Нейрохимия, 2020, T. 37, № 1, стр. 320-38

ВВЕДЕНИЕ

Ацетилхолин (АХ) является одним из мощных модуляторов активности нейрональных сетей гиппокампа и неокортекса. Холинергическая сигнальная система вовлечена в генерацию гиппокампальных ритмов, а также играет важную роль в механизмах обучения и памяти. Снижение уровня АХ в результате дегенерации холинергических нейронов в базальных ядрах (медиальный септум, диагональная полоска Брока, базальное ядро Мейнерта) возникает при ряде патологий, таких как болезнь Альцгеймера [1], болезнь Паркинсона, ассоциированная с деменцией, а также деменция с тельцами Леви [2].

Одним из подходов, используемых в экспериментах на животных для анализа последствий холинергического дефицита, является инъекция иммунотоксина 192IgG-сапорина (IgS) [3]. Этот нейротоксин представляет собой конъюгат антитела к рецептору фактора роста нервов NGFR и рибосомного токсина сапорина. После инъекции IgS связывается с NGFR, который экспрессируется селективно на холинергических нейронах базальных ганглиев, после чего иммунотоксин подвергается эндоцитозу. Внутри нейронов IgS инактивирует рибосомы, что ведет к нарушению синтеза белков и, в конечном итоге, гибели холинергических клеток. Во множестве исследований было показано, что IgS, вводимый как в желудочки мозга, так и внутрисептально, приводит к гибели холинергических нейронов медиальной септальной области и диагональной полоски Брока [3].

Было показано, что внутрижелудочковая инъекция IgS приводит к нарушениям способности животных к обучению [3–5], к изменениям в экспрессии генов в гиппокампе [4, 5], а также микроглиозу в гиппокампе и гибели нейронов в зоне СА3 [6]. Оказалось также, что в ряде случаев иммунотоксин, введенный внутрижелудочково, приводит к развитию микроглиоза в мозолистом теле [6]. Последнее указывает на то, что при внутрижелудочковом введении IgS может влиять на функционирование структур, прилежащих к желудочкам. Поэтому в нашей работе мы проанализировали последствия внутрижелудочкового введения IgS, исследовав состояние клеток неокортекса, а также стриатума. Кроме того, мы провели молекулярно-биологический анализ структур, в которые проецируются холинергические нейроны медиальной септальной области, а именно, энторинальной коры и обонятельных луковиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на взрослых самцах крыс Sprague–Dawley (250–350 г), полученных из питомника “Пущино” (Институт биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова РАН). Всего в исследовании использовано 25 крыс (контроль n = 12; Ig-сапорин n = 13). Животных содержали в стандартных условиях вивария при 21 ± 1°С с 12-часовым циклом свет/темнота; пища и вода были предоставлены ad libitum. Все эксперименты проводились в соответствии с этическими принципами, изложенными в Директиве ЕС 2010/63/EU об экспериментах на животных, и были одобрены Этическим комитетом ИВНД и НФ РАН.

Инъекция IgS. Крыс анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг, внутрибрюшинно). 192IgG-сапорин (Millipore Corporation, США) растворяли в концентрации 1 мкг/мкл и инъецировали билатерально в дозе 4 мкг в каждый желудочек. Это вызывало значительную потерю холинергических нейронов в области перегородки (см. предыдущие работы [4, 6]). Двусторонние инъекции выполняли стереотаксически в боковые желудочки (от брегмы назад 0.8 мм и латерально 1.5 мм) [7] с использованием шприца Гамильтона объемом 10 мкл (Hamilton, Giarmata, Румыния). Контрольные крысы получали эквивалентный объем стерильного 10 мМ фосфатно-солевого буфера (PBS). Крысам давали возможность восстановиться в течение 1.5 мес. перед морфологическим анализом. У контрольных (n = 7) и получавших IgS (n = 7) животных одно полушарие головного мозга брали для морфологического анализа, а другое полушарие – для анализа экспрессии генов; у другой части животных (контроль n = 6; Ig-сапорин n = 5) весь мозг брали для морфологического анализа.

Иммуногистохимическое окрашивание. Крыс анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг, внутрибрюшинно) через 1.5 мес. после инъекции и затем подвергали транскардиальной перфузии охлажденным ледяным 0.9% NaCl. Для морфологического анализа весь мозг, либо одно полушарие, вынимали и фиксировали в растворе 4% параформальдегида (Sigma-Aldrich, США) на PBS (Biolot, Россия) в течение не менее 2 дней.

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание маркеров микроглии IBA-1 и астроглии GFAP проводили с использованием совместной инкубации с соответствующими первичными антителами. Плавающие срезы сначала инкубировали в PBS, содержащем 0.3% тритон Х-100 (PBS-T), три раза в течение 5 мин, затем в блокирующем растворе (5% нормальная сыворотка осла (Sigma-Aldrich, США) в PBS-T) в течение 1 ч и затем в блокирующем растворе со смесью первичных антител (кроличьи поликлональные анти-IBA-1 (Wako, Япония) и мышиный моноклональный анти-GFAP-Cy3 конъюгат 1 : 400 (Sigma-Aldrich, США); оба в разведении 1 : 400) при 4°С в течение ночи. На следующий день срезы промывали и инкубировали с антителами осла к IgG кролика, конъюгированными с Alexa Fluor-488 (Life Technologies, США). Срезы заключали в Prolong Gold с DAPI (Thermo Fisher Scientific, США) и хранили при 4°C.

Области неокортекса (париетальная кора) и стриатума, в которых анализировали состояние глиальных клеток показаны на рис. 1.

Рис. 1.

Схематическое изображение зон мозга, которые были проанализированы в настоящем исследовании.

Подсчет клеток микроглии. Для количественного анализа получали изображения с помощью микроскопа Keyence 6000EZ (Япония). Изображения стриатума были получены с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 700 (Германия).

Параметры изображения были установлены таким образом, чтобы избежать насыщения сигнала. Обработку изображений и количественный анализ изменений морфологии микроглии выполняли с использованием программного обеспечения ImageJ/Fiji (версия 1.51, NIH, США) как описано ранее [6].

Выделение РНК и синтез кДНК. После отбора образцов головного мозга собирали фрагменты серого вещества из соматосенсорной области неокортекса, обонятельных луковиц и стриатума. Тотальную РНК выделяли из образцов мозга и растворяли в ExtractRNA (Evrogen, Москва, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Общую концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Для удаления следов геномной ДНК 1 мкг общей РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific, США).

кДНК первой цепи синтезировали с использованием набора для обратной транскриптазы MMLV (Evrogen, Москва, Россия) со случайными декапраймерами в соответствии с инструкцией производителя.

Количественная ПЦР в реальном времени. кПЦР проводили с использованием 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США). Температурный профиль: (1) 95°C в течение 10 мин, (2) 40 циклов при 95°C в течение 15 с, 63°C в течение 30 с и 72°C в течение 30 с и (3) анализ кривой плавления. Для приготовления реакционных смесей использовали HS-SYBR + ROX (Evrogen, Москва, Россия).

Экспрессию генов рассчитывали как RQ = 2^–ΔΔCt; экспрессия была нормализована к экспрессии гена Trappc10, который, согласно нашим предыдущим транскриптомным данным, является одним из генов с наиболее стабильной экспрессией в изученных условиях [6]. Экспрессия всех генов была нормализована на внешний калибровочный образец. Последовательности использованных в работе праймеров были взяты из предыдущих публикаций [6].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дегенерация холинергических нейронов в мозге, как известно, сопровождается нарушениями памяти. Вместе с тем, холинергическая сигнализация имеет важное значение для контроля состояния глиальных клеток в ЦНС, поскольку микроглия и астроциты могут экспрессировать никотиновые рецепторы ацетилхолина, содержащие субъединицу α7 [8]. Взаимодействие ацетилхолина с этими рецепторами снижает провоспалительный ответ микроглии. Мы предположили, что холинергический дефицит, возникающий в мозге в результате введения IgS, может способствовать активации микроглии не только в гиппокампе, но и в других структурах мозга, прилегающих к боковым желудочкам и получающих холинергическую иннервацию из базальных ядер.

В контрольных условиях клетки микроглии в стриатуме и неокортексе имели небольшие тела и тонкие разветвленные отростки (рис. 2a, 3a), то есть морфологию микроглии, которая типична для покоящихся клеток. Во всех исследованных областях астроциты также имели вид неактивированных покоящихся клеток с небольшими сомами и тонкими разветвленными отростками (рис. 2б, 3б).

Рис. 2.

Влияние внутрижелудочкового введения 192IgG-сапорина на морфологию микроглии (а, б) и астроцитов (в, г) в стриатуме. Представлены фотографии срезов стриатума контрольных (а, в) крыс и крыс, которым вводили иммунотоксин (б, г). Морфология глиальных клеток осталась практически неизменной через 1.5 мес. после введения иммунотоксина. Увеличение 200×, шкала 100 мкм.

Рис. 3.

Влияние внутрижелудочкового введения 192IgG-сапорина на морфологию микроглии (а, б) и астроцитов (в, г) в париетальной коре. Представлены фотографии срезов неокортекса контрольных (а, в) крыс и крыс, которым вводили иммунотоксин (б, г). Подсчет числа микроглиальных клеток показал, что через 1.5 мес. после введения иммунотоксина наблюдается увеличение числа микроглиальных клеток (д). * – статистически значимые отличия по сравнению с контролем, р < 0.05 (тест Манна–Уитни). Увеличение 400×, шкала 100 мкм.

Через полтора месяца после введения иммунотоксина микроглиальные клетки в стриатуме сохраняли характерную морфологию с тонкими ветвящимися отростками (рис. 2б). Окрашивание на GFAP также показало, что функциональный статус астроцитов в этом отделе мозга не меняется (рис. 2г).

В отличие от стриатума, в исследованном отделе неокортекса мы обнаружили увеличение числа клеток микроглии (значимое различие между контролем (n = 13) и IgG-сапорином (n = = 12), тест Крускала–Уоллиса, p = 0.014) (рис. 3д), что также сопровождалось утолщением и укорочением микроглиальных отростков (рис. 3б). Оценка состояния астроцитов по окрашиванию на GFAP не выявила серьезных изменений в состоянии этих клеток через 1.5 мес. после введения иммунотоксина.

Ранее мы показали [6], что изменение состояния микроглии в гиппокампе может также сопровождаться изменением уровня мРНК генов, экспрессирующихся в микроглиальных клетках, а также в клетках кровеносных сосудов мозга. Поэтому в этой работе мы проанализировали как внутрижелудочковая инъекция иммунотоксина влияет на уровень молекулярных маркеров, характеризующих состояние клеток. Оказалось, что в париетальной области неокортекса происходит почти двукратное увеличение экспрессии маркера микроглии Ncf1 после воздействия иммунотоксина, тогда как другой маркер микроглии Cx3Cr1 и маркер нейровоспаления Il1β остались неизменными (рис. 3а). Анализ экспрессии Ncf1 и Cx3Cr1 в энторинальной коре также выявил достоверный рост экспрессии Ncf1 через 1.5 мес. после введения иммунотоксина, хотя это увеличение было менее значительным. Анализ экспрессии маркеров состояния сосудов не выявил никаких изменений ни в одном из исследованных отделов неокортекса.

Мы также проанализировали экспрессию упомянутых маркеров в стриатуме и клетках обонятельных луковиц, которые получают холинергическую иннервацию от клеток медиального септума и диагональной полоски Брока. Оказалось, что изменений в экспрессии микроглиальных маркеров в стриатуме и обонятельных луковицах не происходит после действия иммунотоксина (рис. 4а, б). В обонятельных луковицах также остается неизменной экспрессия маркеров клеток сосудистого русла, в то время как уровень Slc22a8 достоверно снижается в стриатуме (рис. 5а, б).

Рис. 4.

Влияние внутрижелудочкового введения 192IgG-сапорина на экспрессию микроглиальных маркеров (Ncf1, Cx3Cr1), Il1β, и сосудистых маркеров (Ptprb, Slc22a8) в париетальной (а) и энторинальной коре (б). Данные представлены в виде среднее ± ошибка среднего. * – значимые отличия по сравнению с контролем (p < 0.05, тест Манна–Уитни).

Рис. 5.

Влияние внутрижелудочкового введения 192IgG-сапорина на экспрессию микроглиальных маркеров (Ncf1, Cx3Cr1) и сосудистых маркеров (Ptprb, Slc22a8) в стриатуме (а) и обонятельных луковицах (б). Данные представлены в виде среднее ± ошибка среднего. * – значимые отличия по сравнению с контролем (p < 0.05, тест Манна–Уитни).

192IgG-сапорин достаточно часто используется для индукции селективной гибели холинергических нейронов в базальных ядрах. Однако недавние работы говорят о том, что этот иммунотоксин при внутрижелудочковом введении приводит не только к гибели холинергических нейронов, но также развитию микроглиоза и гибели пирамидных нейронов в зоне СА3 дорсального гиппокампа [6]. Проведенное исследование говорит о том, что при внутрижелудочковом введении иммунотоксина наблюдается также ряд изменений в париетальной коре и стриатуме. Полученные данные свидетельствуют, что через 1.5 мес. после введения иммунотоксина происходит увеличение числа микроглиальных клеток в упомянутой области неокортекса. Оценка состояния микроглии по экспрессии маркерных генов выявила значимые изменения только в экспрессии гена Ncf1. В предыдущей работе увеличение экспрессии этого гена сопровождало активацию микроглии в дорсальном гиппокампе [6]. Принимая во внимание эти данные и результаты, полученные в настоящей работе, можно предположить, что некоторая активация микроглии также происходит в энторинальной коре, где было обнаружено увеличение экспрессии Ncf1 у животных с индуцированным IgS холинергическим дефицитом. Важно отметить, что изменений в экспрессии Cx3Cr1, Ptprb, и Slc22a8 не наблюдалось в исследованных отделах коры, косвенно указывая на то, что, по видимому, не происходит существенных изменений в состоянии сосудистого русла в этих структурах.

Обонятельные луковицы иннервируются холинергическими волокнами, приходящими из диагональной полоски Брока [9]. Однако внутрижелудочковое введение иммунотоксина не приводило к каким-либо изменениям в экспрессии генов, ассоциированных с микроглией и кровеносными сосудами. Последнее, вероятно, говорит о том, что в обонятельных луковицах дефицит АХ не приводит к активации микроглии и изменению состояния сосудов и, скорее всего, не является критическим фактором, регулирующим состояние микроглии, как ранее было показано для микроглии в гиппокампе.

Важным аспектом сравнения эффектов иммунотоксина в разных отделах неокортекса является то, что энторинальная кора получает холинергический вход из медиального септального ядра и ядра вертикального лимба диагональной полоски Брока [10, 11], в то время как париетальная кора получает вход из безымянной субстанции и базального ядра Мейнерта [12]. Внутрижелудочковое введение приводит к гибели холинергических нейронов медиального септума [4, 6] и, возможно, может приводить к дегенерации холинергических аксонов в париетальной коре, т. к. последняя плотно прилегает к желудочкам. В любом случае потеря холинергической иннервации в обоих отделах неокортекса приводит к некоторой активации микроглии, лишний раз указывая на то, что АХ может являться важным регулятором состояния микроглии не только в гиппокампе, но и в неокортексе. Присутствие избыточного числа микроглиоцитов в условиях дефицита холинергической нейротрансмиссии может быть дополнительным фактором, способствующим развитию амнезии как в исследованной модели, так и при нейродегенеративных заболеваниях.