Нейрохимия, 2021, T. 38, № 4, стр. 378-384

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона (БП) – хроническое, прогрессирующее, возрастзависимое, нейродегенеративное заболевание. Среди всех неврологических заболеваний БП находится на втором месте по частоте встречаемости и на первом – по приросту распространенности. Так, общее число пациентов с БП во всем мире увеличилось более чем вдвое за период с1990 по 2015 г. Количество случаев БП в 2014–2015 гг. оценивалось в 6.2–6.9 миллионов пациентов по всему миру, а к 2040 г. ожидается увеличение числа заболевших до 12.9–14.2 миллионов человек. БП является заболеванием наиболее зависимым от возраста. Заболеваемость БП с возрастом увеличивается более чем в 400 раз [1–3].

В качестве ключевого звена молекулярного патогенеза БП, в настоящее время рассматривают гиперпродукцию и мисфолдинг белка α-синуклеина (α-син) с образованием амилоидогенных нейротоксических структур, среди которых наиболее выраженным нейротоксическим действием обладают префибриллярные олигомерные формы белка. Высокие концентрации α-син и его амилоидогенные структуры инициируют деградацию и избирательную гибель определенных популяций нервных клеток, локализующихся в различных церебральных структурах, что приводит к дисбалансу и дисфункции многих нейромедиаторных систем мозга. При этом моноаминергические системы подвержены более раннему и выраженному нейротоксическому влиянию α-син и его амилоидогенных конформаций. Считают, что дисфункции и дисбаланс нейромедиатороных систем обуславливают развитие и проявление характерных двигательных и многообразных недвигательных нарушений, наблюдаемых при БП [4–6].

В последние годы все более активно и широко исследуются различные вопросы междисциплинарной проблемы старения и БП. Признано, что старение является основным фактором риска развития БП. Возраст дебюта заболевания в значительной степени определяет, спектр клинических проявлений и продолжительность течения БП. В зависимости от возраста начала БП выделяют подтипы заболевания, которые различаются распространенностью, клиническими и генетическими особенностями. Ювенильный паркинсонизм – с началом заболевания в возрасте менее 20 лет. БП с молодым (ранним) началом в возрасте от 21 до 40 лет. БП с поздним началом, когда классические признаки заболевания (двигательные нарушения) появляются после 61 г. [1, 3, 7, 8].

Значимый интерес для понимания молекулярного патогенеза и разработки адекватных экспериментальных моделей БП представляют знания о возрастных особенностях нейрохимических механизмов двигательных и недвигательных нарушений, наблюдаемых на доклинической и клинической стадиях заболевания. Нами была разработана оригинальная экспериментальная модель сходных с БП патологических состояний, основанная на хроническом интраназальном введении амилоидогенных конформаций α-син стареюшим мышам. В экспериментах, проведенных на мышах 12-ти месячного возраста, было показано, что олигомеры α-син, вводимые интраназально в течение 14-ти дней, вызывают нейрохимические и поведенческие эффекты сходные с проявлениями, наблюдаемыми на клинической стадии БП: снижение числа дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции мозга, выраженные изменения содержания моноаминов и их метаболитов в черной субстанции и стриатуме, нарушение нейрогенеза в гиппокампе, а также нарушение двигательной активности, памяти и повышение тревожности [9]. Мыши 6-ти месячного возраста, получавшие олигомеры α-син, воспроизводили отдельные доклинические проявления БП: повышение тревожности, снижение содержания дофамина и разнонаправленные изменения уровня его метаболитов в гиппокампе и фронтальной коре мозга. При этом нарушений двигательной активности, обучения и памяти животные не демонтировали [10, 11].

Учитывая изложенное, настоящая работа была направлена на исследование особенностей влияния олигомеров α-син в условиях хронического интраназального их введения на двигательную активность, тревожность, кратко- и долговременную память, содержание и обмен дофамина, серотонина и норадреналина в гиппокампе, фронтальной коре мозга и мозжечке мышей 3-х месячного возраста.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проведена на 20 самцах мышей линии C57Bl/6 в возрасте 3 месяцев (ФГБУН НЦБМТ ФМБА питомник “Столбовая”, Россия). Мыши содержались по 3–5 особей в клетках в стандартных условиях вивария со сменой темной и светлой фаз суток 12/12 ч. при свободном доступе к пище и воде. Мышам двух групп вводили поочередно в каждую ноздрю либо раствор олигомеров α-син, приготовленном на физиологическом растворе (8 мкл, 0.48 мг/кг, n = 10), либо физиологический раствор (ФР, 8 мкл, n = 10) ежедневно в течение 14 дней.

В исследовании была использована батарея поведенческих тестов, описанная нами ранее [10, 11]. На 15-й день от начала введения растворов животных из экспериментальной и контрольной групп однократно помещали в установку “Открытое поле” (ОП) (Columbus Instruments, Огайо, США) на 11 мин (адаптация в течение 5 мин, тестирование – последние 6 минут). Поведение животных регистрировали с помощью видеокамеры CNB-BBB-31F (CNB Technology Inc., Корея), размещенной под потолком комнаты. Сбор и анализ данных проводили с помощью программы Ethovision XT 8.5 (Noldus, Голландия). Для анализа площадь установки делили на 16 равных квадрантов. По перемещению центра тела животного оценивали среднюю скорость движения, а также длительность нахождения и количество заходов в центральную зону (4 центральных квадранта из 16-ти). На 16-е сут оценивали кратковременную память мышей в тесте “Распознавание нового объекта” (РНО), используя установку ОП как арену для проведения исследования. Во время сессии обучения длительностью 5 мин животные имели возможность свободно исследовать два идентичных объекта (банки из стекла с металлическими крышками, диаметром 5.4 см). Через 1 ч после обучения мышей проводили 5-минутную сессию тестирования: в установку помещали один ранее знакомый и один новый для мыши объект (зеленый пластмассовый стакан диаметром 7.5 см). В тесте РНО зоны интереса определяли по границам размещенных в установке 2-х объектов (двух при обучении и двух при тестировании) и на расстоянии 2 см от этих объектов (в пограничных зонах). В этом тесте положение животного определяли по трем точкам (нос, центр тела и хвост). Считали, что мышь исследует объект, если ее нос определялся в границах самого объекта или его пограничной зоны. На основе файлов, записанных во время тестирования, рассчитывали индекс дискриминации (ИД) = = Т_нов/(Т_нов + Т_знак), где Т_нов – длительность нахождения в зоне нового объекта и его пограничной зоне (в секундах), Т_знак – длительность нахождения в зоне знакомого объекта и его пограничной зоне (в секундах). При анализе результатов, полученных в модели РНО, были исключены данные одной мыши из контрольной группы, которая при адаптации не подходила ни к одному из объектов. На 18-е сутки исследования в установке PACS Shuttle Box (v.3.13) (Columbus Instruments, Ohio, USA) у животных обеих групп формировали условную реакцию пассивного избегания (УРПИ), которую оценивали через 24 ч. Животных адаптировали к освещенному отсеку в течение 15 с, максимальная длительность сессии обусловливания составляла 180 с, сессии тестирования – 300 с. В случае перехода в темный отсек мышь получала электрокожное раздражение лап и хвоста (сила тока – 0.6 мА, длительность разряда – 3 с). С помощью программного обеспечения PACS 30 Shuttle Box v . 3.13 в обеих сессиях автоматически фиксировали латентное время (ЛВ) перехода из освещенного в темный отсек камеры. Если животное не переходила в темный отек в течение первой сессии обусловливания, ей предоставлялась еще одна попытка, но не ранее, чем через 30 минут после первой сессии. Спустя 2 дня после проведения УРПИ животных однократно в течение 5 минут тестировали в установке “Приподнятый крестообразный лабиринт” (ПКЛ) (Columbus Instruments, Ohio, USA). В ПКЛ выделяли 2 суммарные зоны интереса: 2 открытых рукава и 2 закрытых. Оценивали следующие показатели: среднюю скорость движения, суммарное количество входов и длительность пребывания в двух закрытых и двух открытых рукавах. Опыты в ОП, РНО и ПКЛ проводили в помещении при освещении установки рассеянным светом (10–14 люкс).

Через 24 ч по окончании поведенческих экспериментов всех животных декапитировали, извлекали мозг и выделяли на холоде образцы структур мозга: гиппокамп, фронтальная кора мозга и мозжечок, которые замораживали в жидком азоте. Далее в полученных образцах церебральных структур определяли содержание биогенных аминов: дофамина (dopamine, DA), его метаболитов (3,4-Dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC; homovanillic acid, HVA; 3-Methoxytyramine, 3-МТ), норадреналина (NA), серотонина (5-hydroxytryptamine, serotonin, 5-HT) и его метаболита (5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HIAA).В экспериментах были использованы моноамины и их метаболиты производства Sigma, St. Louis, MO, USA. Уровень нейромедиаторов определяли в структурах мозга мышей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США) с инжектором Rheodyne 7125, с объемом петли для нанесения образцов в 20 мкл [12]. Величины концентрации моноаминов в опытных образцах рассчитывали методом “внутреннего стандарта”, исходя из отношений площадей пиков в стандартной смеси и экспериментальном образце и выражали в нМ/г ткани.

Олигомеры α-син были получены и охарактеризованы по описанному ранее протоколу [13].

Статистический анализ результатов поведенческих экспериментов осуществляли с помощью программы SPSS Statistics 17.0 (SPSS Inc., США), Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США). Данные представляли как средние значения и стандартные ошибки измерения (M ± SEM), использовали межгрупповое сравнение по U критерию Mann–Whitney. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В поведенческой части исследования оценивали двигательную активность, кратко- и долговременную память и тревожность самцов мышей 3-х месячного возраста, получавших интраназально в течение 14 дней олигомеры α-син либо физиологический раствор. Обнаружено, что общая двигательная активность экспериментальных мышей по сравнению с контрольными животными статистически значимо не различалась ни в ОП, ни в моделях РНО и в ПКЛ. Средняя скорость движения экспериментальных мышей в ОП при адаптации составила 9.4 ± 1.0 см/с (ФР: 8.3 ± 0.5 см/с, тест Манна–Уитни, U = 14.00, Z = –1.347, р = = 0.178), при тестировании ‒ 6.2 ± 0.5 см/с (ФР: 6.5 ± 0.7 см/с, U = 24.00, Z = –0.122, р = 0.903). Пройденное животными расстояние также достоверно не различалось (адаптация: олигомеры α-син: 2775.7 ± 277.4 см, ФР: 2479.5 ± 137.3 см, U = = 14.00, Z = –1.347, р = 0.178; тест: олигомеры α‑син: 2236.9 ± 179.3 см, ФР: 2339.0 ± 267.9 см, U = 24.00, Z = –0.122, р = 0.903). Не было выявлено статистически значимых различий во времени нахождения в центре установки ОП (адаптация: олигомеры α-син: 31.9 ± 3.5 с, ФР: 29.9 ± 3.1 с, U = 20.00, Z = = –0.612, р = 0.540; тест: олигомеры α-син: 52.6 ± ± 14.2 с, ФР: 33.9 ± 3.8 с, U = 15.00, Z = –1.226, р = = 0.220). При адаптации количество заходов экспериментальных мышей в центр ОП составило в среднем 25 ± 2 (ФР: 24 ± 2, U = 23.00, Z = –0.246, р = 0.805), при тестировании ‒ 23 ± 2 (ФР: 20 ± 3, U = 14.50, Z = –1.292, р = 0.196). У мышей, получавших олигомеры α-син, средняя скорость движения в модели РНО при обучении составила 5.6 ± 0.5 см/с (ФР: 6.4 ± 0.6 см/с, U = 18.00, Z = –0.6, р = 0.549), при тестировании 4.7 ± 0.4 см/с (ФР: 5.0 ± 0.6 см/с, U = 22.00, Z = 0.067, р = 0.947). За время обучения экспериментальные мыши прошли в среднем 3306.5 ± 308.6 см, контроль — 3822.8 ± 370.2 см (U = 18.00, Z = –0.6, р = 0.549), а при тестировании – в среднем, соответственно, 2767.8 ± 260.7 и 2983.4 ± 366.8 см (U = 22.00, Z = = –0.067, р = 0.947). В ПКЛ у мышей из экспериментальной и контрольной групп не различались ни средняя скорость движения (олигомеры α-син: 7.5 ± 1.3 см/с, ФР: 5.6 ± 3.9 см/с, U = 12.00, Z = = –1.592, р = 0.111), ни длина пути, пройденного за 5 мин (олигомеры α-син: 2218.8 ± 380.7 см, ФР: 1679.6 ± 117.0 см, U = 12.00, Z = –1.592, р = 0.111).

Сравнение поведение экспериментальных и контрольных мышей в модели РНО выявило различия на уровне тенденции во времени обследования двух объектов при адаптации (0.0 5 < р < 0.1), но не при тестировании через 1 ч (p > 0.1). Индексы распознавания также статистически значимо не различались (табл. 1).

При формировании УРПИ среднее ЛВ перехода в темный отсек статистически значимо различалось между группами мышей при обусловливании (олигомеры α-син: 15.8 ± 3.8 с, ФР: 53.6 ± 15.2 с, U = 5.5, Z = –2.395, р = 0.017), но не тестировании через 24 ч (олигомеры α-син: 146.4 ± 64.4 с, ФР: 177.3 ± ± 36.64 с, U = 22.0, Z = –0.374, р = 0.708).

В тесте ПКЛ между мышами, которым вводили олигомеры α-син или ФР, выявлены различия на уровне тенденции в продолжительности нахождения в открытых рукавах (олигомеры α-син: 107.5 ± 19.9 с, ФР: 56.7 ± 13.34 с, U = 9.00, Z = –1.96, р = 0.05) и индексе предпочтения открытых рукавов (олигомеры α-син: 0.77 ± 0.23, ФР: 0.33 ± 0.09, U = = 11.00, Z = –1.715, р = 0.083). Мыши из экспериментальной и контрольной групп не различались по количеству входов в открытые рукава лабиринта (олигомеры α-син: 20.2 ± 4.0, ФР: 13.8 ± 2.0, U = = 15.00, Z = –1.23, р = 0.219), но имели различия на уровне четкой тенденции в количестве заходов в закрытые рукава ПКЛ (олигомеры α-син: 11.4 ± ± 1.8, ФР: 14.9 ± 2.8, U = 20.5, Z = –0.554, р = = 0.580).

В нейрохимической части исследования определяли содержание моноаминов и их метаболитов в гиппокампе, фронтальной коре мозга и мозжечке у мышей 3-х месячного возраста, которым интраназально в течение 14-ти дней вводили олигомеры α-син либо ФР. Документировано, что в гиппокампе экспериментальных животных содержание моноаминов и метаболитов DOPAC, HVA и 5-НIAA не отличалось от содержания таковых у контрольных животных. При этом, отмечено статистически значимое снижение уровня метаболита 3-МТ на 53.33% и коэффициента обмена DOPAC/DA на 22.73%, а также выраженное повышение коэффициента обмена серотонина 5‑НIAA/5-HT на 96.97% (табл. 2). Во фронтальной коре у экспериментальных мышей зарегистрировано статистически достоверное снижение концентрации DA и его метаболитов DOPAC, HVA на 41.49, 36.36 и 26,92% соответственно. Вместе с тем коэффициент обмена дофамина – HVA/DA повысился на 43.75% по сравнению с контролем. Статистически достоверных изменений содержания НА и 5-HT, метаболитов 3-МТ и 5-НIAA, а также показателей коэффициентов обмена DOPAC/DA и 5-НIAA/5-HT во фронтальной коре не выявлено (табл. 2). В мозжечке мышей, получавших препарат олигомеров α-син, документировано повышение уровня метаболита 3-МТ более чем в 2 раза (на 212.5%), при том, что статистически значимых изменений других исследованных показателей не отмечено (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты выполненного исследования демонстрируют, что олигомеры α-син при хроническом интраназальном введении вызывают у самцов мышей 3-х месячного возраста проявления аффективноподобного поведения с признаками апатии. Мыши, получавшие олигомеры α-син по сравнению с мышами, получившими ФР, проявляли снижение интереса к исследованию новых объектов в период адаптации в модели РНО, более продолжительное время находились в открытых рукавах, при меньшем количестве посещений закрытых рукавов ПКЛ. Нарушений двигательной активности, кратковременной и долговременной памяти, а также повышения тревожности у этих животных не обнаружено.

Аффективные расстройства (апатия, тревога, депрессия, психозы) являются распространенными немоторными нарушениями при БП, которые наблюдаются на доклинической и клинической стадиях заболевания. Так: распространенность апатии при БП достигает 60%, тревога наблюдается у 20–49% пациентов с БП, а распространенность депрессии в среднем составляет 35%. Аффективные расстройства часто наблюдаются на доклинической стадии БП, опережая характерные двигательные проявления заболевания на 3–6 лет. В качестве основных нейрохимических механизмов формирования аффективных расстройств при БП рассматривают дисбаланс и дисфункцию моноаминергических и ацетилхолинергической систем, а также дефицит моноаминов и нарушение моноаминергической трансмиссии во фронтальной коре мозга, гиппокампе и базальных ядрах. Показано, что различные аффективные расстройства отличаются особенностями нейроанатомической и нейрохимической организации [14–16].

В работе обнаружено, что олигомеры α-син, вводимые интраназально в течение 14-ти дней, инициируют у мышей 3-х месячного возраста значимые изменения содержания моноаминов и их метаболитов в исследованных церебральных структурах, участвующих в регуляции эмоционального поведения. Так, во фронтальной коре мозга зарегистрировано выраженное снижение уровня DA и его метаболитов DOPAC, HVA, а также повышение коэффициента обмена HVA/DA. В гиппокампе отмечено достоверное снижение содержания метаболита 3-МТ и разнонаправленные изменения коэффициентов обмена DA и 5-HT. В мозжечке документировано более чем двукратное повышение 3-МТ – метаболита DA. Выявленные изменения содержания моноаминов и их метаболитов свидетельствует о дефиците DA и нарушении его обмена во фронтальной коре мозга, нарушении обмена DA и 5-HT в гиппокампе, а также изменение метаболизма DA в мозжечке, что, по-видимому, обуславливает развитие аффективноподобного состояния с признаками апатии у мышей 3-х месячного возраста в условиях хронического введения олигомеров α-син. Полученные данные указывают, что олигомеры α-син при хроническом интраназальном введении воспроизводят у 3-х месячных мышей проявления аффективноподобного поведения и нейрохимические изменения, сходные с недвигательными нарушениями, которые наблюдаются на доклинической стадии БП.

Документированные экспериментальные факты подтверждают представления о ведущей роли дисбаланса и дисфункции DA- и 5-HT-ергических систем мозга в развитии немоторных нарушений на доклинической стадии БП [5, 15]. Результаты работы согласуются с современными взглядами о том, что мозжечок вовлечен в патогенез БП. Структурно-функциональные нарушения мозжечка, вызванные дефицитом DA, вносят существенный вклад в развитие не только моторных, но и недвигательных симптомов, в том числе аффективных состояний при БП [17].

Считают, что исследования и экспериментальное моделирование немоторных симптомов и нейрохимических основ доклинических недвигательных нарушений БП актуальны и перспективны для разработки методов ранней диагностики и патогенетического лечения заболевания [15, 16]. В проведенном нами ранее исследовании было обнаружено, что олигомеры α-син в условиях аналогичного экспериментального протокола вызывают у мышей 6-ти месячного возраста поведенческие и нейрохимические эффекты сходные с доклиническими, немоторными проявлениями БП. Животные демонстрировали повышение тревожности без признаков нарушения двигательной активности, обучения и памяти. При этом во фронтальной коре мозга зарегистрировано достоверное снижение содержания DA и повышение уровня его метаболитов, а также снижение концентрации DA и его метаболитов в гиппокампе [11].

Таким образом, у мышей 3-х и 6-ти месячного возраста эффекты олигомеров α-син при хроническом интраназальном введении воспроизводят недвигательные доклинические проявления БП, которые, вместе с тем, имеют определенные особенности. Животные 3-х месячного возраста демонстрируют аффективноподобное поведение с признаками апатии с дефицитом DA во фронтальной коре мозга и нарушением его обмена в гиппокампе, фронтальной коре и мозжечке. Тогда как 6-ти месячные мыши проявляли тревожноподобное поведение, ассоциированное с дефицитом DA не только во фронтальной коре, но и в гиппокампе, а также нарушениями обмена DA в указанных церебральных структурах. Следует отметить, что полученные нами данные подтверждаются фактами о нейроанатомических и нейрохимических особенностях различных аффективных расстройств [14, 16, 18]. Имеющиеся результаты позволяют, на наш взгляд, считать, что характер выявленных у 3-х и 6-ти месячных животных проявлений недвигательных доклинических нарушений, наблюдаемых при БП, определяется возрастом начала нейродегенерации вызванной действием олигомеров α-син при интраназальном введении [3, 7, 8].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом, результаты данной работы и ранее выполненного нами исследования свидетельствуют, что олигомеры α-син при хроническом интраназальном введении вызывают у мышей 3-х и 6-ти месячного возраста поведенческие и нейрохимические эффекты, которые отличаются особенностями и воспроизводят недвигательные проявления, сходные с наблюдаемыми на доклинической стадии БП. Мыши 3-х месячного возраста демонстрируют аффективноподобное поведение с признаками апатии ассоциированное с дефицитом DA и нарушением его обмена во фронтальной коре мозга, нарушением обмена DA и 5-HT в гиппокампе, а также изменением метаболизма Da в мозжечке. У мышей 6-ти месячного возраста зарегистрировано тревожноподобное поведение, ассоциированное с выраженным снижением концентрации DA и нарушения его обмена в гиппокампе и фронтальной коре мозга. При этом нарушений двигательной активности, обучения и памяти у животных не документировано. Предполагается, что обнаруженные у 3-х и 6-ти месячных животных особенности недвигательных доклинических проявлений БП определяются возрастом дебюта нейродегенеративного процесса, вызванного действием олигомеров α-син.