Нейрохимия, 2021, T. 38, № 1, стр. 21-28

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время болезнь Паркинсона (БП) является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний среди людей старших возрастных групп. Симптомы БП развиваются вследствие селективной гибели ДА-нейронов в черной субстанции среднего мозга, связанной с образованием избытка свободных радикалов и развитием окислительного стресса [1, 2]. Роль свободнорадикальных продуктов и окислительного стресса в процессах нейродегенерации, в частности при БП, изучена достаточно полно, тогда как исследование систем поддержания редокс-баланса начало привлекать внимание исследователей только в последние годы [3–7], особенно после обобщения данных о том, что применение различных антиоксидантов с целью связывания избытка свободных радикалов в нервной ткани показало высокую эффективность в условиях эксперимента, но выявило недостаточную эффективность антиоксидантной терапии в условиях клиники. Исходя из этого, изучение изменений антиоксидантной защиты и тиол-дисульфидного баланса при БП и других видах нейродегенеративных нарушений приобретают все большую актуальность.

Доказательством важной роли восстановительного потенциала системы глутатиона в развитии окислительного стресса в мозге является уменьшение содержания GSH в посмертных образцах ткани мозга пациентов с БП по сравнению с тканью мозга пациентов без неврологической симптоматики [8]. Активация систем антиоксидантной защиты, которая сопровождается повышением уровня GSH, защищает ДА-нейроны от гибели [9]. Установлены нарушения системы редокс потенциала системы глутатиона в экспериментальной модели БП на крысах, вызванной введением ротенона [10].

Маркерами окислительного стресса, которые наиболее часто обнаруживаются в посмертных экстрактах тканей пациентов с БП, являются белковые карбонилы, аддукты липопереокисления, продукты окисления ДНК [11]. Однако до сих пор не совсем ясно, являются ли эти изменения причиной или следствием нарушения функций белков и клеточных процессов. К настоящему времени накоплено много доказательств в пользу того, что ковалентные модификации цистеиновых остатков могут более эффективно влиять на повреждения тканей при окислительном стрессе при нейродегенеративных патологиях человека, чем реакции, связанные со свободными радикалами [12]. Реакции глутатионилирования/деглутатионилирования регулируются за счет экспрессии и активности глутаредоксина (Grx) и доступности субстрата GSH, который необходим для химического восстановления Grx.

Исходя из этого, мы провели исследование изменений показателей свободнорадикального окисления и тиол-дисульфидного статуса в структурах головного мозга в экспериментальной модели БП на крысах, осуществляемой посредством введения животным ротенона. В качестве нейромодуляторов использовали производные пантотеновой кислоты, которые проявили нейропротекторную активность в моделях алюминиевого нейротоксикоза, ишемии-реперфузии мозга и других [13].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные модели были выполнены на самках крыс линии Wistar CRL: (WI) WUBR массой 180–200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария в соответствии с существующими нормами содержания лабораторных животных.

Ротенон (Р) вводили ежедневно в течение 6 нед. (2.5 мг/мг, подкожно, растворитель – смесь DMSO с подсолнечным маслом) [14]. С 5 нед. эксперимента на протяжении 14 дней ежедневно вводили производные пантотеновой кислоты (200 мг/кг, внутрижелудочно) – D-пантенол (ПЛ), D-пантетин (ПТ) и гомопантотенат кальция (ГПК). Крысам контрольной группы вводили раствор DMSO в подсолнечном масле. На 43-й день эксперимента крыс декапитировали, извлекали головной мозг и препарировали на холоде, выделяя базальные ганглии, большие полушария и гиппокамп. Ткани помещали в жидкий азот и хранили при температуре –82°С.

Окислительный стресс оценивали по общей антиоксидантной активности (ОАА), определяемой по восстановлению катион-радикалов 2-2'-азино-бис–(3-этил-бензотиазолилсульфоновой кислоты) [15], количеству общих гидропероксидов, измеряемых колориметрическим методом с применением ксиленолового оранжевого [16]. При определении конечных продуктов перекисного окисления липидов использовали методические указания [17, 18], которые позволяют выявлять содержание свободных и белковосвязанных тиобарбитурат-реагирующих соединений (ТБКРС), а также спонтанный и железоаскорбат-индуцированный уровни ТБКРС.

Для определения содержания белковых тиолов (PSH) и дисульфидов (PSSP) в гомогенате ткани использовали спектрофотометрический метод с использованием реактива Эллмана [19, 20].

Содержание общего, восстановленного и окисленного глутатиона определяли ферментативным рециклическим методом с использованием глутатионредуктазы [21, 22]. Активность глутатионпероксидазы (GPx, КФ 1.11.1.9), глутатион-S-трансферазы (GST, КФ 2.5.1.18) и глутатионредуктазы (GR, КФ 1.6.4.2) определяли кинетическими спектрофотометрическими методами [23–25] соответственно. Содержание S-глутатионилированных белков определяли спектрофлуориметрическим методом [26].

Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли с использованием программ Microsoft Excel 2016, GraphPad Prism 6.0. Экспериментальные данные представляли в виде M ± SEM, где М – среднее значение, SEM – стандартная ошибка среднего. Достоверность межгрупповых различий оценивали используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с применением теста Тьюки. Во всех случаях статистически значимыми считали различия при значении р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Длительное введение крысам ротенона привело к активации ПОЛ, о чем свидетельствует повышение содержания всех изученных нами фракций ТБКРС в структурах мозга (табл. 1). Наболее выраженное повышение содержания ТБКРС отмечалось в базальных ганглиях: белковосвязанных форм ТБКРС на 41%, спонтанного уровня ТБКРС на 31% и Fe/аскорбат-индуцированного уровня на 28% (p < 0.05), тогда как в гиппокампе содержание всех форм ТБКРС повысилось на 35–34–16–46%, в больших полушариях – на 17– 16–9–28% соответственно. Это подтверждает данные литературы о преимущественном повреждающем действии ротенона на базальные ганглии [1, 14]. ПЛ и ПТ способствовали достоверному снижению содержания всех форм ТБКРС до уровня контроля во всех структурах мозга. Введение ГПК крысам на фоне ротенона не привело к заметным изменениям содержания всех изученных форм ТБКРС.

Подтверждением наличия окислительного стресса при действии ротенона явилось повышение содержания общих гидропероксидов и снижение ОАА в структурах мозга крыс (табл. 2). Наиболее выраженные изменения также были отмечены в базальных ганглиях, где наблюдалось увеличение гидропероксидов на 28% и снижение ОАА на 16%, в то время как содержание гидропероксидов повысилось на 22 и 18%, ОАА снизилась на 8 и 5% в гиппокампе и больших полушариях соответственно. Введение животным ПТ и ПЛ на фоне ротенона способствовало нормализации данных показателей, тогда как влияние ГПК было значительно слабее.

Изучение изменений системы глутатиона показало, что введение ротенона сопровождалось снижением содержания GSH на 24%, повышением уровня GSSG на 11% и снижением соотношения GSH/GSSG на 32% в базальных ганглиях (табл. 3). В гиппокампе уровень GSH и соотношение GSH/GSSG снизились на 10 и 20%, а содержание GSSG повысилось на 14%. В больших полушариях содержание GSH при этом снизилось лишь на 5% и соотношение GSH/GSSG – на 8% при отсутствии изменений уровня GSSG. Введение ПЛ и ПТ на фоне ротенона способствовало восстановлению уровня GSH и GSSG, а также соотношения GSH/GSSG в базальных ганглиях и других изученнных структурах мозга. Действие ГПК было более слабым.

Введение ротенона способствовало увеличению активности глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы и глутатионпероксидазы в структурах мозга (табл. 4). В базальных ганглиях эти изменения были более выраженными, чем в других структурах: активность GST повысилась на 15%, GPx – на 20%, GR – на 30% (р < 0.05) выше значений в контрольной группе (p < 0.05). Введение животным предшественников биосинтеза КоА ПЛ и ПТ приводило к снижению активности данных ферментов, не достигшему, однако, уровня контроля. ГПК практически не оказал влияния на их активность.

В отношении белковых тиолов и дисульфидов воздействие ротенона также было более выраженным в базальных ганглиях, где наблюдалось снижение содержания PSH на 19% и увеличение содержания PSSP на 30% со снижением соотношения PSH/PSSP на 42%, тогда как в больших полушариях и гиппокампе эти показатели изменились на 10–25–30% и 3–18–20% соответственно (табл. 5). Обращает на себя внимание тот факт, что если в базальных ганглиях нормализующее действие на уровень белковых тиолов и дисульфидов оказали только ПЛ и ПТ, то в больших полушариях и гиппокампе показатели белкового тиол-дисульфидного баланса возвратились к контрольным значениям при действии всех изученных нами производных пантотеновой кислоты.

Изменения в системе глутатиона и белковых тиолов и дисульфидов при действии ротенона сопровождались повышением содержания S-глутатионилированных белков на 36% в базальных ганглиях и на 18–19% соответственно в больших полушариях и гиппокампе (табл. 5). Действие ПЛ и ПТ привело к ослаблению эффекта ротенона на данный показатель, тогда как ГПК практически не оказал влияния во всех структурах мозга.

ОБСУЖДЕНИЕ

Воздействие ротенона – ингибитора комплекса I электронтранспортной цепи митохондрий – приводит к развитию окислительного стресса в структурах мозга, причем наиболее выраженно это проявляется в базальных ганглиях [3, 7]. Так, именно в этой структуре мозга, по нашим данным, отмечается повышение активности ПОЛ и снижение общей антиоксидантной активности что свидетельствует о значительном повышении процессов образования свободных радикалов и угнетении систем антиоксидантной защиты. Снижение уровня восстановленного глутатиона, повлекшее снижение соотношения GSH/GSSG, уменьшение содержания белковых тиолов и повышение уровня S-глутатионилированных белков в этой структуре мозга, активацию GST, очевидно, являются следствием активного участия системы глутатиона в поддержании окислительно-восстановительного баланса на фоне действия ротенона [27]. Это подтверждается данными корреляционного анализа, показавшего наличие тесной взаимосвязи между снижением редокс-соотношения глутатиона и повышением уровня его дисульфидной формы (r = = ‒0.8762, p < 0.05) при действии ротенона.

Об участии пантотеновой кислоты в поддержании тиольного и иммунного баланса в разных тканях указывалось в работе [28]. Нейропротекторное действие производных пантотеновой кислоты было установлено при ишемии головного мозга [29, 30], в алюминиевой модели нейродегенерации [13], а совсем недавно [31] появились сведения о важной роли пантотената и пантетина в процессах миелинизации в нервной ткани. Нами показано, что ПЛ и ПТ способствуют уменьшению проявлений окислительного стресса, повышению соотношения GSH/GSSG, снижению уровня S-глутатионилированных белков во всех структурах мозга при действии ротенона. Наиболее выраженное влияние данных препаратов наблюдается в базальных ганглиях. При этом наблюдается тесная взаимосвязь между возвращениями соотношения GSH/GSSG к контрольным значениям не только с изменениями уровня дисульфидной формы глутатиона (r = –0.8333, p < 0.05), но и общей антиоксидантной активности (r = –0.5476, p < 0.05), что подтверждает наличие прямого антиоксидантного действия ПЛ и ПТ через систему глутатиона. Выявленная положительная корреляция между активностью глутатионпероксидазы и редокс-соотношением глутатиона (r = 0.6190, p < 0.05) дает основание полагать, что протекторное действие ПЛ при ротеноновом нейротоксикозе реализуется преимущественно через изменения активности глутатионпероксидазы.

Механизмы нейропротекторного действия ПЛ и ПТ на фоне экспериментального нейротоксикоза, по-видимому, связаны с их способностью повышать восстановительный потенциал системы глутатиона и таким образом уменьшать проявления окислительного стресса и осуществляются в значительной степени во взаимосвязи с изменениями биосинтеза СоА [13]. Об этом свидетельствует защитное действие ПЛ и ПТ, которые являются предшественниками биосинтеза КоА, тогда как ГПК, производное пантотеновой кислоты, в которой β-аланиновый остаток замещен на ГАМК, и она не может превращаться в КоА, такого влияния не оказывает. В то же время ГПК успешно восстанавливает белковый тиол-дисульфидный баланс не только в базальных ганглиях, но и в больших полушариях и гиппокампе. Это может быть связано с эффектами ГПК как соединения с выраженной нейротропной активностью, осуществляемой не столько через модуляцию окислительно-восстановительного баланса, сколько через воздействие на нейромедиаторные системы мозга, в частности через воздействие на ГАМКа-рецепторы [32].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нарушения окислительно-восстановительного баланса в мозге в экспериментальной модели БП сопровождаются не только активацией ПОЛ, но и выраженным угнетением антиоксидантной защиты, проявляющимся в уменьшении общей антиоксидантной активности, значительном снижении восстановительного потенциала системы глутатиона. Эти изменения при действии ротенона проявляются в наибольшей степени в базальных ганглиях мозга. Механизмы нейропротекторного действия ПЛ и ПТ, осуществляемые во взаимосвязи с изменениями биосинтеза СоА на фоне экспериментального нейротоксикоза, очевидно, связаны с их способностью повышать восстановительный потенциал системы глутатиона и таким образом уменьшать проявления окислительного стресса.