкое содержание витамина А, каталазы, ГПО, церулоплазмина; низкий уровень АОС [1, 3, 4].

Одно из базисных положений в теории свободнорадикальной патологии – тезис о нарастании уровня ПОЛ в прямой зависимости от интенсивности метаболизма ткани, стимулирует исследование свободнорадикальных механизмов эпилепсии, которая, с точки зрения интенсивности метаболизма, по-видимому, не имеет аналога среди патологических процессов центральной нервной системы (ЦНС). Кроме того, циркуляторный режим эпилептического припадка не в состоянии адекватно обеспечить превышенные метаболические потребности, что обусловливает развитие в очаге эпилептической активности нейрональной гипоксии [2], являющейся индуктором ПОЛ. С точки зрения патохимии эпилептогенного влияния ПОЛ важно, что помимо прямого повреждающего воздействия на клеточные мембраны и их энзимные системы, усиленная пероксидация способна опосредовать эпилептизацию нейронных популяций путем поражения нейромедиаторных и рецепторных механизмов, проявляющих участие в генерации судорожных разрядов. У больных эпилепсией с большой давностью заболевания, прогредиентным типом течения болезни отмечалось повышение уровня ПОЛ в мембранах эритроцитов на 93–127% при одновременном повышении содержания витамина Е в сыворотке крови и снижении активности СОД в крови на 23% [2, 5–7], что косвенно может свидетельствовать о повышении ПОЛ клеточных мембран. Данные Лапоногова О.А. и соавт. [8] свидетельствует о том, что в крови больных с эпилептическими припадками наблюдается довольно выраженное (в 1.4 раза) повышение уровня малонового диальдегида (МДА) и снижение активности СОД в зависимости от степени тяжести. Этому сопутствуют более чем в 3 раза снижение перекисной резистентности эритроцитов, двухкратное угнетение супероксиддисмутазной активности. При исследовании крови больных средней группы, у которых наблюдаются более частые эпиприпадки, обнаружены более выраженные нарушения прооксидантного и антиоксидантного статуса крови. Однако, неполностью изучены параметры антиоксидантной системы у больных эпилепсией в зависмости от степени тяжести.

В данной работе представлены результаты метаболизма пероксидации липидов, определены продукты ПОЛ с одновременным определением показателей АОС в крови больных эпилепсией в зависимости от степени тяжести в Южно-Казахстанской области.

Цель работы – изучение процессов ПОЛ и состояния АОС в крови больных эпилепсией в зависимости от степения тяжести заболевания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

С целью изучения процессов ПОЛ и состояния АОС в эритроцитах, лимфоцитах и плазме крови было обследовано 95 больных эпилепсией, в том числе 35 больных с эпиприступами с частотой 3 раза в год (легкая степень тяжести), 30 больных с эпиприступами с частотой до 12 раз в год (средняя степень тяжести), 30 больных с частыми полиморфными эпиприступами с частотой свыше 12 раз в год (тяжелая степень). Для оценки степени отклонения исследуемых показатели нормы использовали кровь условно здоровых лиц доноров. Контрольная группа – 30 здоровых мужчин 17–27 лет (средний возраст 22.2 ± 1.87 г.). Диагноз эпилепсии и эпилептические синдромы устанавливали на основании результатов клинико-инструментального обследования, критериев Международной противоэпилептической лиги (1989, 2001). Определены фиксированные сроки амбулаторного и стационарного обследования: оценки неврологического статуса, клинико-лабораторных и инструментальных показателей – в межприступный период (исходно), в течение 24 ч от момента развития приступа. Все пациенты предоставили информированное согласие на участие в исследовании. Диагноз эпилептического пароксизма устанавливался на основании критериев Международной лиги эпилептологов (2001 г.): наличие характерных классифицируемых фокальных или генерализованных эпилептических припадков, эпилептиформных изменений биоэлектрических потенциалов головного мозга, регистрируемых стандартной амбулаторной ЭЭГ или ЭЭГ-видеомониторингом, данных методов нейровизуализации.

При составлении выборки исключали текущие органические заболевания нервной и сердечно-сосудистой систем. Методы исследования: клинический (соматический и неврологический статус); лабораторный (общий анализ крови и мочи); инструментальный (ЭЭГ, СКТ и МРТ ГМ).

Для оценки метаболизма пероксидации липидов определены продукты ПОЛ с одновременным определением в крови показателей АОС, в частности, активности СОД, ГР, ГПО, а также антирадикальной и антиокислительной активностей биосред. Из неферментных антиоксидантных показателей изучалось содержание α-токоферола и SH-групп в зависимости от тяжести эпилепсии.

Биохимические и биофизические исследования проводили не позднее, чем через 1 ч после забора крови. Для получения полного представления о кинетике ПОЛ проведено исследование по определению начальных, промежуточных и конечных продуктов ПОЛ в эритроцитах крови. Определение диеновых конъюгатов (ДК), гидроперекиси липидов (ГПЛ) и МДА в крови проводилось согласно общепринятой методике [4, 9–11]. Резистентность эритроцитов и окисляемость липидов в мембранах эритроцитов определяли по стандартному методу [12–14]. Методом Спектора Е.В. и др. [15] осуществлялось определение общей антиоксидантной активности крови (АОА). Исследования токоферола в крови определяли модифицированной методикой, по Рудаковой-Шилиной Н.К., Матюховой Н.П. [16]. Определение активности СОД проводили по методу в модификации Чумакова В.Н. и Осинского Л.Ф. [17]. Определение активности ГПО проводили по изменению поглощения восстановленного глютатиона после инкубации в присутствии перекиси водорода [7]. Активность ГР эритроцитов определяли спектрофотометрически по скорости окисления НАДФ в присутствии окислительного глутатиона при длине волны 320 нм [7]. Содержание сульфгидрильных групп в крови определяли с использованием реактива Элмана [6, 7]. Определение параметров АОА крови проводили по методу Орманова Н.Ж. [14, 18].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были исследованы больные с симптоматическими формами эпилепсии с легкой, средней и тяжелой степенью тяжести, согласно классификации (2001 г., Нью-Дели). В структуре этиологии симптоматических форм эпилепсии подавляющее большинство было представлено последствием перинатальной травмы с резидуальными явлениями энцефалопатии – 48% чел., со средней длительностью заболевания эпилепсией 15.16 ± 1.37 лет. Последствия черепно-мозговой травмы как причины эпилепсии встречались в 34% случаев, средняя длительность заболевания эпилепсией – 7.74 ± 3.45 лет. Последствия инфекционных поражений нервной системы (менингоэнцефалиты) наблюдались у 18% пациентов, длительность заболевания эпилепсией – 10.5 ± 4.45 лет. Общая средняя длительность заболевания в рамках симптоматических форм эпилепсии составила 10.91 ± ± 2.76 лет. Использование методов компьютерной и магнитно-резонансной томографии позволило верифицировать структурные нарушения головного мозга у больных с эпилептическими пароксизмами: атрофические изменения (гидроцефалия ex vacuo) в 19.51% случаев, негрубо выраженную очаговую и диффузную атрофию коры головного мозга (21.95%), кисты различной локализации (13.41%). Данные изменения следует расценивать как неспецифические признаки резидуальной органической патологии и как следствие воздействия на головной мозг эпилептического процесса – гипоксии, метаболических и гемодинамических нарушений. У 45.13% больных патологии головного мозга при нейровизуализационных исследованиях выявлено не было. Электроэнцефалографические изменения имели следующие характеристики: нерегулярный альфа-ритм был выявлен у 32.93% пациентов, диффузное усиление медленноволновой активности – у 14.63%, локальное усиление медленноволновой активности – у 68.29% больных, пароксизмальная активность (неспецифическая, диффузная) – у 19.51%, локальная неспецифическая активность – у 26.83% пациентов, фокальная эпилептическая активность – у 14.63%.

Анализ полученных результатов свидетельствовал о том, что у больных эпилепсией имело место повышение содержания продуктов ПОЛ в эритроцитах. Уже при легкой степени тяжести содержание ДК в эритроцитах оказалось на 141% выше контрольных величин (Р < 0.001). По мере тяжести содержание ДК в эритроцитах нарастало, достигая максимума у лиц тяжелой степенью заболевания 0.825 ± 0.06 мг/г липидов, что на 217% выше величин контроля (Р < 0.001).

Аналогичная закономерность прослеживалась и в содержании других изученных продуктов ПОЛ в эритроцитах: постепенное и неуклонное повышение концентрации ДК, ГПЛ и МДА по мере нарастания степени тяжести. Таким образом, результаты наших исследований свидетельствовали о накоплении у больных эпилепсией в крови продуктов ПОЛ. Это, как известно, влечет за собой такие нежелательные последствия, как нарушение структурно-функциональной организации мембран, ингибирование их ферментов и, соответственно, нарушение функции клеток и органов в целом. Полученные нами данные о значительном усилении активности процессов свободнорадикального окисления мембранных липидов у больных при различной степени эпилепсии, безусловно, влияли на функциональную организацию клеточных мембран.

Содержание ДК, ГПЛ и МДА в эритроцитах крови у больных эпилепсией повысилось на 111, 126.6 и 89.1% соответственно, по сравнению с контролем. Концентрации ДК, ГПЛ и МДА в эритроцитах крови у больных эпилепсией легкой степени повысились на 53.8, 60 и 67.7% соответственно по сравнению с контролем. Уровень содержания ДК, ГПЛ и МДА в эритроцитах крови у больных эпилепсией средней степени повысились на 111.5, 134.2 и 104.7% соответственно, по сравнению с контролем. Наиболее выраженное повышение содержания ДК в эритроцитах крови отмечено при тяжелой степени эпилепсии, когда его концентрация превышала контрольную величину на 165.4%. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что при эпилепсии имеет место повышенное содержание ГПЛ в эритроцитах крови в зависимости от степени тяжести. Уже при легкой степени эпилепсии содержание ГПЛ в эритроцитах крови оказалось на 60% выше контрольной величины, увеличение промежуточных продуктов ПОЛ в эритроцитах крови при эпилепсии средней степени тяжести составляло 134% по сравнению с контрольной группой. По мере тяжести эпилепсии содержание ГПЛ в эритроцитах крови нарастало, достигая максимума у больных с тяжелой степенью – 6.45 ± 1.8 ЕОП/мг липидов, что на 97.8% выше величин контроля. Аналогичные сдвиги наблюдались при эпилепсии в зависимости от степени тяжести содержанием МДА в эритроцитах крови. У больных с легкой степенью эпилепсии содержание МДА превышало контрольные данные на 67.8%, у больных средней степенью – 93.8% и при тяжелой степени заболевания – 104.7% (табл. 1).

Для более объективного подтверждения мембранно-патологического влияния высоких концентраций продуктов ПОЛ нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией, так как накопление липидов в мембранах неизбежно влечет за собой изменение их физико-химических свойств. Результаты определения перекисной и механической стойкости эритроцитов у больных эпилепсией в зависимости от степени тяжести представлены в табл. 2.

Согласно данным табл. 2, перекисный и механический гемолиз эритроцитов при эпилепсии превышал контрольные данные на 307.9% и 108.9% соответственно.

При легкой степени эпилепсии вышеуказанные параметры стойкости эритроцитов продолжали возрастать, и лабилизация мембран эритроцитов при воздействии перекиси водорода и механической манипуляции увеличивалась на 246.7 и 87.1% соответственно.

При средней степени эпилепсии вышеуказанные параметры стойкости эритроцитов продолжали возрастать по сравнению с контрольной группой и лабилизация мембран эритроцитов при воздействии перекиси водорода и механической манипуляции увеличивалась на 335.7 и 100% по сравнению с контрольной группой.

Максимальное уменьшение перекисной и механической стойкости эритроцитов выявлено у больных с тяжелой степенью эпилепсии. Перекисный и механический гемолиз эритроцитов увеличились до 335.7 и 139.8% по сравнению с контрольными, принятыми за 100%.

Параллельно повышению содержания перекисей липидов в крови у больных эпилепсией отмечалось усиление реакции окисляемости липидов.

Окисляемость липидов у лиц контрольной группы составляла в среднем 0.099 ± 0.001 ЕОП на 150 млн клеток, что совпадает с данными Орманова Н.Ж. [14, 18]. У больных эпилепсией установлено усиление реакции ПОЛ в системе аскорбат–зависимого ПОЛ (АЗП) на 283.8% и параллельно степени тяжести. Окисляемость липидов у больных с легкой степенью эпилепсии более чем в 2.5 раза (292.9%) превышала контрольные величины. У лиц со средней степенью тяжести реакция ПОЛ повысилась в 3.5 раза (393.9%) по сравнению с контролем. Максимальное в 4.5 раза (454.5%) повышение окисляемости липидов наблюдалось у больных с тяжелой степенью эпилепсии.

Для изучения механизмов, способствующих длительному поддержанию у больных эпилепсией свободнорадикальных реакций на высоком уровне, нами проведены исследования АОС организма по определению содержания в сыворотке α-токоферола как одного из главных естественных биологических антиоксидантов, а также по изучению антирадикальной (АРА) и антиокислительной (АОА) активностей плазмы крови, с одновременным определением активности СОД – ключевого энзима свободнорадикального процесса в эритроцитах (табл. 3).

Содержание естественного антиоксиданта α‑токоферола в эритроцитах больных также претерпевало значительные изменения. В частности, у больных эпилепсией легкой степени уровень данного антиоксиданта составил 0.35 ± 0.02 мг/г липидов, против 0.54 ± 0.01 мг/г липидов в контроле и уменьшение составляло 35.2% по сравнениию со значениями здоровых лиц. При средней степени эпилепсии содержание α-токоферола снизилось на 40.8% по сравнению с нормой. Наибольшее снижение содержания α-токоферола в эритроцитах установлено при тяжелой степени эпилепсии. Уровень α-токоферола в эритроцитах здесь был на 46.3% ниже по сравнению с контролем.

Известно, что одним из мощных механизмов защиты, предохраняющих биомембраны от избыточного переокисления, является СОД, которая восстанавливается и переокисляет супероксидный анион радикал в перекись водорода [5, 7]. В этой связи нами изучена активность СОД в эритроцитах. Активность СОД у больных эпилепсией в зависимости от степени тяжести претерпевает значительные изменения.

Как следует из табл. 1, у больных с легкой степенью тяжести активность СОД составила 45.1 ± 0.64 условных единиц на 1 мл эритроцитарных масс, что соответствовало 34.8% от контрольных величин. Во 2-й группе (при эпилепсии средней степени) активность фермента составила 53.8%, в 3‑й группе, т.е. у лиц с эпилепсией тяжелой степени – 339.2% от контроля, принятого за 100%.

Снижение содержания α-токоферола и активности СОД в клетках красной крови, как свидетельствуют наши данные, может быть обусловлено потреблением и в реакциях антиоксидантной защиты в связи со снижением SH-групп [6, 7].

Это подтверждается экспериментальными данными, согласно которым при недостаточности антиоксидантных механизмов в антисвободнорадикальные процессы более активно включаются антикислородные, антиперекисные факторы, ответственные за обезвреживание уже образовавшихся перекисей свободных радикалов [12, 13]. Исходя из наших данных, можно заключить, что при эпилепсии имеет место недостаточность антиоксидантных механизмов защиты. Это обусловлено, в первую очередь, несостоятельностью антирадикальных и антикислородных механизмов, представителями которых являются токоферолы и СОД [6, 7].

Изучение общей АРА и АОА плазмы крови у обследованных больных представлено в табл. 3.

Снижение АОА плазмы крови отмечено у всех обследуемых больных. Как следует из табл. 3, у больных легкой степени тяжести АОА и АРА снизились на 50.3% и 37.2%. По мере выраженности степени тяжести наблюдалось дальнейшее снижение АОА и АРА плазмы. Так, при средней и тяжелой степени эпилепсии АОА составила 46.4 и 38.9% и АРА – 36.5 и 31% по отношению к контролю.

Изучение активности ГПО и ГР, а также содержание SH-группы в цельной крови показало, что происходит инактивация активности энзимов с одновременным снижением уровня сульфгидрильных групп. У больных с легкой степенью эпилепсии активность ГПО и ГР снизилась на 27.5 и 27%. Уровень SH-групп цельной крови уменьшился на 25%. Активность ГПО и ГР в клетках красной крови у больных эпилепсией со средней степенью тяжести уменьшилась на 50.7 и 40.7%; содержание SH-групп снизилось на 47%. Наибольшее угнетение активности изучаемых энзимов и содержание SH-групп установлены у лиц эпилепсией тяжелой степени заболевания, при этом АРА и АОА крови снизились на 68 и 59.7%, а концентрации сульфгидрильных групп уменьшились на 72.8%, по сравнению со значениями контрольных групп.

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, в зависимости от степени тяжести у больных с эпилепсией содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах крови повышается и развивается недостаточность антиоксидантных механизмов защиты. Также параллельно повышению содержания перекисей липидов в крови у больных эпилепсией отмечалось усиление реакции окисляемости липидов. Увеличение окисляемости липидов при фосфорной интоксикации, по мнению Орманова Н.Ж., является следствием изменения АОС и состава липидов. Мы склонны объяснять это увеличение их способностью к радикалообразованию [18], которая растет со степенью непредельности липидов [13]. Приведенные данные согласуются с положением о преимущественно токсическом действии перекисей липидов на клеточную мембрану при эпилепсии, что проявляется мембранопатологическими процессами со снижением резистентности биомембран [19].

При исследовании АОС организма определение содержания в сыворотке крови α-токоферола являлось основным, так как он один из главных естественных биологических антиоксидантов. По-видимому, при эпилепсии имеет место интенсивное потребление и нарушение транспорта витамина Е, что может быть основой нарушения антиоксидантной защиты организма при данной патологии. Между содержанием в сыворотке крови витамина Е и интенсивностью пероксидации липидов в клеточных мембранах установлена обратная связь [8]. Данная закономерность прослеживалась и в наших наблюдениях – более выраженное накопление продуктов ПОЛ и усиление окисляемости липидов в мембранах эритроцитов у лиц эпилепсией в зависимости от степени тяжести и, соответственно, уменьшение перекисной и механической стойкости эритроцитов (r₁ = ±0.724; r₂ = ±0.812) соответствует низкому уровню токоферола в сыворотке и эритроцитах крови.

Активация свободнорадикального процесса, обнаруженная нами при эпилепсии является одним из патогенетических механизмов заболевании. В настоящее время известно большое число эндогенных метаболитов и энзимов, представителями которых являются токоферолы и СОД. Токоферолы не только обеспечивают защиту клеточных липидов от переокисления, но и служат регуляторами [6, 8, 20].

Исходя из наших данных, можно заключить, что при эпилепсии имеет место недостаточность антиоксидантных механизмов защиты. Это обусловлено снижением антиоксидантных и антирадикальных свойств крови, которые определенным образом связаны с несостоятельностью антиокислительных и антирадикальных механизмов, представителями которых являются α-токоферолы и СОД [5, 8, 21].

Наряду с изучением α-токоферола в организме у больных меняется активность ферментов СОД, АОА и АРА. Токоферолы не только обеспечивают защиту клеточных липидов от переокисления, но и служат регуляторами других антиоксидантных систем организма [6, 8, 20]. Будучи одним из ведущих антиоксидантов, α-токоферолы успешно применяются для лечения и профилактики различных патологических состояний, протекающих с синдромом “гиперпероксидация липидов”. Проведенные комплексные исследования позволяют сделать заключение о том, что при эпилепсии имеют место накопление перекисей липидов в крови и снижение активности антиоксидантной системы организма. Выраженность всех этих процессов находится в прямой зависимости от степени тяжести эпилепсии. Проведенные нами исследования убедительно свидетельствуют об участии этих механизмов в патогенезе при эпилепсии и обосновывают применение антиоксидантов, а также препаратов, обладающих антиоксидантным свойством в лечении эпилепсии.

Таким образом, процесс потери сознания характеризуется активацией свободнорадикального статуса на организменном уровне, выраженном в случае эпилептического пароксизма. Продолжительный по времени период бессознательного состояния и более энергозатратный для клеток головного мозга эпилептический припадок, вероятно, и объясняет выявленные нами изменения показателей свободнорадикального статуса крови. В свою очередь, морфологическое повреждение вещества головного мозга вследствие резидуальной энцефалопатии, травм, воспалительных изменений в рамках причины эпилептических пароксизмов также характеризуется относительной активацией процессов ПОЛ крови. В исследовании было показано, что в зависимости от степени тяжести эпилепсии независимо от морфологического повреждения вещества головного мозга происходит активация свободнорадикального процесса. Нам представляется целесообразным рекомендовать применение антиоксидантов в комплексной терапии церебральных пароксизмальных состояний.

ВЫВОДЫ

1. Оксидантный стресс (ОС) с избыточным образованием продуктов ПОЛ – облигатное звено в патогенезе эпилепсии и эпилептических синдромов.

2. Механизм ингибирующего действия ОС при эпилептических и неэпилептических пароксизмах требует дальнейшего изучения.

3. Вероятно, препараты с антиоксидантной направленностью повышают устойчивость мозга пациентов с эпилептическими приступами к свободнорадикальному повреждению.