Нейрохимия, 2021, T. 38, № 3, стр. 278-288

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Альцгеймера (БА) – неизлечимое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание людей старшего возраста, которое становится основной причиной сенильной деменции [1, 2]. Клинически БА проявляется дефицитом памяти, изменениями личности и депрессией, нарушением когнитивных функций, утратой способности ориентироваться в обстановке и ухаживать за собой. Патогенез БА характеризуется усиленным образованием амилоидных бляшек, гиперфосфорилированием тау-белка, митохондриальной дисфункцией, окислительным стрессом и дефицитом ацетилхолина [3]. Несмотря на то, что в доклинических исследованиях регулярно выявляются перспективные лекарственные препараты для лечения БА, клинические испытания, как правило, не подтверждают их эффективность [4]. В значительной степени это обусловлено тем, что в течение последних трех десятилетий центральное место в поисках эффективных методов лечения занимали подходы, нацеленные на пути, связанные с накоплением β-амилоида (Aβ). Однако ни один из нацеленных на Aβ препаратов при клинических испытаниях не проявил ощутимую терапевтическую эффективность. Учитывая сложность патогенеза этого комплексного многофакторного заболевания, в настоящее время ведется активный поиск альтернативных походов к лечению БА. После обнаружения в префронтальной коре головного мозга пациентов с БА и на мышиных моделях заболевания повышенной активности стриатумспецифичной протеинтирозинфосфатазы (STEP), модуляция уровней STEP или подавление ее активности рассматривается как один из перспективных подходов к разработке новых способов лечения БА [5, 6].

Семейство протеинтирозинфосфатаз STEP представлено как цитозольными (STEP46), так и ассоциированными с мембранами (STEP61) белками, которые кодируются одним геном PTPN5 и образуются путем альтернативного сплайсинга [7]. PTPN5 экспрессируется преимущественно в нейронах базальных ганглиев, гиппокампа, коры головного мозга и родственных структурах [8]. STEP61 модулирует функции синапсов и пластичность, регулируя трафик рецепторов глутамата – N-метил-D-аспартата (NMDAR) и α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолепропионовой кислоты (AMPAR), а также активность ERK1/2, p38, Fyn и Pyk2.

Активность STEP61 регулируют несколько путей, в том числе – сигнальные каскады глутамата, дофамина и нейротрофического фактора мозга (BDNF), изменения которых регистрируются при развитии БА. Недавние исследования показали, что Aβ влияет на STEP – его накопление приводит к повышению ее уровня и активности, что, в свою очередь, нарушает доставку глутаматных рецепторов к нейрональной мембране и от нее [6, 9]. Считается, что STEP противодействует развитию долговременной потенциации (LTP) и ограничивает долговременную память [10]. Aβ усиливает долговременную депрессию (LTD) в области зубчатой извилины гиппокампа, активируя при этом STEP [11]. Таким образом, как высокие, так и низкие уровни STEP нарушают функции синапсов и способствуют нарушениям поведения и обучения. С повышением уровня и активности STEP связывают снижение когнитивных функций при старении: такие изменения были выявлены в гиппокампе старых мышей и крыс с дефицитом памяти, у старых макак-резусов и людей с умеренными когнитивными расстройствами, вызванными амнезией [12]. Высокие уровни STEP, помимо людей с БА, выявляются в посмертных образцах пациентов с болезнью Паркинсона и шизофренией, а также в моделях на животных с синдромом ломкой Х-хромосомы [13–15]. При этом при ряде других патологических состояний, включая ишемию, хорею Хантингтона, злоупотребление алкоголем и стрессовые расстройства выявляется пониженный уровень активности STEP [6].

Показано, что генетическое снижение уровня STEP [16] или фармакологическое ингибирование ее активности [5] способны улучшить память у грызунов – моделей БА [12]. Было установлено, что специфическим ингибитором STEP является гидрохлорид 8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепин-6-амина (известный как TC-2153), который образует обратимую ковалентную связь с цистеином в каталитическом центре STEP [5]. Впервые это соединение было синтезировано в Новосибирском институте органической химии [17] и представлено Куликовым и его коллегами в качестве антидепрессанта [18]. Позднее было показано [5], что кратковременное воздействие TC-2153 восстанавливает когнитивные нарушения и дефицит памяти у трансгенных мышей – модели ранней формы БА (мыши 3xTg-AD), но при этом не влияет на уровень Aβ и тау протеина в мозге этих животных. Такие результаты подтвердили то, что STEP является потенциальной терапевтической мишенью при БА. Профилактика и лечение БА предполагают продолжительное воздействие препаратов, однако эффекты длительного подавления STEP с помощью TC-2153 ранее не изучались. Это определяет актуальность исследования долгосрочных эффектов ингибирования STEP на состояние когнитивных функций на различных биологических моделях БА, прежде всего, – на моделях наиболее распространенной (>95% случаев) спорадической формы этого заболевания.

В настоящем исследовании мы оценили эффекты длительного приема TC-2153 на крысах линии OXYS – уникальной генетической модели преждевременного старения, одним из проявлений которого становится развитие признаков БА [19–22]. При отсутствии в геноме мутаций, специфичных для ранней (семейной) формы БА, у крыс OXYS спонтанно развиваются все основные признаки и воспроизводятся стадии заболевания [19]. Поведенческие изменения, дефицит памяти и снижение способности к обучению у крыс OXYS регистрируются в возрасте 3–5 мес. одновременно с первыми признаками нейродегенерации: нарушением синапсов, гибелью нейронов, дисфункцией митохондрий и гиперфосфорилированием тау-белка в гиппокампе и коре головного мозга. С возрастом у крыс OXYS нейродегенеративные изменения усиливаются и сопровождаются избыточной продукцией белка-предшественника амилоида (APP), накоплением к 12 мес. пептида Aβ и связанными с ним ярко выраженными патологическими изменениями к возрасту 18 мес. [19, 23]. Недавно мы показали, что развитие признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне активации сигнального пути p38 MAPK [24]. Поскольку STEP регулирует этот путь, действуя как фосфатаза p38, можно ожидать изменений ее активности в мозге крыс OXYS. Целью настоящей работы было исследование воздействия TC-2153 на развитие у крыс OXYS признаков БА в период их активной прогрессии – в возрастной период от 9 до 13 мес. Оценивали поведенческие проявления БА и накопление Aβ в коре и гиппокампе животных, а также уровни в них белка STEP61.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные и воздействие на них. Самцы преждевременно стареющих крыс OXYS в возрасте 9 мес. (~350 г) и одновозрастные крысы Вистар (контроль) были получены в ЦКП Генофонды лабораторных животных Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, Россия, [RFMEFI61914X0005 и RFMEFI61914X0010]; линия крыс OXYS была получена из линии крыс Вистар в Институте цитологии и генетики СО РАН, как было описано ранее [19, 25]. Крыс содержали в стандартных условиях вивария (4–5 самцов в одной пластиковой клетке, наполнитель – опилки) в фиксированном режиме освещенности (цикл 12 ч свет/12 ч темнота, свет включался в 8 ч утра). Животные имели свободный доступ к стандартному гранулированному корму (ПК-120-1; ООО “Лабораторснаб”, Москва, Россия) и воде. Ни одно животное не умерло в течение эксперимента. Дизайн эксперимента представлен на рис. 1.

Рис. 1.

Схема эксперимента.

Для оценки влияния перорального введения ТС-2153 (в возрасте от 9 до 13 мес.) на прогрессию признаков БА у крыс OXYS мы случайным образом методом простой рандомизации распределили 9-месячных самцов крыс OXYS в одну из двух групп (по 22 животных в группе). Набор экспериментальной группы осуществлялся не экспериментатором, а сотрудниками ЦКП Генофонды лабораторных животных. Размер групп (по 22 животных в экспериментальной (OXYS + TC-2153), интактной (OXYS) и контрольной (Вистар) группах) является оптимальным для проведения адекватных поведенческих исследований.

Ранее было показано, что ТС-2153 эффективен как для перорального, так и для внутрибрюшинного введения [5, 17, 18]. ТС-2153 разводили в 2% Tween 20 до получения концентрации 200 мг/мл непосредственно перед его введением. Далее соответствующее количество полученного раствора давали с сухариком для достижения дозировки 10 мг на кг массы тела. После этого каждая крыса получала по одному сухарику (1 см³) с добавлением ТС-2153 индивидуально. Крысы контрольной группы получали стандартный рацион + один сухарик без ТС-2153.

Исследование поведения животных. Влияние приема препарата TC-2153 на поведение животных оценивали с помощью тестов в следующем порядке: уровень тревожности в тесте “Приподнятый крестообразный лабиринт”, двигательная и исследовательская активность в тесте “Открытое поле”, обучение и память в тесте “Водный лабиринт Морриса”; каждое животное наблюдалось в каждом тесте только один раз. Каждый параметр в тестах оценивался наблюдателем вручную. Все тесты проводились в период времени с 10 до 14 ч во избежание флуктуаций поведения, вносимых суточными ритмами.

Тест “Приподнятый крестообразный лабиринт”. Уровень тревожности интактных крыс OXYS и Вистар, а также крыс OXYS, получавших TC-2153, оценивали в тесте “Приподнятый крестообразный лабиринт” (n = 22 в группе). Установка сделана из непрозрачного оргстекла и представляет собой 4 рукава – два противоположных “открытых рукава” без стенок (50 × 10 см) и два “закрытых рукава” того же размера, но со стенками высотой 40 см. Каждый рукав был разлинован на пять равных квадратов (10 × 10 см). Четыре рукава соединялись центральным квадратом (100 см²). Установка была приподнята на 50 см над уровнем пола. Животное помещали в центральный квадрат крестообразного лабиринта и в течение 5 мин регистрировали его поведение. Оценивали количество входов в рукава лабиринта, пройденную дистанцию и время, проведенное в них. Меньшее количество времени, проведенного в открытых рукавах, указывало на повышенный уровень тревожности.

Тест “Открытое поле”. Тест “Открытое поле” проводили через 48 часов после завершения теста “Приподнятый крестообразный лабиринт” для оценки двигательной и исследовательской активности интактных крыс OXYS и Вистар, а также крыс OXYS, получавших TC-2153 (n = 22 в группе). Установка представляла собой закрытую квадратную арену из непрозрачного оргстекла (100 × 100 см), окруженную стенками высотой 40 см. Арена была расчерчена линиями на 100 равных квадратов. Центральная область была определена как квадрат 40 × 40 см. Центральный источник света на потолке мощностью 100 Вт обеспечивал постоянное освещение в темной комнате. Каждую крысу помещали в один и тот же угол арены, обращенный в одну и ту же сторону, и позволяли свободно исследовать арену в течение 5 минут. Двигательную и исследовательскую активность оценивали путем подсчета пройденной дистанции и количества совершенных животными вертикальных стоек. Кроме того, уровень тревожности оценивали, фиксируя время до первого выхода в центральную область; животное находилось в центральной области, если все четыре лапы находились в ней.

Тест “Водный лабиринт Морриса”. Тест “Водный лабиринт Морриса” [26] был использован для оценки гиппокамп-зависимой пространственной памяти крыс (n = 8 в группе). Животным было необходимо найти платформу в бассейне с водой, используя внешние визуальные стимулы. Поведенческое тестирование проводилось в возрасте с 12.5 до 13 мес., как было описано ранее [23]. Животных тестировали в круглом бассейне, платформа была погружена на 2 см ниже поверхности воды, в воде было растворено сухое молоко для того, чтобы скрыть платформу. Температура воды составляла 22 ± 2°С. Были обозначены две главные оси лабиринта, разделяющие арену на четыре равных сектора. Платформа располагалась в середине первого сектора в течение всего 5-дневного периода обучения. Тестирование проводилось в течение пяти последовательных дней с четырьмя попытками в день, по одной попытке каждый день с каждой из четырех возможных стартовых позиций. Каждая попытка длилась либо 70 с, либо заканчивалась, когда животное находило скрытую платформу. Долговременная память количественно оценивалась на 6 день тестирования, когда платформа была убрана из бассейна. Животным предоставлялось 70 с для исследования бассейна. Фиксировалось время, проведенное животным в секторе, где раннее располагалась платформа. Каждая попытка записывалась на камеру и обрабатывалась наблюдателем вручную.

Забор и хранение образцов. После окончания поведенческих тестов животных анестезировали CO₂ и декапитировали. Для иммуноферментного анализа (ИФА) и вестерн-блот анализа гиппокамп и префронтальную кору быстро выделяли, помещали в микроцентрифужные пробирки для выделения белка и замораживали в жидком азоте. Образцы хранили при температуре –70°С до проведения анализа.

Замороженные образцы гиппокампа и префронтальной коры интактных крыс OXYS и Вистар, а также крыс OXYS, получавших TC-2153, (n = 6–8 в группе) гомогенизировали в лизирующем буфере с RIPA (50 мМ Tris-HCl pH 7.4, 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолат натрия, 0.1% SDS, 1 мМ EDTA) с добавлением смеси ингибиторов протеаз (№ P8340, Sigma-Aldrich, США). После инкубации в течение 20 мин на льду образцы центрифугировали при 12 000 g в течение 30 мин при 40°С, супернатанты переносили в новые пробирки. Концентрацию общего белка определяли количественно с помощью набора Bio-Rad Bradford Kit (Bio-Rad Laboratories, США).

Иммуноферментный анализ. Содержание амилоида-β1-42 (Аβ1-42) оценивали ИФА в соответствии с инструкциями производителя (Human/Rat ELISA Kit; Япония). Количественное определение проводили на основе измерения оптической плотности на спектрофотометре, концентрацию белка Аβ1-42 рассчитывали в пикограммах на миллиграмм общего белка гиппокампа или коры головного мозга.

Вестерн-блот анализ. Белки (по 30 мкг на дорожку) разделяли с помощью электрофореза на 10%-ном ПААГ SDS в Tris-глициновом буфере с pH 8.3 при комнатной температуре, затем переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования в течение 2 ч раствором 5% БСА (№ SLBJ8588V; Sigma-Aldrich, США) в PBS, содержащем 0.1% Tween 20, каждую мембрану инкубировали ночь с поликлональными мышиными антителами к STEP (разведение 1 : 1000; № sc-2031; Santa Cruz Biotechnology, США) при температуре 4°C. Далее проводили инкубирование с соответствующими вторичными антителами (разведение 1 : 5000; № ab6808; Abcam, США) в течение 2 ч при комнатной температуре, мембрану обрабатывали SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific Inc., США) в соответствии с инструкциями производителя. Интенсивность свечения бендов измерялась количественно в программе ImageJ (NIH, США). Для оценки содержания референсного белка использовали антитела к β-актину (разведение 1 : 5000; № ab1801; Abcam, США).

Статистический анализ. Результаты оценивались с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа (программное обеспечение Statistica 8.0; StatSoft, США). Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро–Уилка. Тест Ньюмана–Кейлса post hoc был применен к основным значимым эффектам и взаимодействиям для оценки межлинейных различий между интактными крысами OXYS и Wistar, а также между интактными и опытными крысами OXYS. Для зависимых парных сравнений был применен t-критерий для зависимых выборок. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (mean ± SEM). Различия считались статистически значимыми при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка поведения животных в тесте “Приподнятый крестообразный лабиринт”. Мы не выявили значимых различий в уровне тревожности крыс OXYS и Вистар в тесте “Приподнятый крестообразный лабиринт” (рис. 2а–г): действительно, количество выходов в открытые рукава лабиринта, проведенное в них время и пройденное расстояние достоверно не различались между линиями (p > 0.05). В то же время, препарат TC-2153 уменьшил время нахождения крыс OXYS в открытых рукавах лабиринта (p < 0.02; тест Ньюмана–Кейлса), что свидетельствует об увеличении уровня тревожности. Однако этот параметр значимо не различался между крысами OXYS, получавшими TC-2153, и контрольными крысами Вистар.

Рис. 2.

Влияние приема препарата TC-2153 на уровень тревожности крыс OXYS в тесте “Приподнятый крестообразный лабиринт”. Крысы OXYS совершали меньше входов в закрытые рукава (г) по сравнению с крысами Вистар. Пероральное введение ТС-2153 уменьшало время, проведенное крысами OXYS в открытых (а) и закрытых (г) рукавах, а также количество выходов в открытые (в) и закрытые (г) рукава. Крысы OXYS продемонстрировали значительно более низкое количество вертикальных стоек (е) по сравнению с крысами Вистар. TC-2153 значительно уменьшал количество пересеченных квадратов (д) и количество вертикальных стоек (е) у крыс OXYS. Данные представлены как mean ± ± SEM; *р < 0.05 для межлинейных различий; # р < 0.05 для эффектов приема ТС-2153. n = 22 животных в группе.

У крыс OXYS была значительно снижена двигательная активность: расстояние, пройденное в закрытых рукавах лабиринта, и количество вертикальных стоек было ниже, чем у крыс Вистар (p < 0.008 и p < 0.006 соответственно; тест Ньюмана–Кейлса). Прием препарата TC-2153 не повлиял на эти параметры у крыс OXYS. Исследовательская активность (выглядывания из закрытых рукавов, свешивания с открытых рукавов) не различалась между крысами OXYS и Вистар, и препарат TC-2153 не влиял на эти параметры.

Таким образом, мы не обнаружили достоверных различий в уровне тревожности между крысами OXYS и Вистар (рис. 1д–е), однако прием TC-2153 повышал уровень тревожности у крыс OXYS.

Поведение животных в тесте “Открытое поле”. Результаты теста “Открытое поле” представлены на рис. 3. Как и ожидалось, дисперсионный анализ показал, что крысы OXYS были значительно более пассивными, чем крысы Вистар того же возраста: количество пересеченных квадратов и количество вертикальных стоек были значительно ниже у крыс OXYS (F_1,45 = 13.4, p < 0.001 и F_1,45 = 10.0, p < 0.003 соответственно).

Рис. 3.

Влияние приема препарата TC-2153 на поведение крыс OXYS в тесте “Открытое поле”. Крысы OXYS демонстрировали значительно меньшее количество пересеченных квадратов (а) и вертикальных стоек (б) по сравнению с крысами Вистар. TC-2153 значительно уменьшал количество пересеченных квадратов (а) и вертикальных стоек (б) у крыс OXYS. Данные представлены как mean ± SEM; * p < 0.05 для межлинейных различий; # p < 0.05 для эффектов TC-2153. n = 22 животных в группе.

Время первого выхода в центральную область открытого поля ассоциировано с уровнем тревожности животных. Согласно результатам ANOVA-анализа, время выхода в центральную область было больше у крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар (F_1,45 = 5.7, p < 0.02), что может отражать повышенную тревожность крыс OXYS. Более низкая частота груминга может быть связана со сниженным уровнем тревожности и/или снижением активности. ANOVA-анализ показал, что частота груминга у крыс OXYS была немного ниже (F_1,45 = 3.9, p = 0.05) по сравнению с крысами Вистар.

Прием TC-2153 значительно снизил двигательную и исследовательскую активность крыс OXYS в тесте “Открытое поле”: уменьшил количество пересеченных квадратов и вертикальных стоек (F_1,36 = 4.1, p < 0.05 и F_1,37 = 5.1, p < 0.03 соответственно) – и не влиял на задержку выхода в центральную область открытого поля и на частоту груминга.

Исследование способности к обучению и памяти крыс в тесте “Водный лабиринт Морриса”. Результаты ANOVA-анализа показали лишь незначительное влияние генотипа (F_1,109 = 3.5, р = 0.064) на латентный период нахождения платформы, а post hoc анализ не выявил достоверных различий в способности к обучению между крысами OXYS и Вистар (рис. 4а): животные обеих линий научались находить скрытую под водой платформу в 1 (целевом) секторе уже на 2-й день обучения (р < < 0.05; t-тест для зависимых выборок). Крысы OXYS, получавшие ТС-2153, также научались находить скрытую платформу на 2-й день обучения (р < 0.006; t-тест для зависимых выборок). Закономерно, что латентный период нахождения платформы постепенно снижался к 5-му дню обучения у крыс обеих линий (F_4,109 = 26.0, р < 0.0001).

Рис. 4.

Влияние приема препарата TC-2153 на пространственную память крыс OXYS в тесте “Водный лабиринт Морриса”. Латентный период нахождения скрытой под водой платформы (а) снижался с 1-го по 5-й день обучения. TC-2153 увеличил время, проведенное крысами OXYS в 1 (целевом) секторе по сравнению с другими секторами (б) на 6-й день обучения, когда платформа была удалена. Время нахождения платформы (а) не различалось между группами животных. Данные представлены как mean ± SEM. Условные обозначения: различия ^p < 0.05 – для различий с предыдущим днем обучения; @p < 0.05 – для различий между временем, проведенном в целевом секторе, и другими секторами. Черная линия – средний процент времени в каждом из четырех секторов. n = 8 животных в группе.

Долговременную память оценивали на 6-й день, когда платформа была удалена, с помощью t-критерия для зависимых выборок. ANOVA-анализ не выявил межлинейных различий во времени, проведенном животными в целевом секторе на 6-й день тестирования (F_{1, 22} = 0.1, р = 0.74); однако крысы Вистар в пределах своей линии демонстрировали предпочтение целевого сектора остальным секторам (р < 0.04), что свидетельствует о запоминании животными месторасположения платформы (рис. 4б). Крысы OXYS, напротив, проводили примерно равное количество времени во всех четырех секторах (р = 0.58). Введение TC-2153 оказало благоприятное влияние на долговременную память животных: крысы OXYS, получавшие препарат, проводили значительно больше времени в целевом секторе по сравнению с другими секторами (р < 0.02).

Важно отметить, что время нахождения платформы достоверно не отличались между крысами OXYS и Вистар во все дни обучения и прием TC-2153 на это не оказывал влияния.

Влияние TC-2153 на уровень Аβ1-42 в гиппокампе и фронтальной коре. В этом исследовании мы провели оценку влияния приема TC-2153 с 9-месячного возраста на содержание Aβ1-42 в гиппокампе и фронтальной коре крыс OXYS. Результаты ANOVA-анализа показали, что содержание Aβ1-42 в гиппокампе и фронтальной коре у крыс OXYS было значительно выше, чем у крыс Вистар (F_1,18 = 146, p < 0.0001 и F_1,18 = 86, p < 0.0001 соответственно), и прием TC-2153 на содержание Aβ1-42 не влиял (F_1,18 = 0.38, p = 0.54 для гиппокампа и F_1,18 = 0.88, p = 0.36 для фронтальной коры): уровень Aβ1-42 в коре головного мозга и гиппокампе крыс OXYS оставался почти вдвое выше, чем у крыс Вистар (рис. 5а).

Рис. 5.

Уровни белков Aβ1-42 и изоформы STEP61 в коре головного мозга и гиппокампе интактных крыс OXYS и Вистар и крыс OXYS, получавших ТС-2153. Уровни Аβ1-42 (а) были выше в коре головного мозга и гиппокампе крыс O-XYS. Уровни STEP61 (б) не различались между крысами OXYS и Вистар в коре головного мозга и гиппокампе. Прием ТC-2153 не оказал влияния на содержание обоих исследуемых белков. Данные представлены как mean ± SEM; * р < 0.05 для межлинейных различий. n = 6 животных в группе.

Влияние TC-2153 на уровень белка STEP61 в коре головного мозга и гиппокампе крыс OXYS. Далее мы исследовали уровни изоформы STEP61 в коре головного мозга и гиппокампе методом вестерн-блот анализа (рис. 5б). ANOVA-анализ не выявил влияние фактора “генотип” на содержание изоформы STEP61 в коре (F_1,8 = 0.12, р = 0.73) и гиппокампе животных (F_1,10 = 0.31, р = 0.59). Прием TC-2153 не оказывал влияния на уровень белка STEP61 ни в одной из структур мозга крыс OXYS (F_1,8 = 0.39, p = 0.55 для коры и F_1,10 = 0.057, p = = 0.55 для гиппокампа).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изменения в поведении у крыс OXYS начинаются в возрасте ~3 мес. и рассматриваются нами как наиболее раннее проявление ускоренного старения их мозга. С возрастом изменения нарастают на фоне постепенного накопления Aβ, и, как подтвердило настоящее исследование, в возрасте 13 мес. поведение крыс OXYS существенно отличается от такового у контрольных крыс Вистар. Длительный прием ингибитора STEP TC-2153 увеличил эти различия – вдвое снизил двигательную и исследовательскую активность крыс OXYS в тесте “открытое поле” и значительно повысил их тревожность в тесте “приподнятый крестообразный лабиринт”. Таким образом, TС-2153 отрицательно повлиял на поведенческие проявления БА-подобной патологии у крыс OXYS. В то же время мы не выявили отрицательного влияния TC-2153 на обучение крыс OXYS в водном лабиринте Морриса, и при этом он положительно повлиял на долговременную память животных: крысы OXYS, получавшие препарат, проводили значительно больше времени в целевом секторе 1. Следует отметить, что пространственное обучение крыс O-XYS в возрасте 13 мес. существенно не отличается от такового у крыс Вистар. Значительное снижение когнитивных функций в тесте “Водный лабиринт Морриса” регистрируется у крыс OXYS, начиная с возраста 14–16 мес. [27, 28]. В то же время в 8-рукавном радиальном лабиринте дефицит обучения и долговременной памяти проявляется у крыс OXYS уже в возрасте 3 мес. [29].

Как сообщалось ранее, кратковременное ингибирование STEP с помощью TS-2153 способно положительно влиять на память, зависящую от гиппокампа: снижало дефицит памяти у старых крыс Sprague-Dawley (в возрасте 20–22 мес.) при ее тестировании в Т-образном лабиринте [12], а также устраняло когнитивные нарушения у 12-месячных мышей 3xTg-AD [5]. Выполнение задач в водном лабиринте Морриса связано с долгосрочной потенциацией и функцией рецептора NMDA, и этот тест является ключевым методом исследования функций гиппокампа [30, 31]. В настоящем исследовании мы не выявили различий в способности к обучению крыс OXYS и Вистар в водном лабиринте Морриса и TC-2153 не повлиял на нее. Тем не менее, долговременная память у крыс OXYS была снижена, а прием TC-2153 позитивно повлиял на нее. Следовательно, в этом отношении наши данные совпадают с результатами исследования эффектов краткосрочного введения TC-2153 на когнитивные функции [5]. Важно, что при этом эффекты кратковременного подавления STEP у 6-месячных мышей 3xTg-AD не были связаны с изменением уровней Aβ или фосфотау [5]. Длительное введение TC-2153 в нашем исследовании также не повлияло на уровень Aβ в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS. Следует отметить, что в последней публикации группы Lombroso [32] сообщается, что способность TC-2153 улучшать когнитивные функции у мышей 3xTg-AD может быть связана с усилением синаптогенеза. Однако в процессе синаптогенеза могут образовываться не только функциональные, но и молчащие синапсы [33, 34]. Ранее мы выявили усиление синаптогенеза у 5-месячных крыс OXYS, но при этом большинство новообразованных синапсов были неактивны [20]. Не исключено, что снижение локомоторной активности и повышение тревожности у крыс OXYS на фоне приема TC-2153 связано с образованием в гиппокампе абберантных синапсов.

Мы не выявили различий в уровне белка STEP61: он был одинаковым как в коре мозга, так и в гиппокампе крыс OXYS и Вистар, и на него не повлиял длительный прием TC-2153. По данным Jian Xu и соавторов [5], TC-2153 может подавлять активность STEP, образуя ковалентную связь с Cys472 активного сайта, которая необходима для ферментативной активности, не изменяя при этом общее количество STEP и ее фосфорилированной формы. Мы не исследовали активность и фосфорилирование STEP61 в коре мозга и гиппокампе, но изучили их в сетчатке крыс OXYS при оценке эффектов длительного приема TC-2153 по той же схеме [35]. Признаки БА у крыс OXYS развивается одновременно с другими проявлениями преждевременного старения, одним из которых является ретинопатия, аналогичная возрастной макулярной дегенерации (ВМД) у людей [21]. Это заболевание имеет ряд общих клинических и гистопатологических особенностей с БА, и некоторые исследователи рассматривают ВМД как БА глаз [36]. Мы показали [35], что повышение уровня белка STEP61 и снижение, по сравнению с контрольными крысами Вистар, активности общей и STEP фосфатаз в сетчатке предшествуют проявлению клинических признаков ВМД у крыс OXYS. В то же время мы не выявили каких-либо различий в этих параметрах сетчатки у 13-месячных крыс Вистар и крыс OXYS с выраженными признаки ВМД. Более того, ингибирование STEP с помощью TC-2153 с возраста 9 до 13 мес., как и в настоящем исследовании, негативно повлияло на нейроретину, но при этом не изменило уровни мРНК гена Ptpn5, белков STEP46 и STEP61, а также их фосфатазную активность в сетчатке крыс OXYS [35]. Эти результаты, как и данные, полученные в настоящем исследовании, предполагают, что эффекты длительного приема TC-2153 могут быть опосредованы механизмами, не связанными со STEP. Ранее было показано [9], что его эффекты могут быть опосредованы влиянием как на серотонинергическую систему мозга, так и на BDNF, изменения которого при старении способствуют развитию нейродегенеративных процессов. Ранее нами было выявлено двукратное, по сравнению с крысами Вистар, снижение уровня BDNF в гиппокампе крыс OXYS в возрасте 12 мес. [29].

Известно, что STEPs являются редокс-зависимыми ферментами: с одной стороны, окислительный стресс, вызванный перекисью водорода, приводит к значительному увеличению образования димеров и олигомеров более высокого порядка STEP61, тем самым вызывая значительное снижение его ферментативной активности [37], с другой – ингибирование STEP посредством TC-2153 может быть отменено инкубацией с тиолами, такими как глутатион или дитиотреитол [5]. В то же время появились данные о том, что сам TC-2153 способен модулировать редокс-статус клеток. В недавнем обзоре [38] TC-2153, как и другие катенированные двухвалентные органические соединения серы, рассматривается как перспективное пролекарство – потенциальный донор H₂S. H₂S – эндогенный газотрансмиттер, способный модулировать окислительно-восстановительный гомеостаз клетки, действуя как антиоксидант и проявляя широкий спектр цитопротекторных и физиологических функций при возрастных заболеваниях [39]. Примечательно, что у пациентов с БА наблюдается значительное снижение уровня H₂S, что позволяет рассматривать использование доноров H₂S как многообещающую стратегию лечения нейродегенеративных заболеваний [40]. Действительно, положительные эффекты кратковременного воздействия TC-2153 уже получены на моделях фамильной формы БА, депрессивных расстройств [9] и аутизма [41]. Однако следует отметить, что не только окислительный, но и восстановительный стресс, в том числе – на фоне избытка H₂S, может развиваться в клетке и приводить к побочным эффектам [42].

Таким образом, результаты нашего исследования длительного приема TC-2153 в отношении развития как БА-, так и ВМД-подобной патологии у крыс OXYS противоречивы: улучшив долговременную память, TC-2153 значительно уменьшил и без того сниженную двигательную и исследовательскую активность и увеличил тревожность животных – изменения, которые мы рассматриваем как проявления ускоренного старения их мозга. Еще более тревожным представляется негативное влияние TC-2153 на нейроны сетчатки, о котором мы сообщали ранее [35]. Можно предположить, что длительный прием TC-2153 повлиял на окислительно-восстановительный баланс. При этом избыточный восстановительный потенциал мог, вызывая изменения в образовании дисульфидных связей в белках, повлиять на клеточные сигнальные пути, изменить транскрипционную активность, подавить функцию митохондрий и снизить клеточный метаболизм [43]. Неслучайно избыточное потребление пищевых добавок с антиоксидантами, таких как витамины и/или флавоноиды, способно приводить к прооксидантным эффектам, которые могут изменять окислительно-восстановительное равновесие клеток и способствовать снижению стресса, но при этом даже сокращать продолжительность жизни.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на неоднозначность эффектов длительного приема TC-2153, мы согласны с Gü Gojon и G.A. Morales [38] в том, что TC-2153, а также его аналоги в перспективе могут стать эффективными фармакологическими терапевтическими агентами. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования на различных моделях животных для изучения механизмов действия TC-2153, поиска оптимальных доз и продолжительности терапии.