Журнал неорганической химии, 2023, T. 68, № 9, стр. 1165-1180

ВВЕДЕНИЕ

Нейтральные тетранитрозильные комплексы железа (эфиры “красной соли Руссена”, RREs) с алифатическими [1–13] и ароматическими тиолилами [14–21] представляют практический интерес для медицины [22, 23] как “рабочая форма” [24, 25] монооксида азота (NO) – важнейшей сигнальной молекулы в организме [26–45] из-за их хорошей стабильности, простоты синтеза и относительно низкой цитотоксичности [27]. RREs, находясь в равновесии с моноядерными динитрозильными комплексами железа, образующимися при трансформации RREs в полярных средах, участвуют в процессах транспорта NO к клеточным мишеням и являются перспективным классом экзогенных доноров NO для химиотерапии оксидом азота (NO-терапия) социально значимых заболеваний благодаря отсутствию необходимости их специальной (термо-, фото- или ферментативной) активации для генерации NO [46]. Показано, что RREs обладают широким спектром фармакологических свойств в зависимости от природы тиолатных лигандов.

Перспективным направлением в дизайне новых представителей этого семейства являются синтез и исследование RREs, содержащих тиофенолил (PhS-) и его производные [14–18]. Нами получен ряд RREs на основе тиофенола и его производных с различными заместителями [47–53] и установлено, что природа заместителя в тиофенолильном лиганде оказывает влияние на их NO-донорную и связанную с ней фармакологическую активность. Для RREs с лигандами на основе тиофенола и его окси-, амино- и нитропроизводных было обнаружено три кинетических профиля генерации NO [54]. При NO-донировании “взрывного” типа, характерном для комплексов с аминотиофенильными лигандами, которые демонстрируют высокую противоопухолевую активность [49, 50, 55], значительная часть NO быстро высвобождается в раствор в течение 1–3 мин. В случае генерации NO, характерной для комплексов с тиофенолом и его нитропроизводными, демонстрирующих антибактериальную активность, сравнимую с антибиотиками [56], на кинетических кривых наблюдается быстрый выход на насыщение задолго до полного выхода в раствор всех групп NO, содержащихся в структуре исходного комплекса (псевдонасыщение). Пролонгированный тип NO-донирования, проявляемый антибактериальными RREs с гидроксифенильными лигандами, характеризуется практически постоянной скоростью выделения NO в раствор без выраженного перехода к насыщению (10–12 мин). Эти два последних типа NO-донирования обусловлены образованием в системе долгоживущих нитрозильных интермедиатов. Недавно нами было показано [57], что введение акцепторных заместителей – двух атомов хлора – в тиофенолил позволило получить RRE, который в ДМСО распадается на моноядерные динитрозильные комплексы с 3,4-дихлортиофенолильным и ДМСО-лигандами. Хранение этого RRE в ДМСО приводит к увеличению его NO-донорной активности (из-за координации ДМСО), а в реакции его с бычьим сывороточным альбумином образуется высокомолекулярный продукт с долговременной пролонгированной генерацией NO. Такой эффект для RREs был получен впервые и позволяет предположить, что введение акцепторных заместителей в тиофенолил обеспечит высокую антибактериальную активность новых RREs, которые могли бы стать заменой используемым в клинике антибиотикам и/или превосходить их в плане эффективности, малой токсичности и отсутствия развития бактериальной резистентности.

В настоящей работе впервые синтезированы два новых RRЕs общего состава [Fe₂R₂(NO)₄], где R = 2,4-дифтортиофенилил (комплекс 1) и 3,4-дифтортиофенилил (комплекс 2), исследовано их строение (методами РСА, ИК-, ЭПР-, мессбауэровской спектроскопии), а также антибактериальная активность и цитотоксические свойства в сравнении с ранее cинтезированным комплексом [Fe₂R₂(NO)₄] c R' = 3,4-дихлортиофенилил (комплекс 3) [57].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали коммерческие препараты 2,4-дифтортиофенол (98%) и 3,4-дифтортиофенол фирмы Sigma-Aldrich. Соль Na₂[Fe(S₂O₃)₂(NO)₄] ⋅ 4H₂O была получена по методике [58].

Методика приготовления нитрозильного комплекса 3 описана в работе [57].

Все операции по приготовлению и смешиванию растворов проводили в инертной атмосфере.

Общая методика синтеза комплексов 1 и 2. В трехгорлую колбу, продутую аргоном в течение 0.5 ч, помещали смесь 0.287 г Na₂[Fe(S₂O₃)₂(NO)₄] ⋅ · 4H₂O и 0.248 г Na₂S₂O₃ ⋅ 5H₂O в 25 мл воды. Соответствующий дифтортиофенол (0.2 мл) смешивали с раствором 0.08 г NaOH в 2.5 мл воды. Полученный раствор при интенсивном перемешивании прикапывали в реакционную колбу в токе аргона и оставляли на сутки при температуре +4°С. Выпавший осадок отфильтровывали через стеклянный фильтр № 4 под аргоном и растворяли в хлористом метилене. Раствор частично упаривали и помещали в морозильную камеру при ‒18°С. Через сутки выпадали кристаллы, которые отфильтровывали через мембранный фильтр и сушили на воздухе. Выход составил 79% для комплекса 1 и 62% для комплекса 2.

Кристаллы для рентгеноструктурного анализа были получены двойной перекристаллизацией реакционного продукта из абсолютного хлористого метилена, очищенного по методу [59] при –18°С.

Элементный анализ поликристаллов 1 и 2 выполнен в АЦКП ИПХФ РАН на CHNS/O-элементном анализаторе VarioMicrocube. Анализ на содержание железа проведен методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии в пламени ацетилен–воздух с использованием дейтериевого корректора фона на атомно-абсорбционном спектрофотометре AAS-3 фирмы Carl Ceiss Jena (Германия). В работе была использована лампа с полым катодом. Определение железа проводили на резонансной линии λ = 248.3 нм.

ИК-спектры записывали на Фурье-спектрометре (Bruker ALPHA) в диапазоне частот 400–4000 см^–1 в режиме НПВО при комнатной температуре.

ИК-спектр 1: 3461 (оч. сл.), 3091 (сл.), 3003 (сл.), 1786 (ср.), 1746 (с.), 1701 (с.), 1620 (ср.), 1588 (оч. с.), 1479 (с.), 1416 (с.), 1454 (ср.), 1294 (cр.), 1261 (оч. с.), 1227 (ср.), 1139 (оч. с.), 1113 (оч. с.), 1058 (ср.), 1022 (ср.), 959 (с.), 947 (ср.), 849 (с.), 806 (с.), 732 (с.), 696 (ср.), 632 (ср.), 602 (ср.), 550 (ср.), 501 (ср.), 459 (ср.), 445 (ср.). ν_NO, cм^–1 = 1786, 1746, 1701.

ИК-спектр 2: 3092 (сл.), 3002 (сл.), 1787 (ср.), 1743 (ср.), 1695 (ср.), 1600 (ср.), 1493 (с.), 1403 (ср.), 1269 (ср.), 1238 (ср.), 1196 (ср.), 1114 (ср.), 1061 (сл.), 1022 (ср.), 945 (с.), 898 (с.), 861 (с.), 808 (с.), 769 (с.), 645 (ср.), 621 (ср.), 589 (ср.), 573 (ср.), 448 (ср.). ν_NO, cм^–1 = 1787, 1743, 1695.

Мессбауэровская спектроскопия. Мессбауэровские спектры поглощения комплексов 1 и 2 снимали на установке WissEl (Германия), работающей в режиме постоянного ускорения. Источником γ-излучения служил ⁵⁷Сo в матрице Rh. Измерения спектров при низких температурах проводили с помощью проточного гелиевого криостата СF-506 (Oxford Instruments) с регулируемой температурой от 4.2 до 305 K. Калибровку скорости осуществляли с обогащенной железной фольгой ⁵⁷Fe 1 мкм.

Обработку мессбауэровских спектров проводили методом наименьших квадратов в предположении лоренцевой формы составляющих линий поглощения.

Рентгенодифракционные эксперименты для соединений 1 и 2 выполняли при температуре T = = 100 K на дифрактометре XСalibur с CCD-детектором с использованием MoK_α-излучения (λ = = 0.71073 Å) и графитового монохроматора. Параметры элементарной ячейки определяли на основе отражений с 2θ = 4°–60° и уточняли после завершения сбора данных по более чем 1000 отражений с I > 6σ(I). Интегрирование интенсивностей и профильный анализ осуществляли с использованием процедуры, встроенной в программный комплекс CrysAlisPro (Agilent Technologies). Структуры расшифрованы прямым методом. Позиции и температурные параметры неводородных атомов уточнены в изотропном, а затем анизотропном приближении полноматричным методом наименьших квадратов. Атомы водорода выявлены из разностных синтезов Фурье, их позиции уточнены в изотропном приближении. Кристаллографические данные и основные параметры уточнения представлены в табл. 1, основные межатомные расстояния и валентные углы – в табл. 2. В структуре 2 один из атомов F разупорядочен по двум позициям с заселенностями 62 и 38%.

Все расчеты выполнены с помощью комплекса программ SHELXTL [60]. Координаты атомов и другие параметры уточнения структуры соединений 1 и 2 депонированы в Кембриджском банке структурных данных под № 2258437 и 2258436.

ЭПР-спектроскопия. Спектры ЭПР растворов 1 и 2 регистрировали на ЭПР-спектрометре Bruker Elexsys II E 500 при комнатной температуре. Растворы помещали в тонкостенные стеклянные ампулы с внутренним диаметром 1.0 мм. Концентрацию парамагнитных центров и g-фактор определяли с помощью пакета программ Xepr. Для проверки правильности этих процедур использовали водный раствор нитроксила и образец ДФПГ с g-фактором 2.0036. Процедура определения концентрации, используемая в пакете программ Xepr, включает двойное интегрирование спектра, учитывает добротность резонатора и спиновый фактор S(S + 1). Ниже принимается S = 1/2. Точность определения концентрации парамагнитных центров ∼15%.

Определение концентрации нитрит-ионов с помощью реакции Грисса. Растворы комплексов 1 и 2 с концентрацией 6 × 10^–4 моль/л готовили в 0.05 М буфере трис-HCl, рН 7.0. Отбирали аликвоты реакционной смеси комплексов (0.3 мл) и вносили в сосуды, содержащие 0.9 мл 0.5%-ного раствора сульфаниламида в 0.25 М HCl. Через 5 мин инкубации добавляли 0.6 мл 0.02%-ного раствора N-(1-нафтил)этилендиамина дигидрохлорида в 0.5 М HCl. Через 10 мин определяли величину оптической плотности при 540 нм. Концентрацию образующихся в процессе распада комплекса нитритов рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для NaNO₂.

Исследование цитотоксических свойств. Оценку цитотоксических свойств проводили с помощью МТТ-теста на линии клеток Vero (почечный эпителий африканской зеленой мартышки). Клетки высеивали в 96-луночные планшеты в концентрации 5 × 10⁴ кл/мл. Исследуемые соединения вносили в культуральную среду через 24 ч после высеивания. Комплексы растворяли в ДМСО в исходной концентрации 400 ммоль/л. Конечные концентрации комплексов составляли от 400 до 3 мкмоль/л. Конечная концентрация ДМСО в образцах составляла 0.001%. Данная концентрация ДМСО не влияла на жизнеспособность клеток. Краситель МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид 2) добавляли в инкубационную среду через 24 и 72 ч после введения исследуемых соединений и проводили окрашивание клеток в течение 3 ч. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100%-ном ДМСО. Измерение оптической плотности проводили при основной длине волны 570 нм и фоновой длине волны 620 нм с использованием многофункционального микропланшетного ридера Spark 10M (Tecan, USA). Значения доз IC50 вычисляли с помощью анализа медианного эффекта.

Исследование антибактериальной активности проводили модифицированным микрометодом серийных разведений путем определения минимальной концентрации, подавляющей видимый рост бактерий в бульонной культуре (МПК), с последующим определением минимальной бактерицидной концентрации (МБК), вызывающей гибель микроорганизмов. Исследования проводили на культурах грамотрицательных бактерий Escherichia coli (штамм BB) и грамположительных бактерий Micrococcus luteus (штамм 21/26). Для проведения экспериментов рабочие суспензии обеих культур бактерий разводили в 100 раз в стерильной среде LB (пептон 1%, дрожжевой экстракт 0.5%, NaCl 1%, глюкоза 0.1%, pH 6.8–7.0) и высеивали по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов. Конечная концентрация микроорганизмов в лунке составляла 5 × 10⁵ КОЕ/мл. Комплексы и лиганды растворяли в ДМСО в исходной концентрации 400 ммоль/л. Перед нанесением соединения разводили в стерильной среде LB в 100 раз и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов, содержащих суспензию бактерий. Конечные концентрации исследуемых соединений составляли 12 последовательных двукратных разведений от 2000 до 0.98 мкмоль/л. Конечная концентрация ДМСО во всех образцах составляла 10%. Данная концентрация ДМСО не влияла на жизнеспособность микроорганизмов. Контрольные образцы выращивали в среде LB, в среде LB с 10% ДМСО при 37°С и в качестве отрицательного контроля в среде LB при 4°С. После внесения исследуемых соединений образцы инкубировали при температуре 37°С в течение 18–24 ч. В качестве контрольных антибактериальных агентов использовали ампициллин (ОАО “Синтез”, Россия) и канамицин (ОАО “Синтез”, Россия). Антибиотики растворяли в стерильной среде LB. Конечные концентрации антибиотиков составляли 12 последовательных двукратных разведений от 1000 до 0.47 мкмоль/л.

МПК определяли как концентрацию, при которой видимый рост микроорганизмов по сравнению с контрольными образцами отсутствует.

Для определения МБК аликвоту из каждой лунки без видимого роста бактерий разводили свежей средой LB в 10, 100, 1000 раз, перемещали в новые лунки и инкубировали при 37°С. Через 24 ч визуально оценивали видимый рост бактерий. Минимальную концентрацию образца с отсутствием роста бактерий принимали за МБК.

Исследование ингибирования образования биопленок M. luteus. Для получения биопленок грамположительные бактерии Micrococcus luteus в концентрации 10⁸ КОЕ/мл культивировали в 96-луночном планшете при 37°С в присутствии исследуемых комплексов и препаратов сравнения в концентрациях, соответствующих МПК. Контрольные образцы выращивали в LB, в LB с 10% ДМСО, а также в LB без бактерий для определения фонового окрашивания планшета. Через 24 ч после начала культивирования удаляли среду с планктонными клетками, лунки промывали стерильным буфером PBS (137 мМ NaCl, 2.68 мМ KCl, 4.29 мМ Na₂HPO₄, 1.47 мМ KH₂PO₄, pH 7.4). Окрашивание биопленок проводили с помощью 0.1%-го раствора кристаллического фиолетового при 37°С в течение 20 мин, после чего лунки промывали PBS и высушивали 15 мин. Связавшийся с биопленками краситель растворяли в 95%-ом этиловом спирте, оптическую плотность полученных растворов определяли фотометрически при длине волны 570 нм с использованием многофункционального микропланшетного ридера Spark 10M (Tecan, USA). За 100% принимали оптическую плотность раствора без добавления исследуемых комплексов.

Исследование степени деструкция биопленок M. luteus. Для получения биопленок грамположительные бактерии Micrococcus luteus в концентрации 10⁸ КОЕ/мл культивировали в 96-луночном планшете при 37°С в отсутствие исследуемых образцов. Через 24 ч в лунки вносили образцы и препараты сравнения ампициллин и канамицин в концентрациях, соответствующих МПК. Спустя 24 ч удаляли среду с планктонными клетками, лунки промывали стерильным буфером PBS (137 мМ NaCl, 2.68 мМ KCl, 4.29 мМ Na₂HPO₄, 1.47 мМ KH₂PO₄, pH 7.4). Окрашивание биопленок проводили с помощью 0.1%-го раствора кристалл фиолетового при 37°С в течение 20 мин, после чего лунки промывали PBS и высушивали в течение 15 мин. Связавшийся с биопленками краситель растворяли в 95%-ом этиловом спирте, оптическую плотность полученных растворов определяли фотометрически при λ = 570 нм с использованием многофункционального микропланшетного ридера Spark 10M (Tecan, USA). За 100% принимали оптическую плотность раствора без добавления исследуемых комплексов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нитрозильные комплексы были получены обменной реакцией тиосульфатных лигандов на ароматические дифтортиолилы в водно-щелочной среде по схеме 1 :

Схема 1 . Схема синтеза комплексов общей формулы [Fe₂(R)₂(NO)₄], где R = 2,4-дифтортиофенил (RH1), 3,4-дифтортиофенил (RH2).

Исходные тиолы для синтеза комплексов 1 и 2 – жидкости, которые не смешиваются с водой, поэтому использовали водно-щелочные растворы лигандов и в этом виде вводили в реакцию. Кристаллы 1 и 2 вырастают в течение нескольких суток при низкой температуре из раствора хлористого метилена.

Комплексы 1 и 2, как и большинство известных RREs, нерастворимы в воде и других полярных органических растворителях, растворимы в ДМСО и хлористом метилене.

Комплексы 1 и 2 кристаллизуются в триклинной сингонии (пр. гр. P1 с одной молекулой комплекса в элементарной ячейке) и имеют центросимметричную биядерную структуру μ₂-S-типа (рис. 1), аналогичную структурам ранее исследованных нейтральных эфиров красной соли Руссена с тиофенолилами [14–18, 52, 53, 57]. Ионы железа имеют искаженное тетраэдрическое окружение, образованное двумя мостиковыми атомами серы и двумя нитрозильными группами, при этом в 1 и 2 наблюдаются короткие расстояния Fe…Fe, что является характерной особенностью RREs [14–18, 52, 53, 57]. Межатомные расстояния Fe…Fe отличаются незначительно и составляют 2.6993(6) и 2.6942(7) Å для 1 и 2 соответственно, они находятся в хорошем согласии со средним значением 2.70(2) Å, полученным при рассмотрении структур нейтральных тетранитрозильных комплексов железа μ₂-S-типа с тиольными лигандами [61]. Как и в ранее изученных нейтральных RREs [14–18, 52, 53, 57], в комплексах 1 и 2 наблюдаются незначительные различия в строении NO-групп в одном структурном фрагменте {Fe(NO)₂}⁹, которые в наибольшей степени проявляются у валентных углов FeNO, в то же время длины связей Fe–N и N–O в пределах погрешности измерений очень близки между собой внутри каждого комплекса и между 1 и 2 и находятся в полном согласии со средними значениями 1.67(1) и 1.17(2) Å (табл. 2). Связи С(1)–S(1) близки по величине и составляют 1.787(2) и 1.783(3) Å для 1 и 2 соответственно, что совпадает со средним значением 1.78(1) Å в подобных биядерных нитрозильных комплексах железа [61].

Рис. 1.

Молекулярные структуры соединений 1 (а) и 2 (б) и нумерация атомов в них. Показано разупорядочение одного из атомов F в 2 по двум позициям (F(1A) и F(2B)).

На рис. 2 представлены проекции фрагментов кристаллической структуры комплексов 1 и 2 на плоскости aс (а) и ab (б) соответственно. В структуре 1 обнаружены сокращенные межмолекулярные контакты двух типов: F(2)···H–C 2.50 Å и O(1)NO···H–C 2.63 Å, которые стабилизируют кристаллическую структуру. Несмотря на близость кристаллических упаковок рассматриваемых соединений, изменение позиций F-заместителей в лигандах приводит к небольшому различию в сокращенных межмолекулярных контактах в 1 и 2. Так, при сохранении аналогичных контактов F···H–C (2.52 Å) в кристалле 2 наблюдаются отличные от 1 сокращенные контакты F(1)…F(2A) (2.81 Å) и O(1)NO···F(2A) (2.80 Å), тогда как контакт O(1)NO···H–C уже не наблюдается. Оба рассматриваемых соединения по характеру кристаллической упаковки отличаются от аналога комплекса 2 – полученного нами ранее комплекса с хлорными заместителями в тиофенольных лигандах [57], в котором атомы галогена не участвуют в межмолекулярных взаимодействиях и отсутствует разупорядочение одного из атомов Cl, а само соединение кристаллизуется в моноклинной сингонии (пр. гр. C2/c).

Рис. 2.

Проекции фрагментов кристаллической структуры соединения 1 на плоскость aс (а) и соединения 2 на плоскость ab (б). Сокращенные контакты показаны штриховой голубой линией. Разупорядочение атомов F не показано для ясности.

Различный характер участия нитрозильных групп в межмолекулярных взаимодействиях, по всей видимости, либо является следствием, либо обусловливает незначительную структурную неэквивалентность нитрозильных групп в узле Fe(NO)₂.

Мессбауэровские спектры комплексов 1 и 2 представляют собой одиночные квадрупольные дублеты (рис. 3а и 3б). Параметры спектров (изомерный сдвиг, квадрупольное расщепление, ширина линий) комплексов при температуре 296 K приведены в табл. 3. Там же для сопоставления даны средние длины связей Fe–S соответствующих комплексов по данным РСА настоящей и ранее опубликованных работ [47–53, 57].

Рис. 3.

Мессбауэровские спектры поликристаллов 1 (а) и 2 (б).

Таблица 3.

Мессбауэровские параметры Fe⁵⁷ и средние межатомные расстояния Fe–S для нейтральных RREs состава [Fe₂R₂(NO)₄] c различными тиолилами R при температурах 296, 80* и 85 K**

№	RSH	δFe, мм/с1	ΔEQ, мм/с2	Г, мм/с3	Fe–Scр, Å	Литература
1	Тиофенол	0.075(1)	0.970(1)	0.280(3)	2.260	[47]
2	3-Метокситиофенол	0.078(1)	1.149(1)	0.251(2)	2.257	[48]
3	4-Метокситиофенол	0.073(1)	0.984(1)	0.249(3)	2.258	[48]
4	2-Аминотиофенол	0.096(1)	1.122(1)	0.264(1)	2.272	[49]
5	3-Аминотиофенол	0.108(1)	1.148(1)	0.237(1)	2.273	[52]
6	4-Аминотиофенол	0.062(1)	0.926(3)	0.242(5)	2.267	[50]
7	3-Нитротиофенол	0.115(1)	1.171(1)	0.241(1)	2.274	[53]
8	4-Нитротиофенол	0.175(1)**	1.154(2)**	0.260(1)**	2.265	[51]
9	3-Гидрокситиофенол	0.089(1)	1.050(1)	0.245(1)	2.270	[52]
10	3,4-Дихлортиофенол	0091(1)	1.029(1)	0.285(1)	2.257	[57]
11	2,4-Дифтортиофенол	0.087(1) 0.191(2)*	1.016(6) 0.981(5)*	0.390(1) 0.390(1)*	2.269	Настоящая работа
12	3,4-Дифтортиофенол	0.113(3) 0.175(1)*	1.025(3) 1.025(3)*	0.254(1) 0.338(6)*	2.262	Настоящая работа

¹ Изомерный сдвиг (отн. α-Fe), ² квадрупольное расщепление, ³ ширина линий дублета.  * Значения мессбауэровских параметров образцов комплексов N11 и N12, снятых при 80 К. ** Значения мессбауэровских параметров образцов комплекса N8, снятых при 85 К.

В нейтральных тиофенильных комплексах RREs, исследованных нами ранее и содержащих два структурных фрагмента {Fe(NO)₂}⁹, возрастание изомерного сдвига коррелирует с увеличением среднего расстояния Fe–S (табл. 3).

Тенденция к увеличению значений изомерного сдвига для комплексов 1 и 2 по сравнению с таковыми для комплексов с NH₂-, OH-, OCH₃-, NO₂- и Cl-содержащими тиофенолилами позволяет предположить, что более электроотрицательный фтор оттягивает часть электронной плотности от железа, координированного S-лигандом. Уменьшение зарядовой плотности на ядрах железа (d⁷) приводит к увеличению изомерного сдвига в 1 и 2 в соответствии с возрастанием расстояния Fe–S (см. выше). Имеются также отличия в значениях изомерных сдвигов для 1 и 2, различающихся положением второго атома фтора. По данным ЭПР-спектроскопии, в порошках комплексы 1 и 2 диамагнитны, а спектры ЭПР их растворов в ДМСО имеют характеристические особенности моноядерных динитрозильных комплексов железа с g = 2.03 (рис. 4). Растворы характеризуются пятью линиями сверхтонкой структуры, обусловленной взаимодействием неспаренного электрона с двумя эквивалентными ядрами азота. Это согласуется с распадом биядерных комплексов на моноядерные. Число парамагнитных центров на соответствующий комплекс для раствора представлено в табл. 4. Малая величина N объясняется тем, что распад биядерных комплексов сопровождается распадом моноядерных комплексов. Амплитуда и форма спектров ЭПР для растворов 1 и 2 слабо изменяются в течение 1.5 ч.

Рис. 4.

Спектры ЭПР свежеприготовленных растворов комплексов 1 и 2 в ДМСО.

Установлено, что комплексы 1 и 2 генерируют NO (рис. 5). Известно, что нитрит-ионы являются основным продуктом реакции NO с кислородом в водном аэробном растворе [62, 63]. NO окисляется на первой стадии этого процесса. Это реакция третьего порядка с константой скорости k_aq = 2 × 10⁶ М^–2 с^–1 при 25°C (скорость реакции зависит от [NO]², [O₂]) [64]:

Рис. 5.

Кинетика накопления нитрит-ионов при разложении комплексов 1 и 2 в аэробных растворах. Условия: исходные концентрации комплексов 0.6 × × 10^–5 моль/л, растворитель – буфер трис-HCl, рН 7.0, 23°С.

На следующей стадии быстро образуется N₂O₃ (k = 1.1 × 10⁹ М^–1 с^–1) [63], который далее реагирует с водой с образованием NO₂⁻ [62, 63]:

Таким образом, донорную активность NO-комплексов в водном растворе на воздухе удобно оценивать по кинетике накопления нитрита. Концентрация ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ измеряется с помощью реакции Грисса [65]. На рис. 5 показаны результаты экспериментов в буферном растворе. Максимальные количества нитрит-ионов для комплексов 1 и 2 составляют 4.0 и 2.5 мкМ соответственно при исходной концентрации комплексов 0.6 × 10^–5 моль/л, что свидетельствует об их разной NO-донорной способности, которая оказалась ниже, чем для RREs 3 c 3,4-дихлортиофенолилами (2.3 мкМ при исходной концентрации комплекса 0.2 × × 10^–5 моль/л, растворитель – буфер трис-HCl, рН 7.0, 23°С) [57]. Мы полагаем, что реакции комплексов 1 и 2 с кислородом необратимы. Как и в случае с комплексом 3, содержащим в качестве лигандов 3,4-дихлортиофенолилы, кислород, встраивается в структуру комплексов. При этом наблюдается долговременная (с выходом на плато через 8–10 мин) кинетика выделения NO, обусловленная, скорее всего, образованием более устойчивых, чем в случае 3 (RRE c 3,4-дихлортиофенолилами), нитрозильных интермедиатов, строение которых требует дополнительных спектральных исследований и квантово-химических расчетов.

Цитотоксические свойства исследуемых комплексов и соответствующих тиолов изучены на клеточной культуре Vero, рекомендованной в качестве тест-объекта для проведения токсикологических исследований. Обнаружено, что комплексы не проявляют существенных цитотоксических свойств в исследуемом диапазоне концентраций как при 24, так и при 72 ч инкубации (рис. 6, табл. 5), и действие комплексов сопровождается сохранением жизнеспособности клеток от 80% и выше (рис. 6). Исследование цитотоксического действия соответствующих тиолов показало, что они, в отличие от содержащих их нитрозильных комплексов железа (НКЖ), обладают высокой токсичностью для клеток Vero, при этом наблюдается сходная картина выживаемости клеток при 24 и 72 ч инкубации.

Рис. 6.

Кривые доза-эффект при действии комплексов 1 (а), 2 (б) и 3 (в) и их лигандов в течение 24 (а) и 72 (б) ч на клетки Vero.

Отсутствие изменения токсичности при увеличении времени инкубации наблюдалось нами ранее для других НКЖ [66]. Таким образом, подобная противоречивая картина цитотоксического действия характерна для некоторых представителей этого класса.

Интересно, что состав и положение заместителей слабо влияют на цитотоксичность соответствующих тиолов: значения IC50 для тиолов R₁–R₃ различаются на ∼25%. В то же время заместители оказывают существенное влияние на цитотоксичность НКЖ, и токсичность комплекса 3 с хлорсодержащим лигандом значительно превышает токсичность НКЖ 2 и 3 с фторсодержащими лигандами.

Важнейшим наблюдением является отсутствие токсичности НКЖ при высокой токсичности соответствующих тиолов. Механизм распада НКЖ на сегодняшний день изучен плохо и трудно поддается исследованию в связи с быстрой кинетикой процесса. Предполагается, что при распаде НКЖ в водных аэробных растворах помимо оксида азота могут выделяться входящие в их состав лиганды. Полученные нами данные по цитотоксичности НКЖ и соответствующих тиолов показывают, что при распаде НКЖ свободные лиганды практически не образуются, иначе комплексы проявляли бы более высокую токсичность.

При отсутствии цитотоксических свойств в отношении клеток Vero комплексы проявляют антибактериальную активность. В табл. 6 представлены значения МПК и МБК для исследуемых комплексов и соответствующих тиолов. Показано, что комплексы 1–3 и соответствующие тиолы проявляют антибактериальные свойства только в отношении грамположительных M. luteus. Комплекс 2 эффективнее ингибирует рост бактерий, чем комплекс 1, несмотря на их близкие NO-донирующие свойства. Очевидно, что именно присутствие атомов F в положениях 3 и 4 в тиофенолиле определяет антибактериальную активность комплекса 2. Следует отметить, что МПК комплекса 2 в 4 раза превосходит МПК препарата сравнения – канамицина.

Комплекс 3 проявляет низкую антибактериальную активность, сопоставимую с активностью комплекса 1. Это указывает на то, что антибактериальные свойства комплексов определяются не только положением атомов в структуре лиганда, но и их природой. Введение атомов хлора в положения 3 и 4 тиофенолила повышает цитотоксические свойства (табл. 5), но снижает антибактериальную активность комплекса.

В отношении грамотрицательных бактерий E. coli исследуемые комплексы и соответствующие тиолы не проявляют активности. Значения МПК в исследуемом диапазоне концентраций установить не удалось, в связи с этим МБК в отношении E. coli не определяли. Возможно, такой эффект связан с тем, что грамотрицательные бактерии часто проявляют повышенную устойчивость к различным соединениям за счет многослойной клеточной стенки. В ее состав входит большое количество макромолекул, в особенности липополисахаридов, обеспечивающих низкую проницаемость мембраны бактерий, что приводит к ограничению действия антибиотиков и развитию резистентности [67, 68].

Анализ бактерицидных свойств комплексов показал, что антибактериальный эффект комплекса 2 связан в первую очередь с бактериостатическим действием, поскольку МБК превышает МПК в 16 раз. Эффекты комплексов 1 и 3 отличаются близкими или равными значениями МБК и МПК, т.е. эти НКЖ проявляют значительную бактерицидную активность. Тем не менее комплекс 2 является наиболее активным, поскольку демонстрирует самые низкие значения и МПК, и МБК.

Тиолы, взятые для синтеза НКЖ 1–3, проявляют относительно низкую антибактериальную активность (табл. 5). Таким образом, антибактериальные свойства НКЖ 2 определяются общей структурой комплекса, и хотя НКЖ 2 образует меньше NO по сравнению с НКЖ 1 (рис. 5) и 3 [57], антибактериальные свойства НКЖ не коррелируют с их NO-донирующей активностью. Принимая во внимание, что распад комплекса не приводит к образованию лигандов, можно сделать вывод, что биологическое действие НКЖ определяется интермедиатами, отличными от NO и лигандов.

Известно, что большинство бактериальных инфекций вызвано микроорганизмами, организованными в сообщества – биопленки, представляющие серьезную проблему, для решения которой необходимо применение новых терапевтических стратегий, способных привести к разработке более эффективных ингибиторов биопленок, чем обычные методы лечения [69]. Именно с образованием биопленок связан механизм хронического развития инфекций, а также резистентности. Бактерии в биопленках более устойчивы к антибиотикам, чем планктонные клетки. В основе механизма такой устойчивости лежат структурные особенности организации биопленок. Для них характерно наличие внеклеточного экзополимерного матрикса, состоящего из полисахаридов, белков, липидов и нуклеиновых кислот, который защищает микроорганизмы от факторов внешнего воздействия [70]. Существует два основных способа воздействия на биопленки: предотвращение образования биопленок на ранней стадии формирования и прикрепления планктонных клеток, а также разрушение уже сформированной биопленки.

Исследовано влияние комплексов и их лигандов в концентрации МПК на формирование, а также на эффективность деструкции сформированных биопленок M. luteus. Результаты исследования представлены на рис. 7 и 8. Обнаружено, что комплекс 2 ингибирует образование биопленок бактерий на 46%, что на 13 и 33% эффективнее действия препаратов сравнения – канамицина и ампициллина соответственно. Комплекс 1 ингибирует формирование биопленок на 28%, что схоже с действием ампициллина (31%). Следует отметить, что соответствующие тиолы также оказывают влияние на формирование биопленок, однако оно выражено в меньшей степени. Комплекс 3 не оказывает влияния на образование биопленок. Исследование свойств его исходного RН₃ не проводили в связи с неустановленной МПК.

Рис. 7.

Эффективность образования биопленки M. luteus при действии комплексов и лигандов в дозе МПК через 24 ч.

Рис. 8.

Эффективность деструкции биопленок M. luteus при действии комплексов и лигандов в дозе МПК через 24 ч.

Комплексы 1 и 2 вызывают также деструкцию биопленки бактерий M. luteus на 21 и 32% соответственно. Эффективность деструкции в обоих случаях превосходит эффективность действия препаратов сравнения. Комплекс 3 менее эффективен по сравнению с НКЖ 1 и 2, однако его активность по деструкции биопленок превышает действие канамицина. Исходные тиолы, которые были использованы для синтеза НКЖ 1, 2 оказывают слабый эффект на сформированные биопленки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые синтезированы нейтральные RRSs с дифтортиофенильными лигандами, исследовано их строение и биологическая активность. Показано, что природа и положение акцепторных заместителей в тиофенолиле существенным образом влияют на электронное и кристалличеcкое строение нейтральных RRSs на основе тиофенола и его производных: в твердой фазе участие атомов F в тиофенольных лигандах обусловливает формирование более устойчивых биядерных структур, чем в случае других акцепторных заместителей (Cl, NO₂). Это снижает их NO-донорную активность в растворах.

Исследование цитотоксической активности показало низкую токсичность комплексов для клеток Vero при высокой токсичности лигандов. Это демонстрирует низкий вклад лигандов в токсичность исследованных НКЖ. Анализ результатов антибактериальной активности показывает зависимость значений МПК и МБК от положения атомов фтора в тиофенильном лиганде: комплекс 2, в отличие от комплекса 1, эффективно подавляет рост бактерий M. luteus. Оба комплекса ингибируют образование бактериальной биопленки M. luteus, и НКЖ 2 разрушает сформированные биопленки M. luteus эффективнее, чем используемые в клинике антибиотики канамицин и ампициллин.

Суммируя результаты цитотоксических и антибактериальных свойств, видно, что комплекс 2 при концентрациях, оказывающих антибактериальное действие, проявляет очень низкую токсичность для клеток млекопитающих. Результаты исследований in vitro показывают, что что комплекс 2 является наиболее перспективным из исследованных НКЖ и может рассматриваться в качестве прототипа антибактериального средства, действующего на принципах, отличных от механизмов действия существующих антибиотиков.