Нейрохимия, 2022, T. 39, № 2, стр. 160-167

ВВЕДЕНИЕ

На основе ноотропного препарата пирацетама в Институте фармакологии им. В.В. Закусова был разработан его дипептидный аналог этиловый эфир N-фенилацетил-L-пролилглицина, обладающий ноотропным, анксиолитическим и нейропротективным действием, который в настоящее время широко применяется в клинической практике под названием “Ноопепт” [1–3]. Данные о дизайне, фармакологических свойствах и механизме действия ноопепта наиболее полно представлены в обзоре [4].

При изучении поведенческих эффектов пептидного аналога пирацетама установлена зависимость анксиолитических и ноотропных свойств соединения от генетически детерминированной чувствительности животных к эмоционально-стрессовому воздействию. Ноопепт препятствовал формированию тревожного поведения в тесте “открытое поле” в диапазоне доз 0.5–2.5 мг/кг только у “высокотревожных” мышей BALB/c [5]. Сходный эффект наблюдался при моделировании стрессовой ситуации в тесте “приподнятый крестообразный лабиринт” [6]. Ноопепт в дозе 0.5 мг/кг значительно улучшал функцию долговременной памяти в “лабиринте Морриса” у мышей BALB/c, характеризующихся низким уровнем удержания памятного следа, не влияя на показатели когнитивной активности у мышей C57BL/6J с изначально более высокой способностью к обучению [7]. После выявления корреляции фармакологической активности препарата с плотностью NMDA-рецепторов у инбредных мышей C57BL/6 и BALB/c [8] дальнейшие исследования подтвердили селективность влияния ноопепта на поведение мышей BALB/c и соответствие динамики связывания NMDA-рецепторов в гиппокампе с изменениями исследовательской активности [9].

В целом, существующие в настоящее время представления о механизме анксиолитического и ноотропного действиях ноопепта предполагают вовлеченность глутаматергической и ГАМК-ергической нейропередачи. Однако, исследованиия эффектов ноопепта на содержание биогенных моноаминов и нейромедиаторных аминокислот у мышей инбредных линий до настоящего времени не проводилось. Таким образом, целью данного исследования было сравнительное изучение межлинейных различий нейрохимических эффектов ноопепта в структурах мозга мышей линий BALB/c и С57BL/6.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Опыты проведены на инбредных мышах-самцах линии BALB/c (n = 24) и С57BL/6 (n = 24) массой 20–22 г (“Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства”, филиал “Столбовая”). Организация и проведение работ осуществлялись в соответствии с директивой Совета Европейского сообщества 2010/63/EEC, решением Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 81 “Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств” и приказом Минздрава России № 199 от 01 апреля 2016 года “Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики”. Животные содержались в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 “Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)” от 29 августа 2014 г. № 51. Животных содержали по 15 особей в клетке стандарта Т/3 в условиях вивария при регулируемом световом режиме 12 ч/12 ч (свет/темнота) и постоянной температуре (21–23°С) со свободным доступом к воде и гранулированному корму (ГОСТ Р 50258-92) в течение 10 сут до начала тестирования.

Для исключения влияния суточных биоритмов на скорость биосинтеза и метаболизма нейромедиаторов, эксперименты проводили между 10 и 12 ч дня.

Препараты. Ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил-L-пролилглицина, ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова”), растворяли в физиологическом растворе и вводили в дозах 0.5 и 2.5 мг/кг внутрибрюшинно (в/б) однократно. Выбор доз основан на ранее полученных данных при изучении анксиолитической [5] и ноотропной [7] активности препарата. В качестве контроля использовали эквивалентный объем физиологического раствора из расчета 0.1 мл на 10 г массы тела животного, в/б, однократно. Количество животных в каждой экспериментальной группе составляло 8 особей.

Схема эксперимента. Животные были разделены на следующие группы:

Группа 1 – “BALB/c контроль”;

группа 2 – “BALB/c 0.5” (ноопепт в дозе 0.5 мг/кг);

группа 3 – “BALB/c 2.5” (ноопепт в дозе 2.5 мг/кг);

группа 4 – “C57Bl/6 контроль”;

группа 5 – “C57Bl/6 0.5” (ноопепт в дозе 0.5 мг/кг);

группа 6 – “C57Bl/6 2.5” (ноопепт в дозе 2.5 мг/кг).

Нейрохимические исследования. Животных декапитировали через 30 мин после введения ноопепта и физиологического раствора, после чего извлекали на льду структуры мозга (фронтальную кору, гипоталамус, стриатум и гиппокамп) замораживали в жидком азоте, взвешивали и хранили в жидком азоте. Пробы размельчали в гомогенизаторе Поттера (тефлон-стекло) в 1 мл 0.1 н HСlO₄ с добавлением 3,4-диоксибензиламина (0.5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Пробы центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант использовали для определения моноаминов и их метаболитов (методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД), на хроматографе LC-304T (ВАS, США) с аналитической колонкой ReproSil-Pur ODS (C18, 100 × 4 мм, 3 мкм) (Dr.Maisch, Германия), при скорости элюции подвижной фазы 1.0 мл/мин и давлении до 200 атм. Мобильная фаза состояла из: 0.1 M цитратно-фосфатного буфера, содержащего 1.1 mM октансульфоновой кислоты, 0.1 mM ЭДТА и 9% ацетонитрила (pH 3.0). Измерение проводили с помощью электрохимического детектора LC-4B (BAS США) на двойном стеклоугольном электроде (+0.85 V) против электрода сравнения Ag/AgCl. Норадреналин (НА), дофамин (ДА), 3,4-диоксифенилуксусную кислоту (ДОФУК), гомованилиновую кислоту (ГВК), серотонин (5-окситриптамин, 5-ОТ) и 5‑оксииндолуксусную кислоту (5-ОИУК) в начальной концентрации 0.5 нмоль/мл в 0.1 н НClО₄ использовали в качестве стандартной смеси для калибровки. Регистрация образцов проводилась с применением аппаратно-программного комплекса МультиХром 1.5 (Амперсенд) [10].

Определение содержания тормозных (ГАМК, глицин, таурин) и возбуждающих (аспартат, глутамат) нейромедиаторных аминокислот проводили методом ВЭЖХ/ФД согласно модифицированной методике [11]. Перед анализом ткань гомогенизировали в 1 мл 0.1 н HClO₄ замороженные в жидком азоте и взвешенные биологические пробы в 5 мл гомогенизаторе тефлон-стекло. Затем образцы центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 15 мин. К 0.025 мл супернатанта добавляли 0.05 мл 0.1 н NaОН, и 0.025 мл ортофталевого реагента для запуска реакцию дериватизации. Через 20 мин 20 мкл полученного деривата подвергали хроматографическому разделению. ГАМК, аспартат, глутамат, таурин, глицин в начальной концентрации 0.1 мкМ/мл в 0.1 н НClО₄ использовали в качестве стандартной смеси для калибровки. Регистрацию продуктов разделения проводили на хроматографес флуоресцентным детектором Agilent 1100 (США) с аналитической колонкой Hypersil ODS (4.6 × 250 мм, 5 мкм) (длина волны возбуждения – 230 нм, длина волны испускания – 392 нм). Подвижная фаза для определения нейромедиаторных аминокислот состояла из 0.06 M ${\text{Na}}{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{P}}{{{\text{O}}}_{4}} \cdot {{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O,}}$ 0.0032 M Na₂HPO₄, 0.025 mМ ЭДТА, и 1.24 mM CH₃OH, pH 5.6. Скорость подвижной фазы составляла 1.5 мл/мин. Регистрация образцов проводилась с применением аппаратно-программного комплекса Agilent ChemStation v.B.04.02

Статистическую обработку полученных результатов проводили в GraphPad Prizm 8.0 (GraphPad Software, Inc. USA) при помощи двуфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с post hoc Newman-Keuls. Критический уровень значимости α = 0.05. Данные представлены в виде М ± SEM: М – средние значения, SEM – стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наиболее выраженные межлинейные отличия нейрохимического профиля структур мозга животных контрольных групп отмечались в стриатуме у мышей С57Bl/6, было выявлено снижение соотношения ДОФУК/ДА, и в гиппокампе наблюдался рост концентрации НА в 2.4 раза и увеличение соотношений ГВК/ДА в 3.8 раза и ДОФУК/ДА в 2.6 раза (табл. 1). Напротив, у животных линии BALB/c отмечался более низкий уровень 5-ОТ и 5-ОИУК во фронтальной коре, гипоталамусе и гиппокампе соответственно по сравнению с мышами C57Bl/6 (табл. 2). У мышей С57Bl/6 во фронтальной коре зарегистрирован более низкий уровень Глу и Тау по сравнению с BALB/c. Пониженное содержание Асп, Глу в стриатуме и повышенное содержание Тау и ГАМК по сравнению с аналогичными показателями животных BALB/c отмечалось в гиппокампе мышей С57Bl/6 (табл. 3).

У мышей BALB/c ноопепт при системном введении снижал содержание ДА, ГВК, а также повышал ДОФУК/ДА и ГВК/ДА во фронтальной коре. В гипоталамусе наблюдалось уменьшения уровня ДА в 1.4 раза в дозе 2.5 мг/кг по сравнению с дозой 0.5 г/кг. У мышей С57Bl/6 ноопепт вызывал статистически значимые изменения только во фронтальной коре, снижая уровень ДА, НА и содержание ГВК в дозе 0.5 мг/кг (табл. 1). Ноопепт не влиял на уровень 5-ОТ и 5-ОИУК у обеих линий животных во всех изученных структурах (табл. 2). Также не наблюдалось и эффектов ноопепта на содержание нейротрансмиттерных аминокислот ни у одной линии мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ

Данное исследование является продолжением серии работ, проведенных нами ранее, и полученные результаты подтверждают уникальность нейрохимического профиля структур мозга инбредных линий мышей [12]. В частности, в настоящем исследовании, нами были выявлены значительные межлинейные различия в уровнях НА, ДА, 5-ОТ, а также их основных метаболитов в гиппокампе, гипоталамусе, стриатуме и фронтальной коре мозга). Содержание 5-ОТ и его метаболита 5-ОИУК в гиппокампе мышей BALB/С, обладающих пассивной реакцией на стресс, было ниже, чем у высокоактивных животных линии C57Bl/6. Данный факт согласуется с известными из литературы данными, согласно которым у животных C57Bl/6 было обнаружено более высокое содержание 5‑ОТ и 5-ОИУК в сравнении с другими линиями мышей [13, 14], но противоречит результатам наших предыдущих исследований, в которых уровень 5‑ОТ, а также его метаболита 5-ОИУК в гиппокампе мышей, обладающих пассивной реакцией на стресс, был выше, чем у высокоактивных животных (C57Bl/6) [12]. Это расхождение может объясняться различиями в условиях проведения эксперимента – в настоящем исследовании не выполнялось помещение мышей в стрессирующие условия “открытого поля”. Значительные отличия показателей дофаминергической системы наблюдались в стриатуме, где уровень ДОФУК, а также показатель ДОФУК/ДА значительно превышали величину аналогичных параметров линии C57Bl/6, хотя уровень ДА и ГВК был снижен. В другой работе, выполненной нашим коллективом с помощью метода внутримозгового микродиализа, в префронтальной коре интактных мышей линии BALB/с, отмечался более высокий базальный уровень ДА по сравнению с аналогичным показателем линии C57Bl/6. Помещение в животных в “открытое поле” приводило к еще большему возрастанию различий [15]. В то же время, интересно отметить, что пониженное содержание НА во фронтальной коре мышей BALB/с согласуется с данными наших предыдущих экспериментов [12].

Известно, что мыши линии BALB/c отличаются пониженным содержанием серотонина в мозге, что объясняется более низкой активностью фермента триптофангидроксилазы (TPH2) у данной линии животных [16]. Наибольшая разница в экспрессии транскрипта TPH2 наблюдалась в ростральных дорсальных ядрах шва, содержание 5-ОТ в структурах мозга животных линии BALB/c в среднем мозге было на 15% ниже и в коре на 18% ниже аналогичных показателей мышей линии C57Bl/6J [17]. Нельзя исключить, что отличия поведенческих реакций у мышей BALB/c от мышей C57Bl/6J могут быть обусловлены меньшим количеством 5-ОT нейронов и более низкой экспрессией гена TPH2, что приводит к ослаблению серотонинергической нейропередачи. Кроме того, было показано, что у мышей линии BALB/c меньше сайтов связывания [³H]-флунитразепама во фронтальной коре и [³H]-MK801 в гиппокампе по сравнению с мышами C57BL/6, что позволяет использовать линию BALB/c в качестве модели патологического состояния, сочетающего повышенную тревожность и когнитивный дефицит [18].

Несмотря на наличие публикаций, в которых описаны фармакологические эффекты ноопепта на культуре гиппокампальных клеток [19] и в опытах ex vivo [20], в наших экспериментах не было обнаружено какого-либо статистически значимого влияния препарата на уровень биогенных моноаминов и аминокислот в гиппокампе ни у одной из линий мышей.

Ноопепт не влиял на уровень нейротрансмиттерных аминокислот у мышей, хотя ранее установлено, что при однократном введении соединения происходит активация NMDA-рецепторов у крыс [21] и снижение спонтанного и К⁺-стимулированного высвобождения глутамата на срезах коры головного мозга крыс линии Wistar [22]. Ноопепт при субхроническом введении препятствовал повышению уровней аспартата и ГАМК, индуцированному тромбозом, а также способствовал нормализации содержания глицина на модели ишемического поражения сетчатки глаза у кроликов [23]. При регистрации ионных токов в СА1 пирамидальных нейронах мозга крыс методом patch-clamp было показано отсутствие эффектов ноопепта на процесс высвобождения тормозных нейротрансмиттеров из терминалей, что свидетельствовало об изменениях в ГАМК-ергических интернейронах [19]. По-видимому, эффект препарата в отношении нейротрансмиттерных аминокислот наблюдается только при субхроническом или хроническом введении.

ВЫВОДЫ

Таким образом, при изучении эффектов ноопепта на содержание нейротрансмиттерных моноаминов у мышей линий BALB/c и C57Bl/6 было установлено преимущественное влияние препарата на дофаминергическую систему мозга мышей BALB/c, проявляющееся в увеличении соотношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА во фронтальной коре. Кроме того, ноопепт вызывал увеличение уровня НА и скорости метаболизма ДА в гипоталамусе и стриатуме мышей BALB/c.