Журнал неорганической химии, 2023, T. 68, № 8, стр. 1126-1134

ВВЕДЕНИЕ

Развитие нанотехнологий способствует созданию наноматериалов, перспективных для биомедицинского применения [1]. Основные требования, предъявляемые к таким наноматериалам в отношении их использования в составе фармпрепаратов, связаны с биосовместимостью, отсутствием токсичности, эффективностью терапевтического воздействия. Одним из основных инструментов модификации физико-химических свойств и биохимической активности наноматериалов является функционализация их поверхности различными лигандами [2, 3]. Относительно новым направлением в этой области является создание гибридных антиоксидантов, инактивирующих разные типы свободных радикалов, путем иммобилизации соединений с антиоксидантной активностью на поверхности наночастиц [4–6].

Одними из наиболее известных природных антиоксидантов являются фенольные соединения [7–9]. Ярким представителем этой группы веществ является галловая кислота (3,4,5-тригидроксибензойная кислота, ГК) – продукт гидролиза танинов [10]. Галловая кислота обращает на себя внимание благодаря широкому спектру биологических применений, обусловленных ее антиоксидантными, противомикробными, противовоспалительными, противоопухолевыми, антимутагенными и другими свойствами [11, 12]. Успешное применение галловой кислоты для функционализации поверхности наноматериалов было продемонстрировано на примере различных неорганических наночастиц; усиление биологической активности наночастиц, в том числе антиоксидантных свойств наночастиц после иммобилизации на их поверхности галловой кислоты, наблюдали для Fe₃O₄ [13], γ-AlOOH [14], SiO₂ [15], Ag-Se [16], Au [17–19] и др.

Среди перспективных нанобиоматериалов особое место занимает нанодисперсный СеО₂ [20–24]. Возросший научный и практический интерес к диоксиду церия связан с обнаруженной у него способностью имитировать функции различных ферментов (энзимоподобная активность) [25–31]. Сочетание энзимоподобной активности с относительно низкой токсичностью делает наночастицы СеО₂ перспективными компонентами фармацевтических препаратов нового поколения, в том числе для комбинированной антиоксидантной терапии заболеваний, обусловленных нарушениями редокс-метаболизма [32–36].

Сочетание наночастиц СеО₂ с галловой кислотой описано в единственном исследовании in vivo, в котором продемонстрирован защитный эффект галловой кислоты и наночастиц СеО₂ от нефротоксического действия цисплатина [37]. Полученные в этой работе результаты позволяют сделать вывод о потенциальном синергетическом действии галловой кислоты и нанодисперсного диоксида церия и рассматривать их в качестве перспективных нефропротекторов при химиотерапии [37]. Вместе с тем механизм обнаруженных терапевтических эффектов неясен, что требует проведения дальнейших исследований.

В настоящей работе впервые получены золи диоксида церия, стабилизированные галловой кислотой в различных мольных соотношениях (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1). Хемилюминесцентным методом выполнен анализ антиоксидантной активности полученных материалов в отношении биохимически важных алкилпероксильных радикалов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Электростатически стабилизированный золь СеО₂ получали методом термогидролиза [38]. В качестве прекурсора использовали гексанитратоцерат(IV) аммония (#215473, Sigma). Водный раствор (NH₄)₂Ce(NO₃)₆ (100 г/л) нагревали при 95°C в течение 24 ч. Осадок трехкратно промывали изопропанолом и редиспергировали в деионизованной воде. Оставшийся изопропанол удаляли кипячением коллоидного раствора диоксида церия в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Концентрация полученного золя СеО₂, определенная термогравиметрическим методом, составила 22.3 г/л (0.13 М).

Предварительно был приготовлен водный раствор лиганда – галловой кислоты (30 ммоль/л, ГК, #G7384, Sigma). Поверхность наночастиц СеО₂ функционализировали постепенным добавлением электростатически стабилизированного золя СеО₂ к раствору лиганда с последующим перемешиванием в течение 30 мин. Мольное соотношение СеО₂ : лиганд составляло 1 : 1, 1 : 2 и 2 : 1.

Рентгенофазовый анализ высушенных образцов золей СеО₂ проводили на дифрактометре Bruker D8 Advance (Германия), CuK_α-излучение, геометрия θ–2θ.

Для регистрации электронных спектров поглощения золей СеО₂ использовали спектрофотометр СФ-2000. Регистрацию спектров проводили в диапазоне длин волн от 200 до 700 нм.

Исследование коллоидных растворов СеО₂ методом динамического рассеяния света и анализ их электрокинетических свойств проводили при 20°C с использованием анализатора Photocor Complex (мощность излучения 25 мВт, диодный лазер, λ = 650 нм).

Анализ образцов методом инфракрасной (ИК) спектроскопии проводили на ИК-Фурье-спектрометре Bruker Vertex 70, оснащенном модулем однократного нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО, алмазный кристалл). Диапазон волновых чисел 4000–100 см^–1, разрешение 1 см^–1, число сканирований 64, число сканирований фона 64, температура кристалла 50°С. Обработка результатов измерений включала выравнивание базовой линии всего спектра в диапазоне от 4000 до 100 см^–1, сглаживание спектра по 25 точкам, сглаживание (генерация прямолинейной области спектра) области поглощения CO₂ от 2200 до 2400 см^–1. Образцы для исследования представляли собой нестабилизированный золь СеО₂, композит CeO₂@ГК (1 : 1) и исходный образец лиганда (галловая кислота). Для исследования жидких образцов на термостатируемый алмазный кристалл при 50°С наносили от 6 до 9 мкл пробы, в течение 3–5 мин дожидались полного высыхания образца, затем проводили регистрацию спектров; для исследования твердых образцов порошок наносили на кристалл, затем прижимали винтом и проводили регистрацию спектров.

Антиоксидантную активность золей СеО₂ анализировали по отношению к алкилпероксильным радикалам методом люминол-активированной хемилюминесценции [39] на 12-канальном приборе Lum-1200 (DISoft, Россия). Образование радикалов происходило в результате термоиндуцированной реакции разложения 2,2'-азо-бис(2-амидинопропан) дигидрохлорида (АБАП). Регистрацию хемилюминесценции проводили в среде фосфатного буферного раствора (PBS, 100 мМ, рН 7.4) при 37°C. В кювету с PBS добавляли смесь АБАП (2.5 μM, #123072, Sigma) с люминолом (2.0 μM, #123072, Sigma) и регистрировали свечение. После выхода интенсивности хемилюминесценции на постоянный уровень к смеси добавляли аликвоту исследуемого образца. Для обработки хемилюминограмм использовали программное обеспечение PowerGraph (версия 3.3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Физико-химическая характеристика композитов CeO₂@ГК. Рентгенограммы высушенного исходного золя СеО₂, полученного термогидролизом гексанитратоцерата(IV) аммония, и композита CeO₂@ГК (1 : 1) представлены на рис. 1а.

Рис. 1.

Рентгенограммы порошков СеО₂ и композита СеО₂@ГК (1 : 1) (а); УФ-спектры поглощения нестабилизированного золя СеО₂, композита СеО₂@ГК (1 : 1) и галловой кислоты (б), композитов СеО₂@ГК (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1) (в).

На рентгенограммах образцов СеО₂ присутствуют рефлексы (111), (200), (220), (311), характерные для однофазного кубического диоксида церия (PDF2 34-0394). Функционализация поверхности наночастиц СеО₂ органическим лигандом не приводит к существенному изменению вида дифрактограмм (рис. 1а). Рентгенограмма наночастиц СеО₂, стабилизированных галловой кислотой (1 : 1), по расположению рефлексов соответствует рентгенограмме индивидуального нанокристаллического диоксида церия (рис. 1а). Размеры частиц, определенные по соотношению Шеррера [40] для наночастиц СеО₂ без стабилизатора и диоксида церия в составе композита CeO₂@ГК (1 : 1), составили 3.3 и 3.6 нм соответственно.

На электронных спектрах поглощения образцов немодифицированного золя СеО₂ и индивидуального раствора галловой кислоты (рис. 1б) присутствуют полосы поглощения, характерные для диоксида церия (область 280–300 нм) и анионной формы галловой кислоты (211 и 260 нм).

В спектрах поглощения композитов CeO₂@ГК (рис. 1б, 1в) положение полос, характерных для индивидуальных компонентов, остается неизменным. Отметим, что при иммобилизации галловой кислоты на других носителях, например на наночастицах γ-AlOOH, наблюдался батохромный сдвиг ее полос поглощения при 215 и 264 нм [14]. Увеличение содержания СеО₂ в составе композита CeO₂@ГК (2 : 1) (рис. 1в) приводило к увеличению интенсивности полосы поглощения СеО₂ и уменьшению интенсивности полос поглощения галловой кислоты.

Методом динамического рассеяния света для наночастиц СеО₂ без стабилизатора и композита СeO₂@ГК (1 : 1) были определены величины средних гидродинамических диаметров частиц, равные 12 и 16 нм соответственно. Анализ электрокинетических свойств золей показал, что модификация поверхности нанодисперсного диоксида церия галловой кислотой (1 : 1) привела к снижению абсолютной величины ζ-потенциала от +40.1 ± 0.5 до +31.2 ± 0.7 мВ. Это связано с тем, что на поверхности частиц в исходном золе СеО₂ находятся протонированные ОН-группы, а галловая кислота присутствует в растворе в анионной форме. Аналогичный характер изменения ζ-потенциала после связывания с галловой кислотой наблюдали ранее для наночастиц γ-AlOOH [14]. Поскольку коллоидные растворы с абсолютным значением ζ-потенциала более 30 мВ считаются стабильными, можно констатировать, что золь СеО₂, модифицированный галловой кислотой (1 : 1), обладает хорошей агрегативной устойчивостью.

В ИК-спектре нестабилизированного золя CeO₂ в диапазоне от 4000 до 100 см^–1 были идентифицированы полосы поглощения, характерные для диоксида церия (рис. 2а).

Рис. 2.

ИК-Фурье-спектры нестабилизированного золя CeO₂ и композита CeO₂@ГК (1 : 1) в диапазоне от 4000 до 100 см^–1 (а), деконволюция ИК-Фурье-спектра нестабилизированного золя CeO₂ в диапазоне от 550 до 100 см^–1 (б).

Полосы поглощения диоксида церия наблюдали при 720 [41], 457 и 285 см^–1 [42]. Сигнал при 285 см^–1 является суперпозицией нескольких полос поглощения [42], что подтверждает деконволюция спектра (рис. 2б). В качестве аналитического критерия оценки взаимодействия наночастиц СеО₂ и лиганда были выбраны величины смещений (Δν_Ce–O, см^–1) максимумов полос поглощения диоксида церия при 285 и 457 см^–1. На рис. 2а приведен ИК-спектр композита CeO₂@ГК (1 : 1), в котором наблюдается сдвиг полос поглощения связи Ce–O (Δν_Ce–O) на 80 и 10 см^–1 соответственно. Полосы поглощения в ИК-спектре нестабилизированного золя СеО₂ (рис. 2а) при 1030, 807 и 736 см^–1 обусловлены присутствием органических компонентов [43]. Полоса поглощения c максимумом при 1280 см^–1, а также неразрешенный сигнал с максимумами при 1513 и 1460 см^–1 (рис. 2а) соответствуют остаточным нитрат-ионам [44]. Полоса поглощения при 1630 см^–1 обусловлена колебаниями H–O–H, широкая полоса в области 3430 см^–1 соответствует валентным колебаниям связи О–Н [45].

Различие в величинах смещений полос при 285 и 457 см^–1 вызвано в первую очередь различиями в энергии нековалентного взаимодействия функциональных групп лиганда с наночастицей CeO₂. Поскольку в молекулах галловой кислоты имеются OH-группы фенольного типа, вероятнее всего, взаимодействие между диоксидом церия и лигандом происходит за счет образования водородных связей между Ce–OH и галлат-ионами или хемосорбции галлат-ионов на поверхности наночастиц CeO₂. Аналогичный механизм связывания наночастиц с лигандом наблюдали при взаимодействии галловой кислоты с наночастицами магнетита [13]. Таким образом, на основании анализа ИК-спектров можно сделать заключение о формировании композита CeO₂@ГК (1 : 1).

Антиоксидантные свойства композитов CeO₂@ГК. Антиоксидантные свойства модифицированных золей СеО₂ анализировали по отношению к алкилпероксильным радикалам методом люминол-активированной хемилюминесценции. Хемилюминограммы, зарегистрированные после добавления композитов CeO₂@ГК (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1) к раствору, содержащему АБАП (источник свободных радикалов) и люминол, представлены на рис. 3.

Рис. 3.

Хемилюминесцентные кривые для композитов CeO₂@ГК (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1); концентрация по CeO₂: 0.50 мкМ (1 : 1), 0.25 мкМ (1 : 2), 0.50 мкМ (2 : 1).

Как видно, добавление композитов СеО₂@ГК (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1) к раствору с алкилпероксильными радикалами и люминолом приводит к подавлению свечения с последующим выходом интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции на новый стационарный уровень. Хемилюминограммы композитов СеО₂@ГК отражают разнонаправленную редокс-активность наночастиц СеО₂, модифицированных галловой кислотой, по отношению к алкилпероксильным радикалам. Для понимания роли нанодисперсного диоксида церия и вклада лиганда в наблюдаемую редокс-активность были зарегистрированы хемилюминограммы для нестабилизированного золя СеО₂ и индивидуального раствора галловой кислоты (рис. 4).

Рис. 4.

Хемилюминесцентные кривые для нестабилизированного золя СеО₂, индивидуального раствора галловой кислоты и композитов CeO₂@ГК 1 : 1 (0.50 мкМ) (a), 1 : 2 (0.25 мкМ) (б), 2 : 1 (0.50 мкМ) (в), в скобках указана концентрация по СеО₂.

В исследованном диапазоне концентраций (0.02–1.00 мкМ) исходный нестабилизированный золь СеО₂ не проявлял антиоксидантную активность по отношению к алкилпероксильным радикалам (рис. 4). Поскольку анализ антиоксидантных свойств золей осуществляли в среде, содержащей ионы ${\text{PO}}_{4}^{{3 - }}$, можно предположить, что отсутствие влияния со стороны наночастиц СеО₂ на люминол-зависимую хемилюминесценцию было обусловлено фосфатированием поверхности наночастиц СеО₂, что хорошо коррелирует с литературными данными. Ингибирующее влияние фосфат-ионов на различные виды каталитической активности нанодисперсного диоксида церия было подробно исследовано ранее [46–48]. Анализ хемилюминесцентных кривых композитов СеО₂@ГК (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1), а также их компонентов (рис. 4), наночастиц СеО₂ и галловой кислоты, позволил сделать вывод о том, что редокс-активность модифицированных золей СеО₂ в основном обусловлена галловой кислотой. Галловой кислоте присуща двойственная роль в свободнорадикальных реакциях [10, 49–51]. Являясь сильным антиоксидантом, галловая кислота одновременно зарекомендовала себя в качестве эффективного агента, индуцирующего апоптоз клеток за счет прооксидантной активности [10, 50]. Радикал-перехватывающие свойства производных галловой кислоты (3,4,5-тригидроксибензойная кислота) напрямую зависят от присутствия в структуре гидроксильных групп и их стерической доступности [52]. В частности, наиболее эффективными при инактивации свободных радикалов являются пара- и орто-гидроксильные группы фенольных кислот [50, 53]. На антиоксидантную активность галловой кислоты в значительной степени влияет присутствие переходных металлов, например, ионов Fe(II) или Fe(III) [49, 54, 55]. Важным фактором, регулирующим антиоксидантную и прооксидантную активность галловой кислоты в системах типа Фентона, Fe(III)/H₂O₂, является ее концентрация [10, 50]. При низких концентрациях галловой кислоты (соотношение в реакционной среде ГК : Fe(II) < 2 : 1) преобладает прооксидантный эффект: восстановление ионов Fe³⁺ до Fe²⁺ приводит к образованию HO•. При высоких концентрациях галловой кислоты (соотношение в реакционной среде ГК : Fe(II) > 2 : 1) общий эффект – антиоксидантный благодаря радикал-перехватывающей активности галловой кислоты по отношению к гидроксильным радикалам. Галловая кислота способна стимулировать образование свободных радикалов, проявляя прооксидантную активность, за счет слабого хелатирования ионов металлов [10, 50].

В зависимости от мольного соотношения между наночастицами СеО₂ и галловой кислотой (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1) виды хемилюминесцентных кривых композитов СеО₂@ГК различаются (рис. 4). Взаимодействие наночастиц СеО₂ с галловой кислотой приводит к ослаблению ее антиоксидантных и прооксидантных свойств. Данный эффект наиболее выражен в случае золя СеО₂, модифицированного галловой кислотой в мольном соотношении 2 : 1 (рис. 4в). Вероятно, это обусловлено частичным окислением галловой кислоты при связывании с наночастицами СеО₂. В работе, посвященной кинетическим аспектам окисления галловой кислоты гексанитратоцератом(IV) аммония в азотнокислой среде, показано, что эта реакция идет через стадию образования первичного комплекса между ионами Ce(IV) и галловой кислотой [49]. Первичный комплекс диспропорционирует с образованием Ce(III) и продукта окисления типа о-бензохинона. Дальнейшее окисление приводит к образованию ионов Ce(III) и конечных продуктов – муравьиной кислоты и СО₂. С увеличением содержания в реакционной смеси Ce(IV) константа скорости окисления галловой кислоты заметно снижается. Поскольку Ce(IV) существует в азотнокислой среде в виде аквагидроксокомплексов, замедление реакции окисления галловой кислоты связывают с образованием димерных ионов, обладающих малой реакционной способностью [56]. Важное значение для формирования димеров имеет pH реакционной среды. Влияет рН среды и на характер взаимодействия наночастиц и лиганда. Галловая кислота представляет собой двухосновную органическую кислоту со значениями pK_a, равными 4.1 (для карбоксильной группы) и 8.38 (для гидроксильной группы). Ранее было показано, что стабилизация коллоидных растворов золота галловой кислотой при низких значениях pH может идти через формирование комплекса между наночастицами Au и карбоксильной группой лиганда, а при более высоких рН – за счет взаимодействия наночастиц Au c гидроксильной группой [18].

Для количественного описания антиоксидантных и прооксидантных свойств композитов СеО₂@ГК были введены параметры S и ΔI (рис. 5а). Антиоксидантная емкость (S) представляет собой площадь области подавления хемилюминесценции, прооксидантная емкость (ΔI) – разность между начальным (I₀) и последующим (после добавления образца) стационарным уровнями хемилюминесценции (I).

Рис. 5.

Хемилюминесцентная кривая для композита СеО₂@ГК (1 : 1, 0.17 мкМ) с обозначенными параметрами S (антиоксидантная емкость) и ΔI (прооксидантная емкость) (а); гистограммы распределения параметров S (б) и ΔI (в) для разных концентраций композитов СеО₂@ГК (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1); указаны концентрации по СеО₂.

Сравнение значений параметров S и ΔI, определенных для одинаковых концентраций модифицированных золей СеО₂, продемонстрировало, что увеличение доли диоксида церия в составе композитов СеО₂@ГК (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1) приводит к существенному снижению S и ΔI (рис. 5б, 5в). Таким образом, наиболее ярко выраженная редокс-активность, проявляющаяся как сочетание антиоксидантных и прооксидантных свойств, характерна для композита СеО₂@ГК (1 : 2), а наименьшей активностью обладает композит СеО₂@ГК (2 : 1) (рис. 5б, 5в). Эти данные согласуются с немногочисленными исследованиями, в которых показано, что наночастицы СеО₂, стабилизированные лигандами в различных соотношениях, проявляют различную биологическую активность [57]. Так, среди образцов СеО₂, модифицированных лимонной кислотой/ЭДТА в соотношениях 100 : 0, 70 : 30, 60 : 40, 50 : 50, 40 : 60, 30 : 70, 20 : 80, 0 : 100, наибольшей антиоксидантной активностью и значимыми нейропротекторными свойствами обладали наночастицы СеО₂, стабилизированные лигандом в соотношении 50 : 50 [57].

В ряде предшествующих исследований показано, что модификация различных наночастиц галловой кислотой приводит к синергетическому эффекту, выраженному в усилении биологической активности полученных наноматериалов [13–15, 17–19]. Так, например, в случае наночастиц магнетита антиоксидантная активность образцов Fe₃O₄@ГК возрастала в 2–4 раза [13]. В настоящей работе для количественной оценки влияния наночастиц СеО₂ на антиоксидантные и прооксидантные свойства галловой кислоты были зарегистрированы хемилюминесцентные кривые для разных концентраций композитов СеО₂@ГК и индивидуального раствора галловой кислоты (рис. 6) и получены уравнения концентрационных зависимостей параметров S и ΔI (табл. 1).

Рис. 6.

Хемилюминесцентные кривые для композитов CeO₂@ГК 1 : 1 (а), 1 : 2 (б), 2 : 1 (в) и индивидуального раствора галловой кислоты (г); зависимости параметров S (д) и ΔI (е) от концентрации галловой кислоты.

Для 1 мкмоль/л раствора галловой кислоты установлено, что иммобилизация на поверхности наночастиц СеО₂ в мольном соотношении 2 : 1 приводит к снижению ее антиоксидантной и прооксидантной емкости на 40 ± 3% и 58 ± 9% соответственно. Как видно, связывание галловой кислоты с наночастицами диоксида церия в большей степени оказывает влияние на ее прооксидантные свойства. Отметим, что в недавнем исследовании in vivo было показано, что совместное использование наночастиц СеО₂ и галловой кислоты обеспечивает защиту от нефротоксичного действия цисплатина [37]. Авторы выдвинули предположение о потенциальном синергетическом эффекте.

Благодаря различным видам биологической активности, включая противоопухолевую, противовирусную, антибактериальную, антимутагенную и др., галловая кислота является перспективным лигандом для получения на ее основе гибридных наноматериалов с новыми свойствами [50]. В свою очередь, это делает актуальным необходимость всестороннего анализа таких наноматериалов для дальнейшего биомедицинского применения. Результаты настоящего исследования могут способствовать пониманию механизмов взаимного влияния наночастиц и лигандов, а также прогнозированию вероятных биологических последствий при введении наночастиц в организм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получены новые агрегативно-устойчивые золи диоксида церия, модифицированные галловой кислотой. Успешная функционализация поверхности наночастиц СеО₂ подтверждена методом ИК-спектроскопии. Показано, что композиты СеО₂@ГК (1 : 1, 1 : 2, 2 : 1) обладают разнонаправленной редокс-активностью по отношению к алкилпероксильным радикалам, проявляя как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. Установлено, что редокс-активность композитов обусловлена в большей степени галловой кислотой. Найдено, что модифицирование наночастиц СеО₂ галловой кислотой приводит к снижению ее антиоксидантного и прооксидантного потенциала. Полученные данные могут иметь важное значение для разработки препаратов, применяемых при нарушениях редокс-метаболизма. Иммобилизация галловой кислоты на поверхности наночастиц СеО₂ может оказаться полезным инструментом для регулирования ее антиоксидантных и прооксидантных свойств.