Журнал общей биологии, 2019, T. 80, № 5, стр. 364-371

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы сборы моллюсков отряда Unionoida, выполненные в период с 2013 по 2016 год в водоемах различных бассейнов рек России (табл. 1, рис. 1). В качестве объекта исследования выступали двухстворчатые моллюски Anodonta anatina (L., 1758), A. cygnea (L., 1758), Pseudanodonta cf. complanata (Rossmässler, 1835) из трибы Anodontini (Lopes-Lima et al., 2017). Для сравнения были использованы виды A. beringiana (Middendorf, 1851), Sinanodonta aff. woodiana (Lea, 1834), S. ovata (Bogatov et Starobogatov, 1996) из того же подсем. Anodontinae, но из другой трибы Cristariini (Lopes-Lima et al., 2017). Кроме того, для сравнения использованы представители соседнего подсем. Unionidae: Unio tumidus (Retzius, 1788) и U. pictorum (L., 1758). Ткани исследуемых образцов зафиксированы в 96%-ном этиловом спирте и хранятся в коллекции “Российского музея центров биоразнообразия” на базе ФИЦКИА РАН. Выборка представителей A. anatina более многочисленная, включает 26 особей; также исследованы шесть особей A. cygnea. Вид P. cf. complanata – редкий и охраняемый, поэтому в данном исследовании представлен только двумя особями. В качестве дополнения данных по длине транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 включены данные из базы NCBI GenBank¹¹.

Рис. 1.

Карта с точками сбора двустворчатых моллюсков.

Выделение тотальной клеточной ДНК из тканей пресноводных моллюсков осуществлено с применением фенол-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989). Амплификация последовательностей проведена при помощи праймеров ITS1F и ITS1R (White et al., 1996) для ITS1, LT1F (Bargues et al., 2001) и ITS4R (White et al., 1996) для ITS2, LCO1490 и HCO2198 (Folmer et al., 1994) для COI. ПЦР-смесь содержала около 200 нг ДНК, 10 пмоль каждого из праймеров, 2.5 мкл Taq-буфера (с 10 × × 2 ммоль MgCl₂), 200 мкмоль каждого из dNTP, 0.8 единиц Taq ДНК-полимеразы (НПО “СибЭнзим”, Россия). Реакционная смесь была доведена деионизированной водой до объема 25 мкл. Амплификация участков включала в себя этап первоначальной денатурации ДНК – 95°С, 5 мин; затем 31–37 циклов синтеза фрагмента ДНК: 95°С – 45 с, 57°С (для ITS1) и 50°С (для ITS2 и COI) – 40 с, 72°С – 50 с; а также этап окончательной элонгации цепи – 72°С, 5 мин.

Определение генетических последовательностей фрагмента гена COI у всех исследуемых образцов двустворчатых моллюсков осуществлено при помощи автоматического секвенатора (ABI PRISM® 3730, Applied Biosystems) с использованием набора реагентов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1. (ЦКП “Геном”, ИМБ РАН). Полученные последовательности гена COI были проанализированы в программе BLAST NCBI для определения видовой принадлежности образцов моллюсков.

Рибосомальный кластер эукариот имеет в своем составе два внутренних транскрибируемых спейсера – ITS1 и ITS2, которые разделяют в рибосомной ДНК гены 18S, 5.8S и 28S РНК (White et al., 1996; Källersjö et al., 2005). Данные последовательности представляют собой объединение ядерных генов, которые располагаются в виде тандемных повторов (рис. 2).

Рис. 2.

Локализация праймеров на рибосомальном кластере и размер рибосомальных генов, амплифицированных совместно с ITS1 и ITS2.

Поскольку подобранные праймеры отжигаются на последовательностях рибосомальных генов (ITS1F на 18S рРНК, ITS1R на 5.8S рРНК, а LT1F на 5.8S рРНК, ITS4R на 28S рРНК), то амплифицированные последовательности ITS1 и ITS2 содержат участки рибосомальных генов.

Определение длин нуклеотидных последовательностей ITS1 и ITS2 осуществлено с помощью системы автоматического капиллярного электрофореза Experion™ (Bio-Rad, США) с использованием чипа 1K Analysis Kit согласно прилагаемым инструкциям. В него вносили по 11 образцов совместно с маркерной линейкой, имеющей диапазон 15–1500 п.н.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для того чтобы найти истинный размер амплифицированных участков ITS1 и ITS2 для каждого отдельного вида, был определен размер рибосомальных генов 18S, 5.8S и 28S рДНК путем сравнения с нуклеотидными последовательностями JX081669, GU471863, KJ740491 из базы GenBank. Из полученных последовательностей ITS1 и ITS2 вычли длину рибосомальных генов, которые были амплифицированы совместно с внутренними транскрибируемыми спейсерами. Длина данных участков составила: для ITS1 – 40 п.н. при отжиге праймера ITS1F на 18S рРНК и 52 п.н. при отжиге праймера ITS1R на 5.8S рРНК; для ITS2 – 18 п.н. при отжиге праймера LT1F на 5.8S рРНК и 57 п.н. при отжиге праймера ITS4R на 28S рРНК (рис. 2).

Из анализа амплифицированных спейсеров ITS1 и ITS2 следует, что эти последовательности варьируют по длине (табл. 2). Можно заметить, что диапазоны длин последовательностей ITS2 P. cf. complanata (от 310 до 321 п.н.), A. cygnea (от 315 до 329 п.н.), A. anatina (от 321 до 343 п.н.) имеют перекрывающие области, однако длина ITS1 значительно отличается: P. cf. complanata (от 462 до 464 п.н.), A. cygnea (от 448 до 449 п.н., от 470 до 472 п.н.), A. anatina (от 495 до 527 п.н.) – что позволяет отличить данные виды. По длине ITS1 для пресноводных моллюсков видов U. tumidus (315 п.н.) и U. pictorum (333 п.н.) можно предположить, что особи первого вида относятся либо к P. cf. complanata (от 310 до 321 п.н.), либо к A. cygnea (от 310 до 329 п.н.), а второго вида – к A. anatina (от 321 до 343 п.н.), однако данное предположение опровергает интервал последовательностей ITS2. А длина транскрибируемого спейсера ITS2 представителей вида S. ovata (273 п.н.) входит в диапазон аналогичного участка для S. aff. woodiana (от 273 до 282 п.н.), но отличается по участку ITS1: S. ovata (496 п.н.), S. aff. woodiana (502 п.н.).

Если принимать во внимание перекрывание длин последовательностей ITS1, то можно предположить, что особи вида S. ovata (496 п.н.) и S. aff. woodiana (502 п.н.) могут относиться к виду A. anatina (от 495 до 527 п.н.), однако это утверждение не верно, поскольку длины последовательностей ITS2 варьируют у пресноводных моллюсков вида A. anatina в других пределах (от 321 до 343 п.н.), что не характерно для особей вида S. ovata (273 п.н.) и S. aff. woodiana (от 273 до 282 п.н.).

Наши данные по длинам последовательностей спейсеров ITS1 и ITS2 позволяют расширить интервалы значений, установленные в предыдущем исследовании этих видов (Källersjö et al., 2005). В ходе исследования нами было выявлено и учтено, что полученные ранее последовательности спейсеров (Källersjö et al., 2005) были выравнены некорректно и, следовательно, имеют другую длину. Согласно современным данным, путем сравнения с последовательностями JX081669, GU471863, KJ740491 из базы GenBank нами были рассчитаны интервалы транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 для идентификации двустворчатых моллюсков (табл. 3). Полученные данные были объединены с результатами предыдущих исследований (Källersjö et al., 2005) и представлены в сводной табл. 4 и на рис. 3. При анализе последовательностей спейсера ITS2 для моллюсков родов Anodonta и Sinanodonta видно, что длины амплифицированных последовательностей существенно отличаются, что позволяет их идентифицировать (рис. 3). Моллюски вида P. cf. complanata достоверно отличаются от особей других видов длиной спейсера ITS1, а интервалы, полученные для моллюсков P. complanata, пересекаются с таковыми у A. anatina (по ITS1 и ITS2), что свидетельствует о том, что использование спейсеров не во всех случаях позволяет корректно определить видовую принадлежность этих моллюсков. В таких ситуациях для точной идентификации вида необходимо осуществлять ДНК-баркодинг или рестрикционный анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции Hinfl (Zieritz et al., 2012).

Рис. 3.

Схема длин транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 для представителей родов Anodonta, Pseudanodonta и Sinanodonta.

Полученные данные по транскрибируемым спейсерам ITS1 и ITS2 показывают, что у пресноводных моллюсков родов Anodonta и Pseudanodonta в разных частях ареала наблюдается не только морфологическая изменчивость, но и генетический полиморфизм.

Для подтверждения достоверности предлагаемого метода идентификации у всех исследуемых образцов двустворчатых моллюсков предварительно были определены генетические последовательности фрагмента гена COI. Различия полученных последовательностей, в сравнении с представленными в базе GenBank, не превысили 0.5% для всех исследуемых образцов моллюсков, кроме особей P. cf. complanata. Исследуемые образцы моллюсков P. cf. complanata, собранные в р. Хопер (бассейн р. Дон), отличаются от последовательностей гена COI P. complanata, задепонированных в базе данных GenBank, на 2%. Это свидетельствует о том, что данный вид является сестринским видом по отношению к P. complanata. Данные по депонированию последовательностей гена COI в базе GenBank представлены в табл. 1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показало, что совместное определение длин транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 может служить качественным маркером для определения видового статуса представителей родов Anodonta и Pseudanodonta, за исключением случаев идентификации видов P. complanata и A. anatina, которые легко могут быть идентифицированы морфологически или с применением рестрикционного анализа. Следовательно, молекулярно-генетические методы способны эффективно дополнить классические подходы в определении двустворчатых моллюсков.

Авторы благодарны И.Н. Болотову, И.В. Вихреву, М.В. Винарскому, М.Ю. Гофарову, А.А. Махрову, С.Е. Соколовой, О.В. Аксёновой, В.С. Артамоновой и другим коллегам, которые в разные годы участвовали в проведении полевых работ и сборе моллюсков.

Полевые работы по сбору материала и молекулярно-генетические исследования выполнены при поддержке государственного задания № 0409-2019-0041 и гранта РФФИ № 17-45-290066_р_а. Камеральная обработка собранных материалов и подготовка рукописи статьи выполнены при поддержке гранта РНФ № 18-77-00058.