Нейрохимия, 2022, T. 39, № 3, стр. 210-216

ВВЕДЕНИЕ

Многочисленные исследования стрессорных воздействий на нейроглиальные взаимосвязи выявили критически важные периоды в процессах нейрогенеза и глиогенеза. Нарушение формирования нейроглиальных комплексов в такие периоды, несомненно, сказывается и на функционировании взрослого организма. Последствием данного нарушения будут изменения дифференцировки коры в процессе пренатального онтогенеза [1]. Крыса является удобным модельным объектом для исследования этих процессов, поскольку у данного животного хорошо изучены критические периоды как пре- так и постнатального онтогенеза. Одним из таких периодов формирования неокортекса для крысы считается период второй и третьей недели постнатального развития. Отмечается, что к 20 дням у крысят фиксируется максимальная исследовательская активность [2]. В это же время вес неокортекса у крыс наряду с другими структурами мозга достигает максимальных значений [2]. Показано, что рост тел нейронов в коре завершается к 17–20-му дням. В эти же сроки происходит интенсивная миелинизация в глубоких слоях коры, кроме того в первые 3 недели постнатального развития происходит интенсивный синаптогенез, а также к концу 3-ей недели постнатального развития устанавливается максимальное потребление кислорода в мозге [3].

Как известно, одним из последствий воздействия пренатального стресса (ПС) является генерация чрезмерного количества активных форм кислорода (АФК), осуществляемая различными механизмами. Орган-специфический ответ зависит от относительного баланса между генерацией АФК и антиоксидантными ресурсами клетки [4, 5]. В работе Флерова и соавт. [6] не было выявлено отличий в уровне диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в неокортексе у пренатально стрессированных крыс в возрасте 20 дней по сравнению с контрольной группой того же возраста. Однако, при исследовании нейронов и нейроглии, выделенных из неокортекса у пренатально стрессированных крыс в возрасте 20 дней, уровни диеновых и триеновых конъюгатов и оснований Шиффа оказались сниженными в нейроглии по сравнению с контрольной группой. В этом же исследовании было обнаружено повышение уровня окислительной модификации белков, как в нейронах, так и в нейроглии у пренатально стрессированных 20-дневных самцов крыс по сравнению с контролем. При этом активность такого антиоксидантного фермента как Cu-Zn-супероксиддисмутаза была ниже в нейронах, а в нейроглии не изменялась [7].

В предыдущем нашем исследовании [8] нами были выявлены изменения в активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов в нейронах и нейроглии у взрослых пренатально стрессированных крыс. Однако эти изменения, несомненно, являются результатом процессов, протекающих на более ранних стадиях пре- и постнатального онтогенеза, в особенности в критические периоды.

В связи с этим целью данной работы было изучение активности антиоксидантных глутатионзависимых ферментов в субклеточных фракциях нейронов и нейроглии у пренатально стрессированных крысят в возрасте 20 дней, который является критически важным для процессов нейрогенеза и глиогенеза и формирования неокортекса.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа проведена на животных из питомника Института физиологии им. И.П.Павлова РАН, с соблюдением рекомендаций по этике работы с животными, предложенными Directive 2010/63/ЕU of the European Parliament and of the Council on the protection of animals used for scientific purposes. Опыты проводили на крысах линии Wistar. Животные содержались в стандартных условиях вивария при 12-часовом световом режиме и свободном доступе к пище и воде. Все манипуляции с животными проводили в период с 9 до 11 ч утра.

Для получения пренатально стрессированного потомства первородящих беременных самок (возраст 5 мес., вес 250–270 г) подвергали одночасовому иммобилизационному стрессу в условиях повышенной освещенности с 15-го по 19-й день гестации [9]. В эксперименте использовано 12 самок (6 самок – контрольная группа, 6 самок – группа, подвергавшаяся стрессу), к которым подсаживали самцов (1 самец к 3 самкам). У самок ежедневно брали мазки с целью определения фазы эстрального цикла. Нулевым днем беременности считали день, когда в вагинальном мазке самки, находящейся в стадии эструса, обнаруживались сперматозоиды. На 18-й день беременности самок рассаживали по отдельным клеткам, где они находились до родов и в процессе выкармливания потомства. Далее из каждого помета отбирали случайным образом (без использования слепого метода) по 4 самца в возрасте 20 дней.

Крыс-самцов декапитировали, из черепной коробки извлекали мозг, из которого на льду выделяли неокортекс обоих полушарий от 4 особей в одну пробу, всего 6 проб (n = 6). Таким образом, в эксперименте использовалось 48 самцов крыс (24 крысы – контрольная группа, 24 крысы – пренатально стрессированная (ПС) группа).

Клеточные фракции, обогащенные нейронами и нейроглией, выделяли по методу Селлинджера в модификации Флерова [10]. Принцип метода заключается в получении клеточной суспензии с последующим выделением и очисткой нейрональной и нейроглиальной фракций ультрацентрифугированием (ультрацентрифуга VAC-60, ротор SWOUT 50 × 3, Германия) в градиенте плотности сахарозы и фиколла (сахароза, “Вектон”, Россия; Ficoll 400, “Merck”, Германия). При этом клеточную суспензию получали путем дезинтеграции ткани при пропускании ее через нейлоновые и металлические сита с последовательно уменьшающимся размером пор. Для облегчения дезинтеграции ткань предварительно обрабатывали раствором поливинилпирролидона (PVP-K30, “Merck”, Германия). После выделения фракции нейронов и нейроглии отмывали от сахарозы физиологическим раствором и затем центрифугировали в течение 10 минут в центрифуге при 3500g (центрифуга Eppendorf 5430R, Германия). Полученный осадок гомогенизировался (гомогенизатор Поттера, Sartorius, Германия), в 1 мл 0.25 М растворе сахарозы, содержащем 1 мМ ЭДТА (“Вектон”, Россия), рН 7,4 (для нейронов), или в эквивалентном объему осадка объеме 0.25 М раствора сахарозы, содержащем 1 мМ ЭДТА, рН 7.4 (для нейроглии). Далее выделение субклеточных фракций производилось стандартным методом дифференциального центрифугирования как описано ранее [11].

Активность ферментов глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) и глутатионтрансферазы (ГТ) определялась с помощью наборов (Glutathione Peroxidase Assay Kit CatNo:EGPX-100, Glutathione Reductase Kit CatNo:ECGR-100, Glutathione S-transferase Assay Kit CatNo:DGST-100, BioAssay Systems, USA) на фотометре Thermo Scientific multiscan fs, USA. За единицу активности исследованных ферментов принимали количество нмолей продукта реакции, образовавшегося за 1 мин в расчете на 1 мг белка (нмоль/мин/мг белка). Количество общего белка определялось по методу Лоури.

Статистическая обработка полученных результатов производилась с использованием критерия сравнения U (Манна–Уитни) в программе “IBM SPSS Statistics 21”. Проверку нормальности распределения значений рассматриваемых групп проводили с помощью критерия Шапиро–Уилка (Shapiro–Wilks test). Проверку статистических гипотез проводили при уровне значимости р < 0.05. При описании количественных данных использовались следующие показатели: Ме – медиана, IQR – интерквартильный размах между значениями 25–75 перцентилей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Данные, полученные при исследовании активности ферментов глутатионового пула в цитозоле, фракциях ядер и митохондрий нейронов и нейроглии в контрольной группе крыс в возрасте 20 дней, представлены в табл. 1.

Из трех исследованных ферментов в цитозоле нейронов активность у ГР не проявлялась. Во фракции ядер была выявлена активность ГР и ГТ, а активность ГПО не проявлялась. В митохондриальной фракции нейронов не выявлена активность ГР и ГТ.

В цитозоле нейроглии активность ГПО и ГТ была ниже по сравнению с нейронами, кроме того была выявлена активность ГР в отличие от нейронов (р < 0.05). В ядерной фракции нейроглии активность всех трех ферментов была более высокой по сравнению с активностью ферментов в ядерной фракции нейронов (р < 0.05). Во фракции митохондрий нейроглии активность ГПО была более низкой, чем у нейронов во фракции митохондрий (р < 0.05). Активность ГР во фракции митохондрий нейроглии не выявлена также, как и в митохондриальной фракции нейронов. Но была выявлена активность ГТ во фракции митохондрий нейроглии. Следует отметить на порядок более высокую активность ГПО в митохондриальной фракции как нейронов, так и нейроглии, по сравнению с активностью данного фермента во всех других фракциях. Также обращает на себя внимание отсутствие активности ГР в митохондриальной фракции как нейронов, так и нейроглии.

Изменение активности исследованных ферментов в субклеточных фракциях нейронов и нейроглии у пренатально стрессированных крыс в возрасте 20 дней показано в табл. 2.

У пренатально стрессированных животных в цитозоле нейронов активность ГПО повышалась в 10 раз по сравнению с контролем, активность ГР так же, как и в контроле, не проявлялась, а активность ГТ не изменялась по сравнению с контролем. Во фракции ядер нейронов в отличие от контроля выявлена активность ГПО, а активность ГР не имела достоверных отличий от контроля, тогда как активность ГТ выявлена не была. В митохондриальной фракции нейронов ПС животных активность ГПО и ГР не выявлялась, тогда как активность ГТ, в отличие от контроля, была определяема.

В нейроглии у пренатально стрессированных крыс активность всех исследованных ферментов в цитозоле увеличивалась по сравнению с контрольными крысами (р < 0.05). В ядерной фракции достоверно увеличивалась активность ГПО (р < 0.05), тогда как активности ГТ и ГР не отличались от этих показателей у контрольной группы. Во фракции митохондрий активность ГПО не проявлялась в отличие от контроля, активность ГТ снижалась по сравнению с контролем, а активность ГР, так же, как и у контрольных животных, была не определяема.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В нашем предыдущем исследовании [8] мы выявили эффекты пренатального стресса на активность антиоксидантных ферментов глутатионового пула в субклеточных фракциях нейронов и нейроглии в неокортексе у половозрелых самцов крыс. Нами был сделан вывод о том, что у взрослых крыс изменения в активности исследованных ферментов носят как компенсаторный, так и патологический характер. Однако, для поведенческих и когнитивных свойств и вероятности развития нейродегенеративных заболеваний у взрослых индивидов также имеет значение формирование нейроглиальных взаимоотношений в онтогенезе. Поэтому в настоящем исследовании были рассмотрены ювенильные крысы в возрасте 20 дней, когда наблюдается максимальная интенсивность процессов, связанных с миелинизацией [3]. В литературе отмечается тот факт, что мозг во время раннего постнатального развития обладает значительным запасом низкомолекулярных антиоксидантов, тогда как концентрации антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и ГПО относительно низки [12]. Однако, следует отметить, что большее значение имеет именно активность антиоксидантных ферментов, а не их абсолютное количество. Результаты данного исследования показали, что у 20-дневных крысят в контрольной группе активность ферментов во фракции ядер нейроглии выше по сравнению с нейронами (табл. 1). Можно предположить, что для нейроглии наиболее важно поддержание необходимого уровня антиоксидантной активности глутатионзависимых ферментов именно во фракции ядер. В то же время в нейронах активность ГПО в цитозоле и в митохондриальной фракции выше почти в 4 раза по сравнению с нейроглией. Эти данные позволяют предположить, что возможность поддерживать более низкий уровень АФК в нейронах, чем в нейроглии [13] на ранних стадиях онтогенеза осуществляется не только благодаря специфической организации комплекса 1 в митохондриях [14], но и благодаря повышенной активности ГПО. В то же время у 20-дневных крысят высокая активность ГПО по сравнению с остальными исследованными ферментами наблюдается во фракции митохондрий и в нейронах и в нейроглии. По-видимому, это важно для жизнеспособности и выживания развивающихся нейронов [15]. Активность ГТ в ядерной и митохондриальной фракциях значительно выше в нейроглии по сравнению с нейронами, в то время как активность ГТ в цитозоле нейронов выше, чем в нейроглии. ГТ является важным регулятором активности Nrf-2 (ядерный-эритроид-связанный фактор 2) [16], который в свою очередь через ARE (антиоксидант-респонсивный элемент) индуцирует экспрессию широкого спектра антиоксидантных ферментов, в том числе связанных с синтезом и метаболизмом глутатиона [17]. Такая картина в период усиленной миелинизации может объясняться необходимостью регуляции антиоксидантного статуса через Nrf-2 не только в нейроглии, но и в нейронах, поскольку непосредственно сами нейроны участвуют в регуляции процессов миелинизации как показано в исследовании Simons и соавт. [18].

Изменения активности исследованных ферментов в субклеточных фракциях нейронов и нейроглии у 20-дневных крысят в результате воздействия ПС в виде схемы представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, активность ГПО в митохондриальной фракции нейронов и нейроглии у пренатально стрессированных крыс ниже по сравнению с контрольной группой. И, если в нейронах это отчасти компенсируется появлением активности ГТ, то в нейроглии активность ГТ снижается в 3 раза. Вероятно, ПС создает сбой в энергетических процессах, что не может не сказаться на процессах миелинизации у ювенильных крысят и может способствовать развитию нейродегенеративных заболеваний [19]. При этом в цитозоле нейроглии после ПС активность всех трех исследованных ферментов повышается, а в цитозоле нейронов возрастает только активность ГПО. Можно предположить, что в нейроглии активизируются антиоксидантные механизмы, позволяющие компенсировать негативные последствия ПС в неокортексе. Это подтверждается полученными ранее результатами о неизменном уровне перекисного окисления липидов и окислительных модификаций белка в нейронах и нейроглии [7], а также о менее эффективной глутатионовой системе детоксикации пероксидов нейронов [20] и данными о большей устойчивости к ишемии ювенильных олигодендроцитов [21].

Во фракции ядер нейронов после ПС активность ГТ не выявляется, в то время, как выявляется активность ГПО, что возможно имеет компенсаторный характер. Следует отметить, что и у пренатально стрессированных крысят и у контрольных крысят во фракции ядер нейроглии активность исследованных ферментов выше по сравнению с нейронами (см. табл. 1 и 2). Сходное с контрольными животными распределение активности исследованных ферментов во фракции ядер нейроглии у пренатально стрессированных крыс может свидетельствовать о сохранности механизмов антиоксидантной защиты генетического материала этой клеточной популяции.

Чтобы проследить влияние изменений активности исследованных ферментов в критическом для постнатального формирования нейроглиальных взаимоотношений в возрасте (20 дней) на активность данных ферментов у взрослых животных, мы сравнили возрастные изменения отдельно у контрольных и у пренатально стрессированных крыс с использованием полученных нами ранее данных [8], что показано в табл. 4 (контроль) и табл. 5 (ПС).

Как видно из представленных в табл. 4 данных, для контрольных животных характерно значительное снижение с возрастом активности исследованных ферментов в нейронах, за исключением ГПО в цитозоле. Тогда как в нейроглии, напротив, с возрастом увеличивается активность всех изученных антиоксидантных ферментов. Особенно заметно это увеличение для ГПО в цитозоле (в 5 раз) и в митохондриальной фракции (в 6 раз). В работах Галкиной и соавт. [22, 23] было показано, что активность антиоксидантных ферментов глутатионового пула у 20-дневных крысят в мозге ниже, чем у взрослых животных. Авторы связывают это с влиянием данных ферментов на соотношение GSH/GSSG, полагая, что это может являться фактором “переключения” фазы пролиферации и фазы дифференцировки нервных клеток. Одновременно, это может быть связано с формированием специфических суперкомплексов из комплекса 1 в митохондриях нейронов и выработке большего количества АФК в глиальных клетках [14].

При рассмотрении возрастной динамики у пренатально стрессированных крыс (табл. 5) обращает на себя внимание снижение у 90-дневных животных активности ГПО в цитозоле нейронов (в 13 раз) и появление активности этого фермента в митохондриальной фракции нейронов (164 нмоль/мин/мг белка), тогда как у пренатально стрессированных крыс в возрасте 20 дней активность данного фермента не выявлена. Кроме того, у взрослых (90 дней) пренатально стрессированных животных повышалась активность ГТ во фракции митохондрий нейронов, в то время как в контроле активность этого фермента не выявлялась на обоих сроках развития (см. табл. 4). Таким образом, в нейронах у пренатально стрессированных крыс в процессе созревания наблюдаются разнонаправленные изменения по сравнению с контрольными животными в активности ГПО в цитозоле и митохондриальной фракции.

В цитозоле нейроглии у пренатально стрессированных крыс с возрастом происходит увеличение активности всех изученных ферментов также, как у контрольных крыс. Однако, следует отметить, что, как в возрасте 20, так и 90 дней у пренатально стрессированных крыс в цитозоле нейроглии уровень активности всех исследованных ферментов выше, чем у контрольных животных. При рассмотрении изменений от 20 к 90 дням в нейроглии у контрольных животных видно, что активность ГПО в митохондриальной фракции увеличивается в 6 раз до 898 нмоль/мин/мг белка (табл. 4), тогда как активность этого фермента у пренатально стрессированных животных изменяется от неопределяемых величин до 244 нмоль/ мин/мг белка (табл. 5). Одновременно активность ГТ во фракции митохондрий нейроглии у пренатально стрессированных животных достигает значений, сравнимых с контрольными животными в возрасте 90 дней (табл. 5), возрастая в 14.8 раза, тогда как у контрольных животных активность этого фермента, имея более высокий уровень на 20-й день, вырастает к 90-му дню лишь в 4.6 раза (табл. 4). По-видимому, ПС не изменяет программу формирования нейроглиальных комплексов, но обуславливает изменение скорости морфогенетических процессов, что возможно связано с одновременно протекающими процессами дифференцировки, патологическими изменениями и компенсаторными процессами. Как указывается в опубликованных нами ранее работах [6, 7] ПС оказывает наибольшее влияние на свободнорадикальное окисление белков и перекисное окисление липидов в нейронах и нейроглии у 20-дневных животных по сравнению с взрослыми животными. Однако такая перестройка возрастной динамики окислительной модификации биомолекул может свидетельствовать о процессах адаптации ткани, вынужденной развиваться в условиях многочисленных десинхронозов. При этом драматические перестройки метаболизма в процессе онтогенеза у пренатально стрессированных крыс в результате взаимодействия субклеточных популяций приводят к компенсации патологических изменений по показателям перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в неокортексе у взрослых крыс. Приведенные выше сравнительные данные могут указывать на то, что у пренатально стрессированных животных в значительной степени включаются компенсаторные механизмы антиоксидантной активности как в нейронах, так и в нейроглии. Однако при рассмотрении масштабов этой компенсации можно предположить нарушение функционирования митохондрий у пренатально стрессированных животных, которое не позволяет исследованным антиоксидантным ферментам достичь уровня активности, определяемой у контрольных животных. Постоянное включение компенсаторных механизмов подобного уровня, вероятно, может приводить к более быстрой “изнашиваемости” антиоксидантной системы и, как следствие, к ускоренному старению.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показало, что пренатальный стресс приводит к изменению уровня активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов в субклеточных фракциях нейронов и нейроглии неокортекса у крыс в возрасте 20 дней. Анализ таких изменений позволяет сделать вывод о негативном влиянии ПС на процессы постнатального онтогенеза в неокортексе, и предположить, что одной из причин повышенной склонности пренатально стрессированных животных к нейродегенеративным заболеваниям и ускоренному старению являются изменения в активности глутатионзависимых ферментов как в нейронах, так и в нейроглии неокортекса. Для понимания патологических механизмов негативного влияния ПС на ЦНС необходимы исследования функций митохондрий у пренатально стрессированных животных. Дальнейшие исследования в этом направлении могут иметь важное значение для клинической практики при профилактике нейродегенеративных заболеваний и при их лечении митохондриально ориентированной терапией.