Нейрохимия, 2023, T. 40, № 3, стр. 292-298

ВВЕДЕНИЕ

Рассеянный склероз (РС) – хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание нервной системы в возникновении которого несомненную роль играет генетическая предрасположенность наряду с воздействием средовых факторов [1, 2]. Генетические исследования в области РС выявили, что предрасположенность к болезни реализуется полигенной системой, формирующей иммунный ответ, а особенности клинического фенотипа заболевания и ответа на лечение могут определяться вовлечением полиморфизмов гораздо большего числа генов [3, 4]. Среди генетических факторов, определяющих как развитие, так и течение РС, наиболее подтвержденной на сегодняшний день, является роль генов иммунной системы, однако в разных регионах сочетание полиморфных ассоциаций с РС демонстрирует определенные различия [5]. Данные о генетической гетерогенности РС стимулируют множество исследований по поиску отдельных связей полиморфизмов генов с риском развития заболевания, его клиническим течением, ответом на терапию в различных популяциях, которые вносят все больший вклад в понимание генетики РС. При этом, наиболее активно изучается роль полиморфизмов генов различных цитокинов в формировании клинико-патогенетических вариантов болезни [6]. Среди провоспалительных цитокинов особое внимание уделяется семейству фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor, TNF). Ген фактора некроза опухоли-α (TNF-α) является главным регулятором синтеза провоспалительных цитокинов и рассматривается в качестве одного из ключевых генов в патогенезе PC. Он представлен одной копией на 6й хромосоме человека (6р21.1-3) [7], а аллель А полиморфного локуса rs1800629 в положении G-308А этого гена ассоциирован с более высокой генной транскрипцией TNF-α и усилением воспалительных процессов [8]. Исследования этого полиморфизма при РС показали ассоциации аллеля А с двукратным увеличением риска заболевания у женщин, более ранним его дебютом [9], выраженными когнитивными расстройствами [10], а также с высокой степенью инвалидизации пациентов [11]. Одним из основных белков рецептора TNF-α является TNFRSF1A, который активирует фактор транскрипции NF-κB, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла, опосредует апоптоз и регулирует воспаление. Ген TNFRSF1A картирован на 12й хромосоме (12р13.2) и имеет 2 независимых аллеля, ассоциированные с риском развития PC [12]. Полиморфизм rs4149584 кодирует TNF-R1, один из основных рецепторов TNF-α, который опосредует его воспалительные действия при аминокислотной замене R92Q [13]. Обнаружено, что сывороточные уровни растворимого TNF-R1 и уровни мРНК полноразмерного рецептора значительно повышены у пациентов с РС, несущих именно эту рисковую мутацию [14], однако влияние полиморфизма rs4149584 гена TNFRSF1A на формирование фенотипа РС и ответа на лечение остается невыясненным. CD40 – это поверхностный рецептор TNF, экспрессирующийся на многих клетках организма человека и животных. Ген рецептора CD40 локализован на 20-й хромосоме (20ql1-13) и вносит вклад в предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям. Вовлечение CD40 в патогенез РС реализуется посредством нарушения негативной селекции в тимусе, высвобождения активированных T-клеток, их дифференциации в Th17, активации антиген-презентирующих клеток, стимуляции воспалительных хемокинов и цитокинов в тканях-мишенях, что приводит воспалительному повреждению ткани-мишени [15]. Связь гена CD40 (rs6074022, rs1569723) с риском РС впервые была выявлена в результате полногеномного исследования, проведенного консорциумом ANZgene [16]. Позднее был проведен еще ряд исследований, касающихся отдельных полиморфизмов rs1883232, rs1535045, rs11086996, rs6074022, находящихся в одном блоке сцепления гена CD40, показавших противоречивые результаты о связи с риском РС, тем самым подтвердив генетическую гетерогенность РС в разных популяциях пациентов [17, 18]. Результаты крупномасштабного иммуногенетического исследования, проведенного международным консорциумом по генетике РС, в очередной раз подтвердили участие описанных генов семейства TNF в качестве генов-кандидатов, определяющих восприимчивость к РС [19].

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для исследования были выбраны 6 полиморфизмов генов семейства TNF: rs1800629 гена TNF-α; rs4149584 гена TNFRSF1A; rs6074022, rs1883832, rs1535045, rs11086996 гена CD40, которые показали ассоциации с РС в проведенных ранее исследованиях [9–12, 14, 16–19]. Все изучаемые варианты являются однонуклеотидными заменами (single nucleotide polymorphism, SNP). Поскольку прямое влияние на развитие иммунных воспалительных процессов оказывает взаимодействие между цитокинами, рецепторами, экспрессированными на Т-клетках, и лигандами, в исследование были включены гены этих трех представителей семейства TNF: TNF-α, являющийся провоспалительным цитокином; поверхностный рецептор TNFRSF1A; поверхностный рецептор CD40, являющийся ко-стимулирующим фактором.

Исследуемую группу составили 152 пациента с достоверным диагнозом РС согласно критериям МакДоналда [20], проживающие на территории Томской области, средний возраст которых составил 35.0 ± 11.2 лет. В исследуемой группе преобладали женщины (соотношение полов составило 1.9 : 1), медиана длительности болезни составила 12 [9, 18] лет, средний балл по шкале EDSS равнялся 3.3 ± 1.7. Подробная характеристика группы больных представлена в табл. 1. Исследование ассоциаций изучаемых полиморфизмов с ответом на лечение проводилось среди пациентов, получавших терапию препаратами, изменяющими течение РС (ПИТРС) первой и второй линии. Обязательными условиями при включении в исследуемую группу были: лечение препаратом ПИТРС в течение времени, необходимого для наступления терапевтического эффекта и достаточная приверженность лечению со стороны пациента В подгруппу ПИТРС первой линии вошли 134 пациента, получавшие терапию на момент включение в исследование, из которых 89 пациентов лечились глатирамера ацетатом и 45 – интерферонами-бета. В подгруппу ПИТРС второй линии вошли 38 больных, из которых 18 получали ПИТРС второй линии на момент включения в исследование и 20 больных были переведены на данный вид терапии в течение периода клинического наблюдения в связи с недостаточной эффективностью или плохой переносимостью препаратов первой линии. В группе ПИТРС второй линии 20 больных получали натализумаб, 10 – окрелизумаб, 4 – финголимод, 3 – митоксантрон и 1 – алемтузумаб. Период клинического наблюдения группы больных РС для оценки степени прогрессирования РС и ответа на терапию ПИТРС составил 5 лет.

В контрольную группу вошли 707 добровольцев, не имеющих аутоиммунных заболеваний и патологии нервной системы, из которых 442 женщины и 265 мужчин (соотношение полов 1.7 : 1), средний возраст составил 34.9 ± 8.9 лет. Контрольная группа соответствовала по полу и возрасту (р > 0.05) группе больных РС.

ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку экстракцией примесей фенол–хлороформом и осаждение этанолом. Генотипирование проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфной нуклеотидной последовательности.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета прикладных программ Statistica 12.0 (для Windows) и скриптового языка программирования R 4.2.0 в среде RStudio 1.2.5001 с применением специальных прикладных пакетов. Для проверки на соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вейнберга использовался критерий хи-квадрат Пирсона (χ²). Ассоциативный анализ частот генотипов и аллелей проводился с помощью критерия χ². Если предпосылки применения данного критерия не выполнялись, применялся точный критерий Фишера. Для оценки ассоциаций использовался стандартный уровень значимости р < 0.05. Для сравнения значений показателей в более, чем двух выборках, несоответствующих нормальному закону распределения, использовался критерий Краскела–Уоллиса. Оценку потенциальных эффектов полиморфных вариантов генов на формирование патологического фенотипа проводили с помощью расчета показателя отношения шансов (odds ratio; OR) с 95%-м доверительным интервалом (95% CI).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Распределение генотипов всех изученных полиморфизмов генов семейства TNF у больных РС и контрольных лиц соответствовало ожидаемому согласно равновесию Харди–Вайнберга (p > 0.05). Анализ полученных результатов по распределению генотипов исследуемых генов показал связь аллеля С полиморфного локуса rs6074022 гена CD40 с риском развития заболевания (OR = 1.38; 95% ДИ [1.05–1.81]; p = 0.02). Рисковые аллели остальных выбранных локусов генов семейства TNF достоверной связи с развитием РС в исследуемой популяции не продемонстрировали (табл. 2).

С учетом того, что риск развития РС напрямую связан с половой принадлежностью (у женщин РС возникает в 2–3 раза чаще, чем у мужчин), мы сравнили распределение частот полиморфизмов исследуемых локусов генов семейства TNF в зависимости от пола больных РС, однако достоверной связи генотипов и аллелей исследуемых полиморфизмов с полом выявлено не было.

Следующим этапом был проведен поиск ассоциаций исследуемых полиморфизмов с отдельными клиническими проявлениями РС, такими как: тип, характер и возраст дебюта заболевания, тип течения, переход во вторичное прогрессирование, скорость прогрессирования болезни, среднегодовая частота обострений. Мы обнаружили достоверную связь генотипа ТТ (χ² = 10.28; р = = 0.036) и аллеля Т (χ² = 11.4; р = 0.004) полиморфизма rs6074022 гена CD40 со средней скоростью прогрессирования РС (табл. 3). При этом, в группе больных РС носителей генотипа СС у 8 из 14 пациентов (57.14%) наблюдалась высокая скорость прогрессирования РС, у гетерозигот с генотипом ТС доля больных с высокой скоростью прогрессирования составила 47.83% (33 из 69 больных), а у гомозигот ТТ высокая скорость прогрессирования РС имела место лишь у 17.39% (12 из 69) больных. Полученные данные свидетельствуют о влиянии аллеля С на более неблагоприятную клиническую картину РС, однако за счет редкой встречаемости аллеля С, и в особенности, генотипа СС в популяции (генотип СС встречался только у 14 (9.21%) из 152 больных) получить достоверные статистические различия по связи аллеля С со скоростью прогрессирования РС не удалось. Также была выявлена достоверная связь генотипа GA полиморфизма rs1800629 гена TNF-α с более высокой среднегодовой частотой обострений РС по сравнению с генотипом GG (0,41 [0.27; 0.51] и 0.33 [0.23; 0.50] обострений/год, соответственно, p = 0.03).

Следующая задача нашего исследования состояла в поиске ассоциаций полиморфизмов изучаемых генов с ответом на терапию ПИТРС. Поиск ассоциаций проводился путем сравнения частот генотипов и аллелей исследуемых полиморфизмов в подгруппах пациентов с оптимальным, субоптимальным ответом и отсутствием ответа на проводимое лечение ПИТРС согласно критериям No Evidence of Disease Activity-3 (NEDA-3) [21]. В подгруппе пациентов, получавших ПИТРС первой линии оптимальный ответ на терапию наблюдался у 61 больного, субоптимальный – у 65, отсутствие ответа – у 8. Оптимальный ответ на лечение ПИТРС второй линии демонстрировали 12 пациентов, субоптимальный –14 и отсутствие ответа зафиксировано у 12 человек. В результате проведенного анализа ни один из исследуемых полиморфизмов генов семейства TNF не показал достоверной связи с ответом на лечение ПИТРС в исследуемой популяции (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Проводя сравнение полученных нами данных с опубликованными ранее работами следует отметить, что в исследовании, проведенном на популяции в 1679 больных РС, проживающий в разных городах Российской Федерации также была показана достоверная связь аллеля С полиморфного локуса rs6074022 гена CD40 с риском возникновения заболевания, наряду с аллелем Т локуса rs1883832 этого же гена [18], однако в нашей популяции больных связи локуса rs1883832 с развитием РС обнаружено не было. В группе больных, проживающих на территории Новосибирской области, наблюдалась обратная ситуация – с РС достоверную связь продемонстрировал аллель Т локуса rs1883832 гена CD40, а локус rs6074022 связи с риском развития болезни не показал [22]. В популяции же Алтайского края ни один из исследуемых полиморфизмов не показал значимых ассоциаций с РС [23]. Разница в полученных данных может быть объяснена высокой генетической гетерогенностью РС в популяциях больных, проживающих даже на близко расположенных территориях. Еще в одном исследовании, проведенном в популяции пациентов с РС Иордании, была выявлена связь полиморфизмов rs1883832 и rs6074022 гена CD40 с низким уровнем витамина D в сыворотке больных, но связи с риском развития болезни обнаружено не было [17].

Аллель С полиморфизма rs6074022 гена CD40 в популяции Томской области не только показал связь с риском развития РС, но и влияние на развитие более высокой скорости прогрессирования заболевания, а аллель Т этого полиморфизма в свою очередь достоверно связан со средней скоростью прогрессирования РС. Подобные результаты о негативном влиянии аллеля С на скорость прогрессирования РС были получены в исследовании, проведенном на популяции Новосибирской области, по результатам которого носительство аллеля С полиморфизма rs6074022 увеличивало скорость прогрессирования на 0.14 ± 0.06 баллов/год (р = 0.01) [22].

Полученные нами данные о связи генотипа GA полиморфизма rs1800629 гена TNF-α с более высокой частотой обострений РС также подтверждают опубликованные ранее данные о влиянии рискового аллеля А этого полиморфизма на неблагоприятное течение РС [10, 11].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итоги проведенного нами поиска ассоциаций полиморфизмов исследуемых генов цитокинов, относящихся к семейству TNF (rs1800629 гена TNF-α; rs4149584 гена TNFRSF1A; rs6074022, rs1883832, rs1535045, rs11086996 гена CD40), можно заключить, что из выбранных полиморфизмов генов связь с риском развития РС показал редкий аллель С полиморфизма rs6074022 гена CD40. Этот же аллель оказывает влияние и на развитие более высокой скорости прогрессирования болезни. Достоверную связь со средней скоростью прогрессирования РС в популяции больных Томской области демонстрирует аллель Т этого же полиморфизма rs6074022 гена CD40, а генотипа GA полиморфизма rs1800629 гена TNF-α ассоциирован с более высокой частотой обострений РС. Остальные полиморфизмы исследуемых нами полиморфизмов генов семейства TNF не показали достоверной связи как с риском развития болезни, так и с клиническими особенностями заболевания и ответом на терапию ПИТРС первой и второй линий.

Таким образом, на основании описанных ранее и полученных нами данных можно сделать вывод о несомненном участии генов семейства TNF в развитии и формировании клинического фенотипа РС, однако необходимо продолжать поиски, чтобы получить большее количество информации по влиянию полиморфизмов генов цитокинов на РС в разных популяциях больных и пополнять базу знаний о роли этой группы генов в развитии и течении болезни.