Неорганические материалы, 2021, T. 57, № 1, стр. 81-88

ВВЕДЕНИЕ

Постоянно увеличивающиеся число и тяжесть травм опорно-двигательной системы человека, с одной стороны, и высокая частота посттравматических осложнений, связанных с нарушением репаративного остеогенеза, с другой стороны, вызывают необходимость поиска новых способов влияния на репарацию костной ткани и профилактики осложнений.

Восстановление объема костной ткани при коррекции приобретенных или врожденных дефектов является сложной хирургической задачей, при решении которой актуально применение кальцийфосфатных остеопластических материалов, обладающих сформированной пористой структурой, стимулирующей развитие ангиогенеза, ускоряющего в конечном итоге регенерацию костной ткани.

Наиболее распространенным остеопластическим материалом (фосфатом кальция), используемым в области хирургической остеологии, является гидроксиапатит (ГАП) в силу схожести его состава с главным минеральным компонентом костной ткани – карбонатсодержащим нестехиометрическим ГАП Ca_{10 – x – y/2}(HPO₄)_x(CO₃)_y(PO₄)_{6 – x – y}(OH)_2 – x. Большой радиус карбонат-иона создает искажения в решетке ГАП, повышает растворимость в водных средах и увеличивает скорость резорбции в организме реципиента [1].

Большинство кальцийфосфатных цементов не обладают макропористостью, несмотря на высокие значения общей пористости, что затрудняет васкуляризацию, доступ крови к контактным поверхностям матрикса через формирующуюся сеть кровеносных капилляров, ангиогенез и остеоинтеграцию (диаметр остеона находится в пределах 100–150 мкм) [2, 3]. Большое количество исследований направлено на получение макропористых цементов путем добавления в состав цемента растворимых солей, полимеров в виде гранул, волокон: сахарозы, NaHCO₃, Na₂HPO₄, KCl, маннита, желатина, частиц замороженного раствора Na₂HPO₄, полиглактина [2, 4-8]. Можно выделить два основных механизма образования пористости: за счет выделения СО₂ в процессе протекания химической реакции и за счет введения вымываемых добавок солей или полимеров с формированием макропор размером, соответствующим размеру (как правило, коммерчески доступному) вводимых частиц. Растворение порообразующих добавок в самосхватывающихся цементов проводится от нескольких часов до нескольких месяцев для разных по химическому составу добавок. Эффективность указанных методов доказана увеличением макропористости самосхватывающихся цементов, однако в литературных источниках кинетика растворения и остаточное содержание порообразующих добавок к определенному моменту времени не рассмотрены.

Существующие коммерческие апатитовые цементы (Norian SRS, Graftys, β-, γ-BSM, Mimix, Calcibon), используемые в регенеративной медицине, обладают прочностью от 12 до 60 МПа и являются микропористыми. Увеличение макропористости приводит к снижению прочности по экспоненциальному закону. С целью повышения прочности матриксов, полученных по технологии самосхватывающихся цементов, может проводиться подпрессовка цементной пасты [9–11]. В процессе подпрессовки удаляется вода, количество которой влияет на микропористость, увеличивается количество контактных связей.

Еще одним важным условием для улучшения механических характеристик материала является температура, при которой происходит набор прочности. Например, при изменении температуры выдержки от 40 до 80°С при гидролизе подпрессованного α-трикальцийфосфата (ТКФ) прочность увеличивается и достигает 95 МПа при давлении подпрессовки 400 МПа [10].

Целью настоящей работы явилась разработка метода получения матрикса для изготовления хирургических имплантатов по технологии самосхватывающихся цементов на основе карбонатного ГАП с макропористой открытой системой, сформированной с помощью удаляемого порообразователя.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

α-ТКФ получали в ходе твердофазного синтеза обжигом смеси СаСО₃ и CaНPO₄ в мольном соотношении 2 : 1 при 1400°С в течение 1 ч.

Карбонатный гидроксиапатитовый цемент получали смешением α-ТКФ, СаСО₃ и моногидрата однозамещенного фосфата кальция (Са(Н₂РО₄)₂ ∙ Н₂О) в соотношении 85 : 12 : 3 мас. % (состав коммерческого цемента Norian ®SRS).

С целью получения прочных матриксов цементную смесь, увлажненную 10 мас. %-ным раствором 12-водного двухзамещенного гидрофосфата натрия (Na₂HPO₄ · 12H₂O), подвергали одноосному прессованию на гидравлическом прессе П-10, сушили на воздухе в течение суток. Отверждение, набор прочности проводили в растворе Na₂HPO₄ · · 12H₂O при 60°С в течение 3–72 ч.

Макропористость цементного камня достигалась введением парафиновых гранул в сухую цементную смесь в количестве 20–30%, подпрессовкой увлажненной цементной смеси при давлении 130 или 200 МПа и экстракцией парафина из матриксов при воздействии органических растворителей (хлороформа, толуола) в аппарате Сосклета до постоянной массы (точность 0.001 г) с последующими вакуумированием в течение 24 ч и, при необходимости, экстракцией диоксидом углерода в сверхкритическом (СК) состоянии в проточном реакторе (90°C, 100 бар, 6 ч) с использованием насоса высокого давления (TharSFC).

Парафиновые гранулы были получены путем охлаждения при постоянном перемешивании с помощью верхнеприводой мешалки (200 об./мин) нагретой до 80°С смеси парафина и 0.03%-ного мыльного раствора в соотношении 15 : 1. Парафиновые гранулы отфильтровывали и рассеивали на ситах с целью отбора гранул размером 200–500 мкм.

Прочность матриксов определяли на образцах размером 10 × 10 × 30 мм посредством универсальной испытательной машины LFV 10-50T (Walter + Bai AG) при скорости нагружения 8 мм/мин после их выдержки в растворе и высыхания на воздухе в течениe 1 суток.

Открытую пористость полученных реакционно-связанных композиционных материалов определяли методом гидростатического взвешивания в керосине.

Рентгенографические исследования проводили на дифрактометре D/Max-2500 с вращающимся анодом (Rigaku). Съемку осуществляли в режиме на отражение с использованием CuK_α-излучения (интервал углов 2θ = 2°–70°, шаг по 2θ 0.02°, скорость регистрации спектров 1°/мин). Качественный анализ полученных рентгенограмм проводили с помощью пакета программ WinXPOW при использовании базы данных ICDD PDF-2.

Количественный анализ проводили с использованием корундового числа I/I_c (отношение интенсивностей 100%-ных линий вещества и корунда (α-Al₂O₃) в смеси, содержащей по 50 мас. % компонентов). Весовая доля вычислялась по формуле

где I_iA – измеренная интенсивность для i-го рефлекса фазы А, $I_{{iA}}^{{rel}}$ – относительная интенсивность этого рефлекса в базе данных, I/I_c(А) – корундовое число для определяемой фазы А, I_iK, $I_{{iK}}^{{rel}},$ I/I_c(K) – соответствующие величины для всех (включая А) компонентов смеси.

Микроструктуру изучали на сканирующем электронном микроскопе с автоэмиссионным источником LEO SUPRA 50VP (Carl Zeiss). Хром напыляли на образцы с помощью автоматической напылительной установки Quorum Q150T ES.

Содержание групп CH₂ и CH₃ парафина рассчитывали методом ЯМР. Спектры ЯМР ¹H были зарегистрированы при комнатной температуре в CDCl₃ на спектрометре Bruker Avance-400 (400 МГц). Значения химических сдвигов измерены относительно тетраметилсилана. Образцы для ЯМР готовили путем 4-кратной экстракции измельченного матрикса в 6 мл хлористого метилена в УЗИ-бане без нагревания, центрифугирования и упаривания экстракта в вакууме. Остаток растворяли в 0.6 мл CDCl₃. Соотношение [CH₂]/[CH₃] определяли интегрированием сигналов с δ = 1.25 и 0.88 м.д. соответственно.

Доклиническая оценка биосовместимости и степени стимуляции развития ангиогенеза полученных кальцийфосфатных матриксов проводилась в исследованиях in vivo на крысах линии Wistar с использованием модели подкожной имплантации.

Биосовместимость и стимуляцию развития ангиогенеза оценивали с помощью гистологического исследования (шлиф-срезы окрашивались гематоксилином и эозином) морфологических изменений в соединительнотканной капсуле, сформированной вокруг имплантированного в подкожную клетчатку экспериментального животного кальцийфосфатного матрикса с использованием микроскопа и программ ImageView, HistoMorph v.2.2.

Для удобства обработки получаемых результатов была принята балльная система оценки.

Для оценки выраженности воспалительной реакции вокруг имплантированного матрикса:

3 балла – отсутствие воспаления;

2 балла – признаков гнойного воспаления нет, небольшая лейкоцитарная инфильтрация прилегающих к имплантату тканей;

1 балл – выраженная лейкоцитарная инфильтрация тканей без наличия очагов абсцедирования;

0 баллов – выраженное гнойное воспаление.

Для оценки выраженности ангиогенеза в соединительнотканной капсуле, окружающей имплантат:

3 балла – площадь новообразованных сосудов больше 5%;

2 балла – площадь новообразованных сосудов в пределах 3–5%;

1 балл – площадь новообразованных сосудов в пределах 2–4%;

0 баллов – площадь новообразованных сосудов в пределах 0–2%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При выдержке кальцийфосфатных матриксов в растворе 12-водного двухзамещенного гидрофосфата натрия прочностные характеристики увеличиваются на 47% при увеличении времени выдержки с 3 до 6 ч и на 25% – с 6 до 24 ч, далее за трое суток прочность изменяется не более чем на 4% (рис. 1).

Кинетика набора прочности цементного камня зависит от его фазового состава и микроструктуры. По данным РФА (рис. 2), фазовый состав цементного камня после выдержки при 60°С в растворе 12-водного двухзамещенного гидрофосфата натрия представлен ГАП, дигидратом гидрофосфата кальция (ДГФК), непрореагировавшими α-ТКФ, β-ТКФ и карбонатом кальция.

С увеличением времени выдержки в растворе отверждения фазовый состав постепенно изменяется, пики фазы ГАП становятся более интенсивными, происходит превращение α-ТКФ в ГАП. Скорость образования ГАП на сроках твердения выше 24 ч равна скорости гидратации α‑ТКФ (рис. 3), тогда как на сроках 3–24 ч скорость образования ГАП превышает скорость превращения α-ТКФ, что связано с взаимодействием карбоната кальция с моногидратом гидрофосфата кальция и 12-водным двузамещенным гидрофосфатом натрия, приводящим к образованию ДГФК и ГАП. К третьим суткам выдержки в растворе лишь 30% α-ТКФ превращается в ГАП. Наибольшая скорость превращения α-ТКФ характерна для сроков до 3 ч, когда 23% преобразуется в иные фазы (ГАП, ДГФК).

При соприкосновении с водой на контактной поверхности исходных частиц, по-видимому, начинают идти реакции растворения, в связи с чем раствор 12-водного гидрофосфата натрия начинает насыщаться ионами ОН^–, ${\text{HPO}}_{4}^{{2 - }},$ Са²⁺, ${{{\text{H}}}_{2}}{\text{PO}}_{4}^{ - }.$ При прессовании “лишняя” жидкость выжимается, происходит уплотнение, увеличивается количество контактов исходных частиц, что вызвано необратимой деформацией частиц, сокращается количество пор, внутри которых в течение первых суток после формования происходят пересыщение ионами и образование кристаллов ГАП или дигидрата двухзамещенного фосфата кальция. Т.е. в начальные сроки твердения механическая прочность обусловлена в большей степени когезией и адгезией и в меньшей степени образованием и ростом кристаллогидратов.

По мере увеличения количества образованных кристаллогидратов на поверхности исходных частиц ограничивается диффузия жидкости к негидратированой части частиц, в связи с чем замедляется скорость образования целевых фаз, при которой с 24 до 72 ч выдержки доля целевых фаз не превышает 2.7%. Повышение температуры раствора отверждения до 60°С вызвано необходимостью повышения растворимости исходных компонентов для увеличения скорости протекания реакции.

В ИК-спектрах присутствуют интенсивные полосы около 1410–1423, 1450–1470, 712 и 870–875 см^–1, характерные для карбонатных групп ${\text{CO}}_{3}^{{2 - }}.$

На прочностные характеристики матриксов оказывают непосредственное влияние особенности микроструктуры цементного камня. На микрофотографиях образцов через 3 ч выдержки в растворе отверждения видны зародыши кристаллов ГАП на поверхности частиц α-ТКФ, представляющие собой тонкие иглы (рис. 4а, 4б). Через 6 ч твердения на поверхности α-ТКФ наблюдается значительное количество игольчатых кристаллов длиной до 4 мкм и пластинчатых кристаллов ГАП (рис. 4в, 4г). Через 24 ч присутствуют пластинчатые и игольчатые кристаллы длиной около 10 мкм, расположенные сростками. Такая структура сохраняется в течение 48 и 72 ч (рис. 4д, 4е). Происходит заполнение межзернового пространства вновь образованными кристаллами, контактирующими друг с другом, в связи с чем увеличивается механическая прочность (рис. 1). Микроструктура цементного камня не меняется после 24 ч твердения, что, в совокупности с данными по прочностным характеристикам и степени протекания реакции, подтверждает образование слоя новых кристаллов на поверхности α-ТКФ, а также предотвращение диффузии жидкости и дальнейшей гидратации с увеличением содержания целевых фаз.

Для получения макропористых матриксов на основе карбонатного ГАП по низкотемпературной технологии мы использовали метод формирования пористой структуры за счет введения частиц парафина размером 250–500 мкм в сухую смесь с последующим их вымыванием из цементного камня при температуре не выше 120°С. Наиболее подходящими добавками для создания пористой структуры, соответствующими требованиям по температуре экстракции и отсутствию химического взаимодействия с компонентами смеси, являются частицы органических веществ. Преимуществами парафина перед другими органическими веществами являются возможность приготовления гранул различного размера методом несмешивающихся жидкостей, отсутствие химического взаимодействия с матриксом и хорошая растворимость в СК-СО₂.

В качестве растворителей для экстракции парафина использовали хлороформ или толуол. Потери массы образцов рассчитывали в % от значения предыдущего измерения (табл. 1). В табл. 1 приведены средние значения потери массы образцов, содержащих 20% парафиновых гранул в исходной смеси, при экстракции в органических растворителях.

При экстракции парафина в хлороформе масса образцов остается неизменной после 15 ч, в толуоле – после 24 ч. Потери массы образцов не соответствуют исходному содержанию парафина в связи с выплавлением некоторого количества парафина из образцов при выдержке в растворе отверждения при 60°С, а также из-за разницы в массе и плотности исходных и конечных фаз.

Следующим этапом очистки пористых кальцийфосфатных матриксов является воздействие на них СК-СО₂, обладающим высокой диффузионной способностью, низкой вязкостью, способностью хорошо растворять неполярные соединения. Массы образцов после обработки в среде СК-СО₂ незначительно уменьшались на границе точности взвешивания.

В спектрах ЯМР ¹H (табл. 2) наблюдается уменьшение соотношения метиленовых и метильных протонов в парафине матрикса [CH₂]/[CH₃] в процессе экстракции в органическом растворителе и дальнейшее уменьшение в процессе обработки в СК-СО₂, т.е. доля разветвленных алканов в остаточном парафине повышается с увеличением степени очистки образца. Это подтверждает дальнейшую экстракцию парафина в СК-СО₂ после очистки в органическом растворителе, несмотря на то что точность взвешивания не позволяет зафиксировать изменение массы. При этом в спектрах не наблюдается даже следовых количеств использованных растворителей, что указывает на их полное удаление при вакуумировании образцов, обладающих высокими значениями открытой пористости.

Возможно, парафин остался после вымывания в органических растворителях в виде тонких покрытий на внутренней поверхности матриксов и дополнительное воздействие СК-СО₂ привело к более эффективной экстракции.

Открытая пористость матриксов, прессованных при давлении 130 МПа, после экстракции парафина составляет 44 ± 3% для образцов, содержащих 20 мас. % парафина в исходной цементной смеси, и 61 ± 6% – для образцов, содержащих 30 мас. % парафина, что в несколько раз превышает значения пористости образцов, не содержащих парафин в исходной смеси, которая составляет 4 ± 0.4%.

Прессование повышает прочность матриксов на основе карбонатного ГАП в 3.5–4 раза по сравнению с непрессованными формами материала, несмотря на невысокую степень гидратации, преимущественно за счет сил адгезии и когезии. Поэтому создание пористости в таких матриксах приводит к очень резкому падению прочности (рис. 5). Рост давления прессования с 130 до 200 МПа увеличивает прочность на 10–20%. Прочность матриксов, полученных по технологии самосхватывающихся композиций с добавлением 30 мас. % парафиновых гранул с сухую смесь, ниже нижней границы прочности губчатой кости, поэтому для использования матриксов в качестве остеопластического материала максимальное количество введенных гранул ограничивается 20 мас. %.

Доклиническая оценка разработанного материала и оценка необходимости использования дополнительной обработки с помощью СК-СО₂ проводились с использованием модели эктопического остеогенеза. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Карбонатный ГАП не вызывал раздражающего действия на окружающие ткани при имплантации в подкожную клетчатку мелкого лабораторного животного. Отсутствие пористости в кальцийфосфатных имплантатах значительно тормозило развитие ангиогенеза. В свою очередь прессованные матриксы со сформированной макропористой системой активно стимулировали ангиогенез с прорастанием капиллярной сети в пористую систему имплантата. Дополнительная очистка СК-СО₂ показала более активное стимулирование ангиогенеза, что мы связываем с отсутствием тонких парафиновых пленок на кристаллической структуре цементного камня, которые могли остаться после экстракции парафина органическими растворителями. Такие пленки гидрофобизируют поверхность, мешая пропитке матрикса межтканевыми жидкостями и адгезии клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подпрессовка увлажненной цементной смеси для приготовления матриксов по технологии самосхватывающихся цементов приводит к повышению прочностных характеристик, что позволяет на их основе создавать макропористые имплантаты.

Введение парафиновых гранул в состав сухой цементной смеси с последующей экстракцией из гидратированных матриксов позволяет получать макропористые кальцийфосфатные имплантаты. Дополнительная очистка с помощью технологии сверхкритических флюидов макропористого кальцийфосфатного матрикса, предварительно очищенного от парафина органическими растворителями, приводит к повышенной биологической совместимости.

Разработанный кальцийфосфатный матрикс является остеокондуктивным материалом, сформированная макропористость которого обеспечивает развитие ангиогенеза и увеличивает остеоинтеграцию при коррекции патологии опорно-двигательной системы человека.

Данный материал на основе карбонатного ГАП проходит доклиническую оценку в модельных исследованиях in vivo и in vitro для последующей регистрации в качестве изделия медицинского назначения.