Неорганические материалы, 2020, T. 56, № 7, стр. 738-745

ВВЕДЕНИЕ

Рост продолжительности жизни приводит к росту возрастных заболеваний костной ткани, таких как остеопороз, остеомиелит, остеосаркома и др., что ставит перед материаловедами и медиками задачу разработки новых материалов для их лечения. Фосфаты кальция являются основным минеральным компонентом костной ткани, поэтому гидроксиапатит (ГА, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), трикальцийфосфат (ТКФ, Ca₃(PO₄)₂), пирофосфат кальция (ПФК, Ca₂P₂O₇) и ряд других соединений наиболее часто используются для создания новых материалов для восстановления поврежденной костной ткани [1].

Катионные замещения в кристаллической структуре фосфатов кальция являются эффективным способом модификации их свойств [2]. Среди множества элементов интерес представляют и ионы марганца. Несмотря на то что в состав костной ткани ионы Mn²⁺ входят в микроколичествах (менее 0.1 мас. %), они влияют на рост и метаболизм костных тканей [3]. Ранее было показано, что подобные материалы обладают большим потенциалом для регенерации костных и хрящевых тканей [4]. Известно, что изоморфные замещения в структуре фосфатов кальция приводят к увеличению растворимости полученных соединений за счет возникновения локальных дефектов в решетке [5].

Настоящее исследование посвящено изучению физико-химических и биологических свойств марганецсодержащих фосфатов кальция.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Марганецсодержащие фосфаты кальция синтезировали с применением механоактивации из исходных реагентов: оксида кальция, ацетата марганца и двухзамещенного фосфата аммония, по методике, описанной ранее [6]. Для синтеза использовали свежепрокаленный при 900°С оксид кальция, тетрагидрат ацетата марганца, двухзамещенный фосфат аммония. Соотношение реагентов подбиралось из расчета (Ca + Mn)/P = 1.5. Взаимодействие между реагентами с получением конечного продукта после термообработки можно описать общей схемой

Фазовый состав полученных соединений изучали после термообработки при 900°С в течение 1 ч в муфельной печи с помощью рентгеновского дифрактометра Rigaku D/max-2500 (Япония), в режиме отражения, с использованием CuK_α-излучения (λ = 1.5406 Å) в интервале углов 2θ 10°–60°, скорость 3 град/мин. Расшифровку дифрактограмм проводили с помощью программного комплекса Match! Phase Identification from Powder Diffraction (версия 3.8.0.137) с использованием встроенной базы данных COD-Inorg REV214414.

Микроструктуру ТКФ изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа Tescan Vega II SBU (Чехия), оснащенного энергодисперсионным спектрометром INCA Energy 300 фирмы Oxford Instruments (Великобритания). Работу осуществляли в режиме действия вторичных электронов (SE), разрешающая способность прибора 3.0 нм (при 30 кэВ), максимальное увеличение до ×300 000, ускоряющее напряжение 1–3 кэВ. Для уменьшения электрического заряда, образующегося на образце при его сканировании пучком электронов с высокой энергией, при помощи напылительной установки Q150R фирмы Quorum Technologies (Великобритания) на поверхность керамики наносили токопроводящее покрытие – золото. Размер зерен керамики определяли методом случайных секущих [7].

ИК-спектры синтезированных соединений получали для образцов в смесях с бромидом калия на спектрометре Nicolet Avatar-330 (Франция) в интервале 400–4000 см^–1.

Количественное определение содержания марганца выполняли методом атомно-абсорбционной спектрометрии (пламенным вариантом) на атомно-абсорбционном спектрометре iCE 3500 (Thermo Fisher Scientific, США) (пламя: воздух + ацетилен, длина волны 279.5 нм, щель 0.2 нм).

Процесс усадки материала изучали с помощью дилатометра DIL 402-C Netzsch (Германия). В качестве основной методики изучения поведения керамики при нагреве было выбрано измерение линейных размеров образцов при непрерывном повышении температуры с постоянной скоростью (10 град/мин), в диапазоне t_комн–1200°С.

Образцы керамики получали обжигом дисков в муфельной печи при температурах 1000, 1100 и 1200°С, полученных методом двухстороннего одноосного прессования при удельном давлении 100 МПа.

Исследование цитотоксичности проводили с использованием вытяжек и самих материалов согласно требованиям [8, 9]. В качестве модельной среды для приготовления вытяжек была использована культуральная среда ДМЕМ/F12 с добавлением 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина. Приготовление вытяжек проводилось с соблюдением асептики в течение 72 ч. Отношение массы образца (г) к объему экстрагирующей среды (мл) составило 0.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно данным РФА, полученные материалы двухфазны: в случае 0.01MnТКФ содержание фазы витлокита (β-Ca₃(PO₄)₂) составляет ~90 мас. %, фазы ПФК (β-Ca₂P₂O₇) – ~10 мас. %. (рис. 1).

Рис. 1.

Дифрактограммы порошков MnТКФ после обжига при 900°С.

Увеличение содержания марганца в 10 раз привело к увеличению содержания фазы ПФК в 0.1MnТКФ до ~30 мас. % и уменьшению содержания фазы витлокита до ~70 мас. %. Образование фазы ПФК может быть связано с термическим разложением брушита, сформированного в ходе синтеза

ИК-спектры снимали для образцов, прокаленных при 400 и 900°С (рис. 2, 3). Отмечено, что в порошках, прокаленных при 400°С, присутствует интенсивный пик при 3570 см^–1, а также пик при 632 см^–1, которые соответствуют деформационным колебаниям гидроксильной группы [10]. Кроме того, присутствуют колебания, отнесенные к группам ${\text{CO}}_{3}^{{2 - }}$ (1300–1550 см^–1) [11]. Также в области 2350 см^–1 наблюдаются пики колебаний, отнесенных нами к CO₂ из воздуха, появление которых обусловлено особенностями пробоподготовки [12]. Согласно полученным данным, после термообработки при 400°С формируются соединения со структурой апатита.

Рис. 2.

ИК-спектры MnТКФ после термообработки при 400°С.

Рис. 3.

ИК-спектры MnТКФ после термообработки при 900°С.

В порошках, прокаленных при 900°С, пики колебаний гидроксильной группы и ${\text{CO}}_{3}^{{2 - }}$ исчезают, что свидетельствует о разрушении апатитовой структуры.

В ИК-спектрах выделены области наиболее интенсивных колебаний, соответствующих группе ${\text{PO}}_{4}^{{3 - }}$ (565, 603 см^–1, область при 900–1200 см^–1) [13]. С повышением температуры разрешенность этих пиков возрастает.

Кроме того, отмечены интенсивные колебания, отнесенные к группе ${{{\text{P}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}_{7}^{{4 - }}$ (валентные колебания связи P–O–P) [16 ] . При 900°С разрешенность и интенсивность этих пиков возрастает, что свидетельствует о формировании ПФК в виде отдельной фазы. Относительная интенсивность колебаний группы ${{{\text{P}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}_{7}^{{4 - }}$ выше в случае образца с бóльшим содержанием марганца. Этот факт согласуется с результатами, полученными методом РФА.

Возможность вхождения в структуру ТКФ ионов марганца ранее была доказана в [14]. Ионный радиус Mn²⁺ составляет 0.83 Å, что меньше ионного радиуса кальция (1.0 Å) [3]. В случае рассматриваемых соединений содержание марганца несколько занижено (0.15 мас. %) по сравнению с рассчитанным для предложенной брутто-формулы Ca_2.99Mn_0.01(PO₄)₂ (0.18 мас. %), что может быть связано с погрешностью при проведении синтеза. Такая же ситуация наблюдается для образца с бóльшим содержанием марганца: вычисленное для брутто-формулы Ca_2.9Mn_0.1(PO₄)₂ значение составляет 1.77 мас. %, в то время как по данным элементного анализа – 1.49 мас. %.

Поведение материалов при нагреве изучали методом дилатометрии (рис. 4). Из полученных кривых непрерывной усадки видно, что интенсивный процесс спекания начинается в интервале 920–1050°С.

Рис. 4.

Кривые непрерывной усадки: 1 – 0.01MnТКФ, 2 – 0.1MnТКФ.

Микроструктура скола полученной керамики представлена на рис. 5. В табл. 1 представлены значения средних размеров зерна керамики, определенные методом случайных секущих [7].

Рис. 5.

Микроструктура скола керамики из 0.01MnТКФ (а–в) и 0.1MnТКФ (г–е); температура обжига 1000 (а, г), 1100 (б, д) и 1200°С (в, е).

Образцы, полученные отжигом при 1000°С с выдержкой 1 ч, характеризуются неоднородной структурой; при этом изменения элементного и фазового состава не приводят к изменениям микроструктуры. Присутствуют крупные агломераты размером 5–15 мкм. На сколе видны трещины, что может свидетельствовать о низкой прочности и недоспеченности материала.

С увеличением температуры обжига до 1100°С происходит рост зерна керамики; при этом средний размер зерна для образцов с бóльшим содержанием марганца несколько ниже (табл. 1).

На сколе керамики, обожженной при 1200°С, видны сплошные оплавленные области; такой характер микроструктуры свидетельствует о высокой интенсивности процессов спекания, происходящих в материале, и протекании вторичной рекристаллизации.

Исследование цитотоксических свойств вытяжек из исследуемых материалов проводилось на первичной культуре мезенхимальных стромальных клеток человека DPSC 32 (5-й пассаж) с использованием МТТ-теста. На всех исследованных образцах наблюдается нормальная морфология клеток DPSC 32 (рис. 6), однако плотность клеточного слоя на вторые сутки после посева на исследуемых образцах несколько ниже, чем в контроле (на покровном стекле), что обусловлено, по-видимому, условиями начальной адгезии клеток. Ранее было исследовано влияние различных количеств ионов марганца на биологические свойства ТКФ, допированных марганцем. Показано, что наилучшая пролиферативная активность остеобластоподобных клеток наблюдается при содержании 1 мол. % марганца [3]. На основании проведенных экспериментов in vitro на трансформированных клетках DPSC (рис. 6) не выявлено существенных различий между образцами керамики из 0.01ТКФ и 0.1MnТКФ. Данный факт может быть связан с тем, что в исследованных образцах керамики содержание марганца слишком мало для выявления его влияния на пролиферацию остеобластоподобных клеток.

Рис. 6.

Внешний вид трансформированных клеток DPSC через 24 ч после посева на поверхности образцов: контроль (а), 0.01MnТКФ (б), 0.1MnТКФ (в).

Исследование цитотоксических свойств вытяжек из исследуемых материалов проводилось на клетках линии NCTC (клон L-929) с использованием МТТ-теста. Образцы вытяжек из исследуемых образцов не оказывали угнетающего воздействия на клетки (рис. 7–9).

Рис. 7.

Метаболическая активность клеток по результатам МТТ-теста при инкубации 48 ч c вытяжками из материалов: а – 0.01MnТКФ, б – 0.1MnТКФ.

Рис. 8.

Внешний вид трансформированных клеток DPSC через 24 ч после посева на поверхности образцов: а – 0.01MnTKФ, б – 0.1MnTKФ, в – контроль.

Рис. 9.

Внешний вид трансформированных клеток DPSC, культивируемых на седьмые сутки после посева на поверхности образцов: а, б – 0.01MnTKФ, в, г – 0.1MnTKФ, д, е – контроль; а, в, д – собственное свечение, б, г, е – краситель PI (линейка 100 мкм).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено исследование марганецсодержащих фосфатов кальция с различным соотношением фаз. При х = 0.01 содержание фазы витлокита составляет ~90 мас. %, ПФК ~10 мас. %. При повышении содержания марганца (х = 0.1) содержание фазы витлокита ~70 мас. %, ПФК ~30 мас. %. Содержание марганца в образцах составляет ~90 мас. % от заложенного.

Методом ИК-спектроскопии показано, что образцы, прокаленные при 400°С, обладают структурой апатита, тогда как повышение температуры прокалки до 900°С приводит к формированию структуры витлокита и ПФК. Интенсификация процесса спекания начинается в интервале температур 920–1050°С.

Керамика, обожженная при температуре 1000°С, характеризуется недоспеченной структурой скола с трещинами. Повышение температуры обжига до 1100 и 1200°С приводит к формированию плотноспеченной структуры с оплавленными участками и средним размером зерна 15–25 мкм. Увеличение содержания марганца в образцах приводит к снижению размера зерна полученной керамики.

По результатам исследований цитотоксических свойств установлено, что все образцы не являются цитотоксичными, поддерживают пролиферацию и распластывание клеток. Увеличение концентраций ПФК, а также марганца в образцах не оказывает влияния на их цитотоксичность.

Полученные порошки и керамики из них могут быть основой для создания новых материалов для инженерии костной ткани.