Журнал общей биологии, 2022, T. 83, № 1, стр. 3-28

Открытие молекулярных часов

Гипотеза молекулярных часов заключается в том, что скорость накопления замен в нуклеотидной или аминокислотной последовательности постоянна, из чего следует линейный характер зависимости между числом мутационных шагов (которые являются функцией числа различий в последовательностях) и временем дивергенции видов. Термин “молекулярные часы” (molecular evolutionary clock) был предложен Цукеркандлем и Полингом в 1965 г. (Zuckerkandl, Pauling, 1965). Сравнивая последовательности белков (гемоглобинов) у разных видов, они получили линейную зависимость числа аминокислотных замен от возраста видов, оцененного по ископаемым остаткам, и заявили о возможности использования этого свойства для оценки времени дивергенции между видами (Zuckerkandl, Pauling, 1962).

Изучая эволюцию гемоглобинов у приматов, Цукеркандль и Полинг оценили возраст дивергенции между гориллой и человеком в 11 млн лет (Zuckerkandl, Pauling, 1962), отметив, что это время соответствует минимальной (самой поздней) палеонтологической датировке (11–35 млн лет назад). Эти данные, так же как и другие молекулярные оценки времен дивергенции гоминоидов 60-х годов (Sarich, Wilson, 1967), оказались несовместимы с представлениями палеонтологов о большом эволюционном разрыве (масштабе фенотипической дивергенции) между человеком и человекообразными обезьянами (Wilson et al., 1977). В настоящее время относительно недавняя дивергенция человека и шимпанзе считается доказанной (Easteal, Herbert, 1997; Kumar et al., 2005). Вслед за работами Цукеркандля и Полинга по гемоглобинам появились сообщения о постоянстве скорости эволюции аминокислотой последовательности цитохрома С (Margoliash, 1963) и фибринопептидов (Doolittle, Blombäck, 1964), которые показали, что разные белки и гены отличаются по скорости эволюции и поддержали гипотезу молекулярных часов.

Цукеркандль и Полинг предвидели проблемы, которые могли затруднить применение молекулярных часов (Zuckerkandl, Pauling, 1962). Они указывали на повторяющиеся замены в одном и том же аминокислотном сайте (включая обратные мутации), воздействие естественного отбора и влияние размера популяции. Исходно их концепция включала важную роль естественного отбора, но позже они предположили, что “изменения, которые происходят с довольно регулярной общей скоростью, должны быть такими, которые относительно мало изменяют функциональные свойства молекулы” (Zuckerkandl, Pauling, 1965, р. 148). Эта цитата предвосхищает тесную связь гипотезы молекулярных часов Цукеркандля и Полинга с нейтральной теорией молекулярной эволюции Кимуры (Kimura, 1968, 1969), неотъемлемой частью которой они стали.

Теория нейтральности молекулярной эволюции (neutral theory of molecular evolution)

Мотоо Кимура и Томоко Ота объяснили постоянную скорость замен аминокислот в белках их нейтральностью в том смысле, что эти замены не влияют на приспособленность организма и, следовательно, не находятся под давлением отбора (Kimura, 1968; Kimura, Ohta, 1971). Предложенная модель отличалась от более ранних тем, что в прежних моделях (Fisher, 1936; Mayr, 1963) большинство замен предполагались благоприятными (попадают под положительный отбор), либо вредными (удаляются отбором). Важное следствие теории нейтральности состоит в том, что скорость, с которой нейтральные мутации фиксируются в популяции (substitution rate), примерно равна скорости, с которой мутации спонтанно возникают (Kimura, 1968). Решающий аргумент в пользу теории нейтральности – скорость несинонимичных (аминокислотных) замен в кодирующих последовательностях ниже, чем скорость синонимичных (“молчащих”) замен, и скорость замещений в интронах и псевдогенах.

Развитием теории нейтральности молекулярной эволюции стала теория почти (эффективно) нейтральных мутаций (the nearly neutral theory of molecular evolution), разработанная Ота (Ohta, 1972a, 1973). Теория почти нейтральных мутаций предполагает, что часть нейтральных мутаций имеет небольшое влияние на приспособленность, являясь умеренно вредными или (реже) умеренно полезными. В малочисленной популяции, где отбор слаб по сравнению с дрейфом, такие мутации ведут себя практически как нейтральные (эффективно нейтральные). Таким образом, при низкой эффективной численности доля нейтральных мутаций относительно вредных оказывается выше и скорость эволюции увеличивается. Тем не менее это не противоречит постоянству скорости эволюции в единицу времени благодаря отрицательной корреляции между размером популяции и продолжительностью жизни поколения (Ohta, 1972b, 1974).

Концепция молекулярных часов вызвала резкую критику со стороны крупных биологов-эволюционистов своего времени (например, Stebbins, Lewontin, 1972; Easteal et al., 1995). Дальнейшее накопление эмпирических данных показало, что поведение молекулярных часов не соответствует в полной мере модели постоянной скорости – часы оказываются “небрежными” (“sloppy” clock), так как дисперсия числа генетических различий в конкретном временном периоде оказывается выше ожидаемой исходя из простого пуассоновского процесса (Gillespie, 1991). Теоретически на скорость молекулярной эволюции должны влиять скорость мутирования, соотношение сайтов различной селективной значимости и (в случае почти нейтральных мутаций) размер популяции (Ohta, 2002). Эти факторы различаются между видами, генами и временными периодами. Непостоянство часов есть следствие изменчивости скорости замен внутри одной линии и неравенства скоростей замен в разных линиях. Оба фактора порождают ошибки в молекулярных датировках (Bromham, Penny, 2003).

Таким образом, уже вскоре после появления концепции молекулярных часов стало ясно, что универсальных часов не существует. Все дальнейшее развитие методологии опиралось на допущение, что степень непостоянства скорости молекулярной эволюции можно измерить и учесть (Bromham, Penny, 2003). За последние два десятилетия было предпринято множество усилий по разработке методов работы с варьирующими скоростями, что привело к значительному прогрессу в методах молекулярного датирования.

Варьирование скорости молекулярной эволюции в зависимости от разных факторов

Скорость появления мутаций зависит от нескольких факторов и по современным представлениям определяется балансом между ожидаемым (в основном негативным) влиянием спонтанных мутаций на приспособленность с одной стороны и затратами на исправление ошибок репликации с другой (Lynch, 2010а). В рамках этой концепции скорость молекулярной эволюции не может быть меньше порога, определяемого эффективностью отбора в условиях той или иной величины дрейфа (drift-barrier hypothesis; Lynch, 2010b). Снижение скорости спонтанных мутаций организма может быть ограничено биохимическими и физиологическими затратами, связанными с улучшением точности репликации (Drake et al., 1998). Чтобы ограничить приток вредных мутаций, очищающий отбор может снижать частоту спонтанных мутаций за счет повышения точности репликации. Однако очищающий отбор подавляется генетическим дрейфом, если повышение приспособленности от дальнейшего снижения скорости спонтанных мутаций в диплоидном организме становится меньше, чем 1/2 Ne (где Ne – эффективная численность). Это объясняет тот факт, что виды с высокой Ne популяций (т.е. более эффективным отбором) обычно демонстрируют более низкую частоту спонтанных мутаций на поколение, чем виды с низкой Ne.

Скорость эволюции нуклеотидных и аминокислотных последовательностей меняется в зависимости от локуса, временного диапазона и конкретной филогенетической линии. Хорошо известно и многократно показано, что у многоклеточных животных частота мутаций в митохондриальном геноме много выше, чем в ядерном (Brown et al., 1979; Wilson et al., 1985), например, у человека и мыши примерно в 40 раз (Fu et al., 2013; Hardouin, Tautz, 2013). Особенно велики эти различия для синонимичных замен (Pesole et al., 1992). У насекомых и паукообразных это различие между скоростью митохондриальной и ядерной эволюции значительно ниже, чем у позвоночных (Allio et al., 2017). Варьирование скорости в зависимости от локуса может быть связано с тем, в какой степени локусы находятся под давлением отбора, а также их различиями в скорости мутирования (Hodgkinson, Eyre-Walker, 2011). При анализе нуклеотидных последовательностей, как правило, принимается во внимание варьирование скоростей в трех позициях кодонов белок-кодирующих генов (Shapiro et al., 2006). Скорость мутаций может варьировать также в зависимости от конкретных нуклеотидов и их окружения, например, мутации в цитозин-гуаниновых динуклеотидах (CpG) происходят чаще, чем в других динуклеотидах, частично из-за склонности цитозина к дезаминированию (Bird, 1980). Cкорость CpG → TpG замен варьирует в широких пределах у разных видов, есть данные, что у человека эта скорость может быть в ~13−18 раз выше по сравнению с другим динуклеотидами (Nachman, Crowell, 2000; Kong et al., 2012). Известно, что частота мутаций повышена в тех частях генома, где присутствуют горячие точки рекомбинации (Duret, Arndt, 2008), что отчасти связано с увеличением доли цитозина и гуанина и количества CpG сайтов вследствие ассимметричной генной конверсии в процессе рекомбинации.

Скорость молекулярной эволюции и эффект времени генерации (longevity effect)

В литературе упоминается два варианта скорости эволюции: (1) число замен на сайт в единицу времени и (2) число замен на сайт на поколение (Bromham, 2020; Pfeifer, 2020). Как обсуждалось выше, согласно теории нейтральности, эволюция в нейтральных сайтах происходит со скоростью мутаций и, в соответствии с гипотезой молекулярных часов, скорость мутаций должна быть одинакова в разных филетических линиях. Однако на самом деле скорость эволюции сильно различается между линиями. Уже в первых иммунологических работах по гемоглобинам приматов было показано, что линии с большей продолжительностью жизни поколения имеют меньшую скорость эволюции (Goodman, 1961, 1962). Реальность этой модели, известной как “эффект времени генерации”, теперь подтверждена многочисленными исследованиями на разных животных (Allio et al., 2017), в том числе на птицах (Mooers, Harvey, 1994), беспозвоночных (Thomas et al., 2010), а также бактериях (Weller, Wu, 2015).

В настоящее время принято считать, что влияние продолжительности жизни поколения на скорость эволюции – наиболее очевидная причина различия скоростей молекулярной эволюции в разных линиях (Ho, 2020). Однако исходные утверждения Кимуры (Kimura, 1969) противоречивы: с одной стороны, скорость эволюции белков у разных видов примерно одинакова, а с другой стороны, примерно одинаковы скорости мутирования белков в пересчете на поколение (а не на единицу времени), но продолжительность жизни поколения сильно отличается у разных животных. Сам Кимура сначала считал, что синонимичные замены происходят с постоянной скоростью в пересчете на год, что могло бы служить подтверждением теории нейтральности (Kimura, 1969). Но позже он признал, что нейтральная теория должна предсказывать постоянную скорость замещения не на год, а на поколение, так как скорость зависит от числа циклов репликации, и доказательство постоянства эволюционных изменений в единицу времени представляет собой “трудную проблему” в его теории (Kimura, 1983).

Для объяснения этого факта привлекалась теория почти (эффективно) нейтральных мутаций (Ohta, 1972a). Суть объяснения состояла в том, что виды с долгоживущими поколениями, как правило, имеют более низкую эффективную численность популяции (Ne) и, следовательно, для них выше доля условно нейтральных мутаций. Однако полностью адекватным это объяснение не является, реальная причина сложней и зависит от нескольких факторов.

Во-первых, молекулярная эволюция неравномерна и у животных с большим временем генерации скорость нуклеотидных замен меньше (например, Nabholz et al., 2008, 2013; Welch et al., 2008; Galtier et al., 2009), однако зависимость между скоростью эволюции и величиной, обратной времени генерации отнюдь не линейна. Время генерации отличается у человека и мыши примерно в 40–50 раз, а скорость эволюции менее чем в 10 раз (Bromham, 2011).

Во время работы Кимуры над книгой (Kimura, 1983) предполагалось, что мутации возникают прежде всего в момент репликации ДНК половых клеток или их предшественников (Haldane, 1947; Müller, 1954) и что число циклов деления в линии предшественников половых клеток примерно одинаково у организмов с различной длиной поколения. Однако теперь ясно, что это допущение не верно; так, у человека в клетках-предшественниках сперматозоидов происходит в среднем 400 делений на поколение, а у самцов мыши − всего 62 деления (Bromham, 2011). Следовательно, строго обратной зависимости между временем генерации и скоростью эволюции, как ожидалось ранее, на самом деле быть не должно.

С другой стороны, если бы скорость репликации на единицу времени была постоянной, между временем генерации и скоростью эволюции вообще не было бы связи. На самом же деле число клеточных делений в единицу времени больше у короткоживущих видов, например, у мыши (самцы) более 100 делений в год, а у человека всего около 20 делений (Bromham, 2011). Отметим, что принимать во внимание число циклов деления и скорость мутаций нужно именно в сперматозоидах, а не в яйцеклетках. Кроме того, скорость спонтанных мутаций на одно деление у короткоживущих видов выше, чем у долгоживущих, например, у мыши этот показатель примерно в 3 раза выше, чем у человека (Milholland et al., 2017). Именно эти два фактора и определяют большую скорость мутирования у короткоживущих видов.

Есть и другой, осложняющий эту картину фактор: не все мутации вызываются ошибками репликации. Например, у многих организмов цитозин может химически модифицироваться путем метилирования (Suzuki, Bird, 2008). Основные мишени метилирования ДНК в геномах − это цитозины, за которыми следует гуанин (“CpG” мишени); по химическим причинам метилированные CpG сайты очень склонны к превращению в TpG сайты (Bird, 1980). Поскольку метилирование ДНК само по себе не зависит от репликации (например, Vandiver et al., 2015), на мутации, вызванные метилированием, продолжительность жизни поколения влиять не должна. Показано, что у разных видов приматов мутации в сайтах CpG происходят с одинаковой скоростью, в то время как скорости мутаций в других сайтах варьируют в зависимости от времени генерации (Kim et al., 2006; Moorjani et al., 2016). Итак, скорости эволюции в расчете на поколение и на единицу времени связаны между собой сложно и не линейно.

Причины вариабельности скоростей молекулярной эволюции

Одним из наиболее ярких примеров зависимости скорости мутирования ДНК от частоты репликации является феномен, который часто называют “male-driven evolution” или “male-biased mutation”. Мужские гаметы обычно производятся в большем количестве, чем женские, и мужские гаметы обычно являются продуктом большего количества поколений клеток, чем женские гаметы того же вида. Таким образом, во многих таксонах последовательности ДНК, которые проводят больше времени у самцов, будут проходить больше репликаций в единицу времени, чем те, которые проводят больше времени у самок, и поэтому будут накапливать больше ошибок копирования. Это было отмечено у млекопитающих (более высокая частота мутаций в хромосоме Y, чем в X) и у птиц (более высокая частота мутаций в хромосоме Z, чем в хромосоме W) (Wilson Sayres, Makova, 2011). Таким образом, средняя частота мутаций для вида будет сильно зависеть от мутаций, происходящих у самцов во время производства гамет (Gao et al., 2016).

При использовании молекулярных часов наибольшее значение имеет варьирование скоростей в разных филогенетических линиях. Одним из возможных объяснений стойких видоспецифичных различий в скорости мутаций является то, что относительная “стоимость” мутации различается между видами. Если так, можно ожидать, что вклад в репарацию также будет различаться, и, следовательно, можно модулировать среднюю частоту мутаций (Bromham, 2002). Показано, что помимо эффективного размера популяции, со скоростью молекулярной эволюции могут быть тесно связаны размер генома, интенсивность метаболизма, размер тела, плодовитость и продолжительность жизни.

Размер генома. Ранее было высказано предположение, что число мутаций за поколение на геном – величина постоянная (эффект Дрейка; Drake et al., 1998), а частота мутирования обратно пропорциональна размеру генома. Позднее было показано, что это правило соблюдается для вирусов и бактерий, в то время как у многоклеточных зависимость противоположная, частота мутаций тем выше, чем больше размер генома (Pfeifer, 2020). Чтобы более тщательно оценить эту закономерность в филогенетических линиях необходимо включение в исследования более широкого набора видов.

Интенсивность метаболизма и размер тела. Обычно считается, что скорость эволюции непрямым образом, через время генерации и размеры тела, связана с интенсивностью метаболизма (например, Martin, Palumbi, 1993; Gillooly et al., 2005). Крупные животные и высокие растения обычно имеют относительно низкую скорость молекулярной эволюции (Martin, Palumbi, 1993; Bromham, 2002; Gillooly et al., 2005; Lanfear et al., 2013; Barrera-Redondo et al., 2018). Это может объясняться, например, тем, что более крупные животные имеют более низкий метаболизм, поэтому генерируют меньше свободных радикалов в единицу времени и потому их ДНК меньше повреждается. С другой стороны, более крупное животное имеет больше клеток и, следовательно, больше копий генома, каждая из которых подвержена мутированию. Риск опасной для жизни мутации должен увеличиваться с увеличением количества поколений клеток, необходимых для создания тела, и количества клеток, необходимых в течение репродуктивной жизни. Таким образом, вид с большим средним размером тела может потребовать больших вложений в контроль повреждений ДНК или точность репликации (Nunney, 1999).

Однако убедительных доказательств того, что скорость молекулярной эволюции объясняется, например, именно интенсивностью метаболизма, пока мало, если учесть ее связь и с другими чертами биологии организмов (Bromham et al., 1996; Lanfear et al., 2007; Galtier et al., 2009). Более того, влияние продолжительности жизни на молекулярную эволюцию было отмечено у таксонов, которые не проявляют признаков старения с возрастом (Hua et al., 2015). Возможно, уровень репарации ДНК регулируется до уровня риска, возникающего из-за клеточных метаболитов, и уравновешивается средней стоимостью мутации.

Продолжительность жизни. Показано, что скорость мутирования мтДНК у млекопитающих, птиц и рыб определенно связана с продолжительностью жизни, но этого нельзя с уверенностью утверждать про скорость эволюции ядерных генов (Nabholz et al., 2008; Welch et al., 2008; Galtier et al., 2009; Hua et al., 2015). Некоторые исследователи объясняют это наблюдение метаболическим повреждением ДНК. В результате аэробного метаболизма в митохондриях образуются свободные радикалы кислорода, которые могут повредить молекулы ДНК. Если удлинение жизни приводит к увеличению продолжительности и репродуктивной жизни, то риск мутации увеличивается (Bromham, 2020).

Плодовитость. Для млекопитающих известны исследования, указывающие на связь плодовитости как со скоростью синонимичных, так и несинонимичных замен (Welch et al., 2008), что может быть связано с большей эффективностью отбора при высокой численности потомства. В целом, определение конкретных особенностей биологии вида, влияющих на скорость молекулярной эволюции, – весьма сложная задача, так как все биологические факторы тесно скоррелированы.

Молекулярная эволюция и скорость диверсификации

С точки зрения Хо (Ho, 2020), серьезные проблемы для использования методов молекулярного датирования могут создавать три формы изменения скорости нуклеотидных замен: взрыв генетических изменений при событиях видообразования (прерывистая эволюция); разная скорость эволюции в течение разных временных периодов (эффект эпох); снижение наблюдаемой скорости с течением времени (rate decay).

Теория прерывистого равновесия (punctuated equilibrium theory) была выдвинута в попытке объяснить пробелы в палеонтологической летописи, которые, по-видимому, характеризуются длительными периодами стагнации, сменяющимися быстрыми всплесками морфологических изменений (Eldredge, Gould, 1972). Вдохновленные этой теорией, молекулярные эволюционисты искали доказательства прерывистой молекулярной эволюции (вспышек молекулярной изменчивости) в связи с эффектом основателя в событиях видообразования (Webster et al., 2003; Pagel et al., 2006). Теоретически доля генетических изменений должна коррелировать с числом событий видообразования в каждой ветви эволюционного древа. Однако простоте таких тестов препятствует проблема, известная как эффект плотности узлов (node-density effect), которая порождает паттерн, подобный ожидаемому при прерывистой молекулярной эволюции (Fitch, Beintema, 1990).

Возможные механизмы, связывающие видообразование со скоростью молекулярной эволюции, должны проявляться только в скорости несинонимичных замен (Bromham, 2020). К этим механизмам относятся отбор, влияющий на полезные замены, и ускорение эффективно нейтральных процессов при прохождении демографического кризиса. Тем не менее связь между скоростью диверсификации и скоростью молекулярной эволюции продемонстрирована и для синонимичных замещений (Lanfear et al., 2010; Duchêne, Bromham, 2013; Bromham et al., 2015). Одно из возможных объяснений связи скорости видообразования и скорости мутаций (в том числе и синонимичных) состоит в том, что уменьшение размера популяции может приводить к снижению эффективности репарации за счет частично вредных мутаций в генах, кодирующих ферменты, ответственные за репарацию и исправление ошибок (proofreading) в процессе репликации ДНК (Lynch et al., 2016). Однако корреляция между скоростью диверсификации и скоростью молекулярной эволюции может быть объяснена и без использования гипотезы прерывистой генетической эволюции если допустить, что повышенная скорость мутирования сама по себе, вне зависимости от ее причин, может быть предпосылкой для ускоренного видообразования (например, через увеличение скорости появления несовместимых замен в изолированных популяциях в рамках модели Добжанского–Меллера) (Hua, Bromham, 2017). Вторая гипотеза предпочтительнее, поскольку проще объясняет связь между видовым разнообразием и скоростью синонимичных замен.

Обратная зависимость между оценкой скорости эволюции и временем (rate decay)

Среди перечисленных выше видимых форм изменения скорости эволюции наиболее распространенной является обратная зависимость между оценкой скорости эволюции и временем (rate decay). Этот феномен проявляется в отсутствии линейной связи между временем дивергенции и генетическим расстоянием, что вносит систематическую ошибку в оценку возраста дивергировавших групп. В результате скорости эволюции, измеряемые между видами (филогенетические) и в пределах вида (популяционные), оказываются различными. Эта проблема возникает, прежде всего, при работе с быстро эволюционирующей мтДНК, а сам феномен объясняется, как предполагалось, наличием горячих точек мутирования и условно нейтральных мутаций (Ho et al., 2005, 2007; Henn et al., 2008). Влияние rate decay на медленно эволюционирующие сайты и локусы менее значительно.

На недавних временах оценки темпов эволюции могут быть завышены за счет включения вредных мутаций, которые, как правило, удаляются из популяции очищающим отбором в течение более длительных периодов времени (Ho et al., 2011). Насыщение нуклеотидной последовательности (многократные замены в одном сайте), наоборот, вызывает недооценку количества генетических изменений на далеких эволюционных временах (Soubrier et al., 2012).

Поскольку скорость нуклеотидных замен для недавних событий значительно выше, чем для отдаленных, филогенетические скорости, полученные на основе древних калибровочных точек, могут оказаться непригодными для датирования внутривидовых межпопуляционных дивергенций. Следовательно, для надежной калибровки часов необходимо использовать не только отдаленные события дивергенции, но и относительно недавние, в том числе произошедшие в плейстоцене–голоцене (<1−2 млн лет). Например, скорость формообразования для оценки возраста такого дихотомического события, как разделение Sorex araneus/S. granarius равна 13.6% за миллион лет, а для разделения S. daphaenodon и S. araneus – 8.6% (Bannikova et al., 2010b); для расчета времен дивергенции между географическими популяциями S. araneus s.str. использовали популяционную скорость нуклеотидных замещений 2μ = 21–37%, в среднем 27.8% (Распопова и др., 2018; Raspopova et al., 2020).

Феномен rate decay согласуется с разницей между высокой скоростью мутирования, оцениваемой по родословным (pedigree rate – сравнение родителей и потомков) и медленной филогенетической скоростью (сравнение видов) (Santos et al., 2005). Доказательства систематических ошибок, зависящих от времени дивергенций и связанных с перенесением времени популяционных дивергенций на филогенетические дивергенции и наоборот, получены для вирусов и бактерий (Aiewsakun, Katzourakis, 2016; Duchêne et al., 2016). Для ядерных геномов Metazoa такие данные ограничены, хотя показано, что частота спонтанных мутаций выше, чем скорость долгосрочной молекулярной эволюции, оцененная с помощью филогенетических методов (но современный человек – исключение из этого правила) (Scally, 2016; Chintalapati, Moorjani, 2020).

Феномен rate decay получил подтверждение по результатам исследования палеоДНК (Ho et al., 2007; Shapiro et al., 2011). Так, филогенетические скорости (мутирования) цитохрома b для серых полевок, оцениваемые по времени радиации рода, составляют около 10−11% (Bannikova et al., 2010a). С другой стороны, скорости, полученные путем анализа гетерохронных сиквенсов (ископаемые голоценовые Microtus arvalis), значительно выше – 32.7% (Martínková et al., 2013). К этому близки скорости, рассчитанные на основе сценариев колонизации M. agrestis севера Европы (плейстоцен-голоценовая граница) – 45.7% (Herman et al., 2014).

Критика концепции rate decay

Концепция rate decay подвергалась активной критике (например, Emerson, Hickerson, 2015). Предполагалось, что увеличение оценок скорости отражает не реальный биологический феномен, а артефакт, связанный с недооценкой роли предкового полиморфизма (Emerson, 2007; Peterson, Masel, 2009; Tuffley et al., 2012), особенностей демографической истории и структурированности популяций (Navascues, Emerson, 2009). Было показано, что при использовании коротких последовательностей и недавних времен дивергенций (что часто бывает при использовании гетерохронных сиквенсов палеоДНК) оценки скорости могут быть завышены иногда в несколько раз (Debruyne, Poinar, 2009; Ho et al., 2011), т.е. смещенная оценка возникает именно вследствие низкой информативности данных. Кроме этого, эффективно нейтральные процессы вряд ли могут объяснить наблюдаемый масштаб rate decay, в силу нереалистичности требуемых для этого демографических сценариев (Woodhams, 2006).

Тем не менее вся вышеперечисленная критика скорее указывает на то, что феномен rate decay обусловлен совокупностью разных причин, относительный вклад которых требует дополнительного изучения. Это не меняет того факта, что датировки, основанные на использовании прямолинейных подходов к анализу быстро мутирующих последовательностей ограниченной длины, часто оказываются существенно смещенными (Ho et al., 2015a). До сих пор недостаточно изучено значение ошибок в определении модели эволюции и распределения скоростей изменчивости сайтов (Soubrier et al., 2012). Так, не ясно в какой степени важен эффект присутствия в мтДНК горячих точек мутирования (Galtier et al., 2006), положение которых само по себе может достаточно быстро меняться.

Исходно предполагалось, что эффект rate decay проявляется на относительно недавних временах. Остается неясным, в какой степени это явление связано со сходным фактом зависимости оценок скоростей эволюции от времени дивергенции на временных шкалах эволюционного масштаба (Molak, Ho, 2015). Очевидно, что существующие модели эволюции не могут адекватно описать характер эволюции некодирующих последовательностей при высоком уровне дивергенции: по мере приближения к насыщению третьи позиции кодонов мтДНК будут все в большей степени недооценивать реальные уровни дивергенции. Отсутствие адекватных моделей для описания эволюции сайтов, находящихся под сильным очищающим отбором (1-е и 2-е позиции кодонов), вероятно, приводит к отсутствию линейной зависимости между степенью дивергенции по синонимичным и несинонимичным заменам на разных уровнях (рис. 1).

Рис. 1.

Соотношение уровней дивергенции митохондриального генома Soricinae по разным типам замен. а – по оси абсцисс отложены глубины узлов филогенетического дерева ML, модель CF + Г (Г = 0.43; PAUP v. 4.0b10); по оси ординат – все замены 3-го положения, модель GTR + Г. б – по оси абсцисс – то же, что на графике а, по оси ординат все замены 1-го и 2‑го положения, модель GTR + I + Г. В обоих случаях регрессия достоверно не линейная (Statistica v. 8.0, Nonlinear estimation).

Возникает вопрос, каким способом использовать мтДНК для датировок? Вполне реалистично предположение, что уровень дивергенции по трансверсиям третьих положений кодона (tv3) мало подвержен влиянию rate decay (из-за медленного насыщения) и учитывая тот факт, что характер эволюции tv3 лучше соответствует строгим часам, чем в случае других типов замен (Irwin et al., 1991). Если в анализе используются данные по всем белок-кодирующим митохондриальным генам, рационально использовать трансверсии в четырехкратно вырожденных позициях, которые, в отличие от tv3, в целом демонстрируют большую выровненность скоростей в разных сайтах. Сравнение динамики дивергенции по разным группам замен может быть проведено с использованием нелинейной регрессии (например, Cosson et al., 2005; Bannikova et al., 2010a, b).

Методы молекулярного датирования – современный этап

Датирование событий дивергенции методом молекулярных часов, или просто “молекулярное датирование” подразумевает оценку времени расхождения филетических линий на основе анализа молекулярно-генетических данных. В настоящее время использование молекулярных часов для датирования эволюционных событий довольно быстро и значительно прогрессирует в связи с ростом вычислительной мощности филогенетических методов (Bromham, Penny, 2003; Kumar, 2005). Примечательно, что прогресс в использовании методов молекулярного датирования во многом связан с усложнением моделей эволюции, что отличает современные исследования от их более раннего этапа и является магистральным направлением современной филогенетики. Исследования в этой области привели к разработке новых методов расчета времен дивергенции таксонов (Heath, Moore, 2014; Ho, Duchêne, 2014; Kumar, Hedges, 2016). Прежде всего, к ним относятся методы, позволяющие справиться с вариациями скорости эволюции не только между генами, но и между линиями, т.е. методы нестрогих часов (Hasegawa et al., 1989; Sanderson, 1997, 2002; Thorne et al., 1998).

Другой фактор – увеличение объема доступных для анализа данных, что в сочетании с адекватными моделями эволюции нуклеотидных последовательностей приводит к уменьшению доверительных интервалов и, следовательно, к более точным оценкам возраста узлов ветвления и скоростей эволюции (Tajima, 1993; Bromham et al., 2000; Kumar, 2005; Reis et al., 2015). Наконец, важную роль играет развитие разнообразных подходов к использованию калибровочной информации – более полное использование постоянно и быстро растущего объема палеонтологических данных (Kumar, 2005; Reis et al., 2015).

Основные принципы получения молекулярных датировок

Основные этапы процедуры получения молекулярных датировок представлены на схеме (рис. 2) и состоят в следующем: (1) разбиение данных на партиции и получение филогенетического древа по выбранным генам, (2) проверка часов: тест на равенство скоростей, (3) подбор модели часов для каждой партиции (гена или группы генов), (4) в случае обращения к свободным часам (Relaxed clock), выбор скоррелированных или нескоррелированных часов, (5) калибровка часов, (6) получение относительных и абсолютных времен, построение хронограммы. Рассмотрим более подробно наиболее сложные из этих этапов и обсудим возможные ошибки.

Рис. 2.

Схема получения молекулярных датировок.

Процедуре датирования предшествует выбор и секвенирование генов, на основе которых будет проводиться датирование. Эти локусы должны быть достаточно информативны, но не насыщены. Например, мтДНК на высоких уровнях дивергенции часто дает смещенные оценки времен (Phillips et al., 2009; Brandley et al., 2011; Bannikova et al., 2014; Dornburg et al., 2014). Поэтому при уровне сходства митохондриальных последовательностей менее 85% мы не рекомендуем использовать мтДНК из-за очевидного сильного насыщения, которое не компенсируется существующими моделями эволюции.

После подбора моделей эволюции генов по имеющемуся набору данных строится филогенетическое древо. Хотя ряд методов (см. ниже) позволяет одновременно получить топологию и оценить времена дивергенций, но лучше сначала получить оценку топологии, независящую от допущений о характере изменения скорости эволюции. Важно выбрать правильную модель эволюции, а после этого правильно разбить набор данных на партиции (т.е. выделить группы последовательностей со сходным характером эволюции).

Далее проводят проверку молекулярных часов. Исходная гипотеза предполагает, что скорости молекулярной эволюции постоянны для всех филетических линий и во времени (модель строгих часов). Если это так, то все ветви филогенетического древа можно охарактеризовать с помощью единой оценки. Для проверки соблюдения часов проводится тест относительных скоростей (Relative Rate Test, RRT; Wu, Li, 1985; Tajima, 1993) или тест отношения правдоподобия (Likelihood Relative Test, LRT; Felsenstein, 1981). Тест относительных скоростей Таджимы применим для сравнения двух конкретных групп и в настоящее время в значительной степени вытеснен методами, позволяющими проверять гетерогенность скоростей между линиями по всему филогенетическому древу, такими как LRT.

Перечисленные выше тесты равенства скоростей на древе ориентированы только на очень длинные последовательности, а в случае недостаточной длины выравнивания и/или генов с низкой изменчивостью, их использование может привести к недооценке варьирования скоростей и ошибке в определении датировок (Bromham et al., 2000). В рамках байесовского подхода проверку соответствия строгим часам можно проводить путем вычисления Байес-факторов, однако этот метод требует существенных временных затрат.

В простейшем случае, если постоянство скорости не отвергается, то не составляет труда вычислить время дивергенции таксонов по формуле T_ij = d_ij/2r, где d − ожидаемое число замещений (генетические дистанции). Для этого надо по палеонтологическим (или биогеографическим) данным определить время дивергенции хотя бы для одной пары таксонов (T₀) и на основании этого получить оценку скорости r = d₀/2T₀. После этого можно вычислить оценки времен для остальных дивергенций. Используя эти простейшие формулы или равнозначную T_ij = T₀d_ij/d₀, следует помнить, что получаемое отношение – это смещенная (завышенная) оценка, причем размер смещения тем больше, чем больше относительная ошибка (коэффициент вариации) для d₀ (Nei et al., 2001; Rodríguez-Trelles et al., 2002). Поэтому, калибруя часы на основании последовательности с малым числом замен, мы рискуем получить завышенные оценки времен.

Если используются отдельные гены (или конкатенированные последовательности), то оценивается время дивергенции аллелей, а не таксонов, поэтому необходимо сделать поправку на предковый полиморфизм. Если датирование производится по конкатенированной последовательности, то временам узлов на древе соответствуют средние времена расхождения аллелей, а не собственно таксонов. В отсутствие гибридизации эти времена дивергенции аллелей старше, чем времена дивергенции таксонов. Этот фактор важно учитывать при анализе дивергенции близких видов.

Модели строгих часов. Эти модели обычно подходят для неглубоких филогений близкородственных видов и популяций в составе одного вида, где варьирование скорости молекулярной эволюции небольшое (Brown, Yang, 2011), например, если разница между последовательностями составляет менее 5% (Zhu, 2020). Но это предположение мало реалистично при сравнении далеких видов (Langley, Fitch, 1974; Yoder, Yang, 2000; Hasegawa et al., 2003). Тем не менее, если строгие часы выполняются, лучше использовать их, чем методы, допускающие варьирование скоростей, так как ошибка датировки в этом случае будет меньше (Brown, Yang, 2011).

Что делать, если модель строгих часов отвергнута? Если какой-либо таксон сильно отклоняется от остальных по скорости эволюции, простейший выход из положения – это исключить его из анализа (Takezaki et al., 1995; Hedges, Kumar, 2003). Наконец, для учета неоднородности скоростей (молекулярной эволюции) на филогенетическом древе предлагаются различные модели молекулярных часов. Эти модели примерно соответствуют двум типам: те, которые допускают всего несколько изменений скорости эволюции последовательностей, но различия между ними существенные, и те, которые предполагают множество разных скоростей, относительно мало отличающихся друг от друга (Welch, Bromham, 2005). В первом случае молекулярных скоростей обычно намного меньше, чем ветвей на древе.

Локальные часы. Методика, заключающаяся в использовании небольшого числа разных скоростей эволюции для разных участков древа, получила название “локальных часов” (Local Clock) и включает разнообразные алгоритмы многоскоростных часов (“multi-rate” clocks) (обзоры: Kumar, 2005; Welch, Bromham, 2005; Ho, Duchêne, 2014; Bromham et al., 2018). В таких моделях важной задачей является определение количества скоростей эволюции и участков на древе, к которым относятся эти скорости. Для этого в рамках метода максимального правдоподобия используются множественные тесты RRT и LRT. Эта процедура не всегда приводит к однозначным результатам (Bromham et al., 1998). Если участков дерева с разными “локальными часами” оказывается слишком много, метод становится неприменимым (Rannala, 2002; Felsenstein, 2004).

Тем не менее оказалось возможным успешно реализовать метод локальных часов в рамках байесовской статистики, где используются методы случайных локальных часов (random local clock, RLC; Drummond, Suchard, 2010, пакет BEAST) и процесс Дирихле (Dirichlet process prior, DPP-R; Heath et al., 2012, программа DPPDiv). Здесь результат соответствует не единственному оптимальному набору скоростей для ветвей, а апостериорному распределению числа локальных часов, их скоростей и положения событий смен одних часов другими на древе.

Свободные часы. Строгие часы для всего древа и независимые скорости для каждой ветви древа – это две крайности, которые в реальном эволюционном процессе маловероятны. Более вероятно, что варьирование скорости молекулярной эволюции ограничено какой-либо закономерностью, например, скорости в линиях предков–потомков более сходны, чем в отдаленных ветвях (Gillespie, 1991). Поэтому более эффективный по сравнению с локальными часами подход состоит в том, чтобы моделировать изменение скорости на филогенетическом древе (Sanderson, 1997; Huelsenbeck et al., 2000; Kishino et al., 2001).

В настоящее время широко используется модель “свободных” часов (Relaxed clock; Drummond et al., 2006). Этот метод датировок допускает варьирование скорости эволюции для каждого гена общей последовательности и каждой ветви филогенетического древа. Применение этого метода особенно эффективно при использовании нескольких калибровок, так как при этом лучше оценивается изменение скорости между ветвями древа (Thorne et al., 1998; Sanderson, 2003). Выбор модели скорости – очень важный шаг перед тем, как приступить к оценке времен дивергенций. Две основные модели свободных часов – это часы с автокорреляцией скоростей (autocorrelated branch-rate, ABR) и часы без корреляции, т.е. с независимыми скоростями (independent branch-rate, IBR) (Thorne et al., 1998; Kishino et al., 2001; Drummond et al., 2006; Lepage et al., 2006; Rannala, Yang, 2007; Ho, 2009; Ho, Duchêne, 2014).

В первом случае ожидается, что скорости в соседних ветвях древа относительно сходны; во втором – скорости всех ветвей древа распределены единообразно (экспоненциально, логнормально и т.д.), но корреляции скоростей в соседних ветвях нет. В обоих случаях моделируются либо средние скорости на ветвь, либо скорости в узлах древа. Наиболее принятый вариант модели с автокорреляцией (Thorne et al., 1998) эквивалентен модели геометрического броуновского движения, при этом логарифм скорости в узле-потомке R₁ распределен нормально с математическим ожиданием log (R₀) и дисперсией σ² × t, где R₀ – скорость в предковом узле, t – протяженность временного интервала между узлами 0 и 1, а σ² – константа, отражающая относительную скорость изменения скорости.

Первой модели соответствует относительно медленная, но не ограниченная никакими пределами, эволюция скорости изменений в нуклеотидной последовательности. Этот принцип подходит для изучения близкородственных видов (Ho, 2009). Нереалистичность этой модели – в отсутствии стационарного распределения, что приводит к тому, что скорость может достигать очень больших значений.

В модели нескоррелированных часов частоты выбираются из статистического распределения и не зависят от значений на соседних ветвях (Drummond et al., 2006; Rannala, Yang, 2007). Эта модель осмысленна, когда скорости нуклеотидных замен меняются относительно быстро, но имеют ограничения и/или варьируют вокруг некого оптимума. Нереалистичность этой модели заключается в том, что даже в соседних коротких ветвях скорость может быть столь же разной, что и в дальних. Отмечается также зависимость результата от числа таксонов в анализе (Guindon, 2020).

В качестве более реалистичных моделей предлагалось использовать процессы Орнштейна–Уленбека (Aris-Brosou, Yang, 2002; Reis et al., 2016) и Кокса–Ингерсолла–Росса (Lepage et al., 2006), которые с одной стороны предполагают существование значительной стохастической компоненты в эволюции скорости нуклеотидных замен, а с другой – существование некой “оптимальной” скорости, которая является математическим ожиданием стационарного распределения. Очевидно, что при небольших временах процесс будет сходен с автокорреляционной моделью, а при больших – с моделью независимых скоростей. Недавно была предложена еще одна, пока мало исследованная, модель нестрогих часов, согласно которой вариации скорости связаны исключительно с резкими ускорениями в момент диверсификации, что представляет собой эволюцию по типу прерывистого равновесия (Manceau et al., 2020).

Выбор модели и представляет собой сложную задачу, и заметно влияет на результат. Выбор можно осуществлять с помощью Байес-факторов (Bayesi factor, BF), но чувствительность этого метода невысока (Ho et al., 2015a). Тем не менее результаты тестов чаще согласуются с представлением, что доминирующим паттерном в молекулярной филогенетике различных групп видов является автокорреляция скоростей ветвлений (например, Tao et al., 2019).

Определение партиций для генов со сходными моделями часов. Предполагается, что существуют группы локусов, в пределах которых скорости эволюции изменяются сходным образом, и поэтому к ним применимы одни и те же модели нестрогих часов. Показано, что схема разбиения данных на партиции может сильно влиять на оценки времен (Angelis et al., 2018). Если один и тот же набор данных будет адекватно разделен на большее количество партиций, оценки времени станут более точными (Zhu, 2020). Чтобы избежать больших затрат на вычисления (через BF) можно использовать, например, алгоритмы для разделения на партиции, применяемые в ML (Maximum Likelihood) анализе: Partitionfinder (Lanfear et al., 2017), Modelfinder (Kalyaanamoorthy et al., 2017). Другой (более быстрый и менее строгий) вариант – алгоритмы на основе кластеризации длин ветвей генных деревьев – ClockstaR и сходные методы (Duchêne et al., 2014, 2016).

Использование байесовских подходов для получения молекулярных датировок

Методы байесовской статистики впервые были введены в обиход филогенетики в 1990-х годах и быстро набрали популярность. Они используются в филогенетике и филогеографии для определения видовых границ, измерения популяционных параметров (потока генов между видами) и оценки времени дивергенции.

Основная цель байесовской филогенетики – оценить распределение тех эволюционных параметров, при которых с высокой вероятностью генерируется исследуемый набор данных. В число представляющих интерес параметров могут входить топология древа, а также глубины узлов, которым соответствуют времена дивергенции. Основное достоинство байесовских методов – возможность эффективной работы со сложными моделями с большим количеством параметров – возможность гибко учитывать исходную неопределенность в значении параметров, например, калибровочную информацию в форме априорного распределения. Как результат, на выходе мы получаем апостериорную оценку параметров с учетом его разброса (в форме интервала области высокой плотности апостериорного распределения вероятности – high posterior density, HPD) (Drummond et al., 2006; Yang, Rannala, 2006; Ronquist et al., 2012).

Две основные модели свободных часов реализованы в пакетах, использующих алгоритмы: MCMCTree (Brown, Yang, 2011) и BEAST (Drummond et al., 2012). Априорные распределения задаются для калибровочных данных (см. ниже), параметров моделей эволюции последовательностей (возможно для нескольких партиций), параметров модели эволюции скорости (могут быть разными для разных генов), а также для формы древа (например, модели Юла, birth–death, либо модели коалесценции в стабильной или растущей популяции). Необходимость введения априорного распределения для формы древа – сложный момент в байесовском анализе, так как это может влиять на результат (Ritchie et al., 2017), а объективное обоснование выбора с помощью Байес-факторов требует значительного компьютерного времени. В более простом случае подразумевается, что топология древа едина для всех генов.

Роль анцестрального полиморфизма и метод видового древа. Получать молекулярные оценки времени дивергенции часто удобно на основе не комбинированной последовательности генов, а так называемого видового древа (species tree). Каждый ген может иметь свою собственную историю, а время дивергенции аллелей, как правило, старше времени дивергенции таксонов. Метод видового древа позволяет решить эти две проблемы путем включения в модель оценок полиморфизма для всех внутренних узлов (multispecies coalescent model), что дает более реалистичные оценки времен, но за счет возрастания временных затрат на вычисления (Species tree dating; Heled, Drummond, 2010). Однако анализировать этим методом большие мультигенные наборы данных, в том числе и геномные, невозможно (Ogilvie et al., 2016).

Датирование филогеномных данных байесовскими методами

В последние два десятилетия вследствие развития высокопроизводительного секвенирования наблюдается стремительное накопление геномных данных. Это способствует углублению понимания эволюции на геномном уровне, но одновременно создает новые проблемы для получения молекулярных датировок из-за серьезных вычислительных проблем (Ho, 2014; Tong et al., 2016).

Тем не менее, несмотря на временные затраты, ведущим методом в филогеномном датировании остается байесовский подход (Reis et al., 2012, 2018; Springer et al., 2012; Jarvis et al., 2014; Zheng, Wiens, 2016). Значительные затраты компьютерного времени при использовании этого статистического подхода связаны с тем, что апостериорное распределение большого числа параметров генерируется с помощью метода Монте-Карло с марковскими цепями (MCMC) (Bromham et al., 2018). Повышение эффективности алгоритмов MCMC таким образом, чтобы они могли обрабатывать наборы данных в масштабе геномов, в настоящее время становится основной обсуждаемой методической темой в филогенетических исследованиях.

Например, теоретически получить топологию и времена дивергенций одновременно возможно (Drummond et al., 2006), но непрактично для очень больших филогеномных данных, потому что вычисления требуют слишком много времени и огромных вычислительных мощностей. Поэтому принято прибегать к упрощению модели, фиксируя топологию, или вводить ограничения на монофилию группировок (Drummond et al., 2006; Yang, Rannala, 2006). Наиболее важная стратегия ускорения вычислений в процессе молекулярного датирования по геномным данным – это, вероятно, использование аппроксимации правдоподобия (approximate-likelihood), что обеспечивает ускорение в 1000 раз и позволяет получить приближенную байесовскую оценку времен дивергенций по филогеномным данным (Álvarez-Carretero, Reis, 2020).

Датирование не байесовскими методами

Многие методы не байесовской статистики, использующие нестрогие часы, более приемлемы в отношении вычислительного времени и могут применяться к огромным массивам данных. Одним из широко используемых методов является метод на основе “оштрафованного правдоподобия” (penalized likelihood; Sanderson, 2002), реализованный в программах r8s (Sanderson, 2003) и treePL (Smith, O’Meara, 2012). На вход подается древо с длинами ветвей, полученными каким-либо методом, не предполагающим существование строгих часов. Алгоритм вычисляет набор скоростей нуклеотидных замен для ветвей и возрастов узлов таким образом, чтобы минимизировать величину penalized likelihood, которую образуют два слагаемых: первое из них соответствует правдоподобию длин ветвей (отклонение наблюдаемых длин ветвей от ожидаемых), второе минимизирует различия между эволюционными скоростями в ветвях предков и потомков (Sanderson, 1997, 2002), что соответствует модели автокорреляции скоростей (Thorne et al., 1998; Kishino et al., 2001). Например, с помощью программы r8s (Sanderson, 2003) при использовании 21 калибровочной точки из статьи Мередита с соавт. (Meredith et al., 2011), которые были заданы как максимальные и минимальные величины дивергенций, мы провели оценку времен дивергенции четырех ветвей Eulipotyphla по мультилокусным данным (433 гена, 235 тыс. п.о.) (Банникова, 2019).

Алгоритм RelTime, реализованный в программе MEGA-X, тоже сводит к минимуму различия между скоростью эволюции предков и потомков (Tamura et al., 2012, 2018). Скорость работы алгоритма велика благодаря дополнительным упрощениям – ошибки длин ветвей в расчет не принимаются. Существуют и другие совместимые с нестрогими часами алгоритмы, которые выигрывают в скорости за счет упрощения модели, что позволяет им работать с большими данными: датирование методом наименьших квадратов – least-squares dating, LSD (To et al., 2016), treedater (Volz, Frost, 2017), TreeTime (Sagulenko et al., 2018), wLogDate (Mai, Mirarab, 2021).

Включение калибровок в анализ

Ранее в большинстве случаев калибровочная информация сводилась к фиксации возраста какого-либо узла на некотором определенном значении (точечная калибровка), что в настоящее время считается неоправданным упрощением (Nguyen, Ho, 2020). В современном филогенетическом анализе, как правило, используются интервальные оценки датировок. В простейшем случае задается минимальная и максимальная граница интервала равномерного распределения, например, в таких методах, как penalized likelihood (Sanderson, 2002) и RelTime (Tamura et al., 2012). Более гибкий подход, реализованный в байесовских методах, позволяет использовать калибровочную информацию как априорное распределение возраста узлов, при этом функция распределения может быть любой (Ho, Phillips, 2009), главное, чтобы она отражала исходную неопределенность возраста дивергенции клад. Обычно используются логнормальное, экспоненциальное или гамма распределение. Распределение может быть жестко ограничено (жесткая граница снизу или и снизу, и сверху), или иметь мягкие границы (Yang, Rannala, 2006).

Палеонтологические калибровки

Задача калибровки молекулярных часов не решается в рамках одной молекулярной генетики. Калибровочные данные могут включать разную информацию (биогеографическую и палеогеографическую, молекулярные датировки, полученные из прежних исследований), но основной источник информации – это палеонтологические датировки ископаемых находок изучаемой таксономической группы (Hipsley, Müller, 2014).

Неправильная калибровка часов во многом связана с неопределенностью, происходящей со стороны палеонтологии. Источники серьезных ошибок включают неверное определение палеонтологического возраста и филогенетического положения фоссилий (Benton, Donoghue, 2007; Gandolfo et al., 2008). В некоторых группах использование палеонтологических датировок малоэффективно из-за бедности летописи или невозможности морфологической диагностики (Smith, Peterson, 2002). Нередко бывает сложно однозначно определить, какой именно узел на древе должен быть откалиброван с использованием данного ископаемого материала, потому что это зависит от того, относится ли материал к стволовой группе или к ветви потомков (Benton, Donoghue, 2007). Включение в анализ большого количества калибровочных точек повышает точность оценок времени (Lee, 1999; Lukoschek et al., 2012).

Если палеонтологический возраст и клада, к которой принадлежит фоссилия, известны, логично предположить, что возраст фоссилии ограничивает снизу время дивергенции содержащей ее клады от ближайшей сестринской группы (= минимальная нижняя граница). Остается еще один существенный источник неопределенности: не известно, сколько времени прошло между моментом обособления клады и возрастом самой ранней фоссилии, заведомо к ней принадлежащей (= время существования “линии-призрака”, ghost lineage; Phillips, 2016; Springer et al., 2017). В свою очередь, время призрака включает два компонента – время от точки дивергенции до появления диагностических синапоморфий группы и интервал до первой обнаруженной фоссилии (рис. 3). Последняя величина зависит от вероятности фоссилизации с одной стороны и активности палеонтологов с другой (Gandolfo et al., 2008). Если возраст фоссилии известен с точностью до геологического диапазона, то приходится использовать его верхнюю (позднюю) границу в качестве минимального возраста узла, тогда разница между верхней границей диапазона и неизвестным истинным возрастом фоссилии оказывается третьим слагаемым оценки времени существования призрака.

Рис. 3.

Использование палеонтологической калибровочной информации в качестве минимальной границы возраста узла. Красным кружком обозначен изучаемый узел дивергенции филогенетических линий А и В. Пунктирные линии разделяют геологические периоды. Вертикальная красная стрелка указывает на самые ранние находки, уверенно относимые к линии А. Синий крестик показывает время появления морфологических синапоморфий в линии А. Другие значки обозначают: † – ископаемые остатки, безусловно относящиеся к линии А; ‡ – ископаемые остатки, безусловно относящиеся к линии В; + – ископаемые остатки, имеющие плезиоморфную морфологию, соответствующие предку таксонов А и В.

Очевидно, что минимальных ограничений для датировки недостаточно, необходимо включить как минимум хотя бы одно максимальное ограничение. Однако максимальные возрастные ограничения установить трудно, потому что они эквивалентны постулированию отсутствия определенной клады в какой-то момент прошлого. Выбор максимальных возрастных ограничений оказывает значительное влияние на получаемые молекулярные датировки (Hug, Roger, 2007; Warnock et al., 2015). В качестве примера можно привести недавнюю дискуссию вокруг временной шкалы эволюции современных птиц (Jarvis et al., 2014; Cracraft et al., 2015; Mitchell et al., 2015). Часто максимальные границы выбираются наиболее консервативным образом (т.е. избыточно древними) (Ho, Phillips, 2009), что может приводить к смещенным и неточным оценкам времен. Очевидно, что максимальные ограничения правильней задавать в виде мягких границ (Yang, Rannala, 2006), например, границы 95%-го доверительного интервала.

Для того чтобы объективно оценить доверительный интервал возраста узла исходя из времен находок фоссилий, был предложен метод стратиграфического брэкетинга (Marshall, 2008), использовавший распределение относительных возрастов самых ранних фоссилий для нескольких (многих) клад древа. Метод исходно опирался на не всегда реалистичные допущения о распределении находок на временной шкале, однако в дальнейшем были предложены его модификации, в которых применялись более сложные модели (Marshall, 2010).

Также были предложены менее формализованные методы определения максимальных границ, такие как филогенетический брэкетинг и стратиграфический баундинг (Benton, Donoghue, 2007; Meredith et al., 2011). В последнем методе в качестве верхней границы возраста узла используется нижняя (ранняя) граница геологического интервала (или двух интервалов), предшествующего тому, в котором был найден самый древний ископаемый материал. В филогенетическом брэкетинге возрастной диапазон узла ограничен возрастом его соседних узлов (т.е. таких, которые являются непосредственными предками и потомками), что может основываться на палеонтологической летописи или на независимой молекулярной оценке. Например, получение молекулярных датировок для ежовых содержит определенные трудности из-за нередкой двусмысленной интерпретации ископаемых остатков этой группы (Rich, 1981), что объясняется генерализованным строением зубной системы − основного материала палеонтологических исследований. По этой причине при подборе калибровочных точек для датирования дивергенций в сем. Erinaceidae (Bannikova et al., 2014) самая древняя калибровочная точка, связанная с олигоцен-эоценовым периодом (28–49 млн лет) радиации базальных линий современных ежовых была взята из работы Мередита с соавт. (Meredith et al., 2011). Максимальная граница для этой калибровочной точки определяется через стратиграфический ограничитель и филогенетический брэкетинг и должна приниматься с осторожностью. Согласно Лопатину (Lopatin, 2006), раннеэоценовые ископаемые ежовые относятся к примитивным гимнурам; по этой причине предпочтение отдавалось накладыванию меньших ограничений на время разделения Erinaceinae/Hylomyinae и отнесению верхнего предела этого события к границе палеоцена/эоцена.

В качестве внутренних калибровочных точек использовали: 1) время разделения Hylomys s.str. и Neotetracus (16 млн лет – минимальная граница) на основании ископаемых остатков из раннего миоцена Таиланда, относимых к этим таксонам (Mein, Ginsburg, 1997); 2) ожидаемое время базальной радиации кроновых Erinaceinae в MN13 (5.5 млн лет как минимальная граница) на основании ископаемых остатков, определенных как Erinaceus (Storch, Qiu, 1991; Qiu, Storch, 2005). Однако следует признать, что эти калибровочные точки являются вероятными, но не очевидными. Отнесение события разделения Neotetracus и Hylomys ко времени не позднее 16 млн лет назад вызывает вопросы, учитывая трудности определения этих гимнур не только по ископаемым остаткам, но и по рецентному морфологическому материалу (Frost et al., 1991; Gould, 1995). Также нет уверенности в существовании хороших признаков, позволяющих отличать поздне-миоценовых Erinaceus от других родов ежей. Некоторые авторы вообще избегают обсуждать принадлежность ископаемых остатков ежовых к тому или иному роду. Известно, что, когда такие попытки предпринимались, возникала глубокая и трудно разрешимая путаница, как, например, в случае миоценового р. Mioechinus (Depéret, 1887; Butler, 1948; Rich, 1981; Gould, 1995; Mein, Ginsburg, 2002).

Что касается стратиграфического баундинга, этот прием был применен нами при датировании дивергенций землероек: в р. Sorex, где молекулярные часы были откалиброваны по пяти палеонтологическим датировкам (Bannikova et al., 2018), а также в р. Crocidura (Bannikova et al., 2021).

Вторичная калибровочная информация

В настоящее время во многих исследованиях для калибровки часов используются уже опубликованные ранее молекулярные датировки. Их называют вторичными калибровками, поскольку они основаны не на прямых палеонтологических или биогеографических данных, а на полученных ранее временах дивергенций. Очевидно, что в некоторых ситуациях с помощью вторичной калибровки из надежного источника могут быть получены более точные оценки времени, чем с помощью первичной калибровочной информации из ненадежных палеонтологических источников (Kumar, Hedges, 1998). Эта методика уязвима для критики (Hipsley, Müller, 2014), однако минимизировать ошибку можно путем конструирования априорных распределений, которые учитывают все источники ошибок оценки, основанной на вторичной калибровке.

Вторичные калибровки обычно используют для таксонов, по которым ограничена палеонтологическая информация, например, бактерии или грибы, а также для увеличения числа калибровочных точек при датировании многовидовых филогений (например, Reis et al., 2012, 2018). В наших исследованиях использовались вторичные калибровки в случаях, когда доступные данные задавали только минимальную границу, например, при определении времен дивергенций кротовых (Bannikova et al., 2015), кутор (Igea et al., 2015) и тушканчиков (Shenbrot et al., 2017).

Калибровки, основанные на несовременных нуклеотидных последовательностях

Калибровка молекулярных часов с использованием гетерохронных данных полезна в исследованиях древней ДНК, а также для оценки темпов и временных масштабов эволюции видов с быстрой сменой поколений. Обретение опыта работы с ДНК ископаемых образцов открыло возможность использовать пробы от экземпляров, для которых имеются радиоуглеродные датировки. Однако ошибки радиоуглеродного датирования, возникающие в том числе из-за колебаний содержания ¹⁴C в атмосфере (Reimer et al., 2013), представляют собой отдельный источник неопределенности возраста (Guilderson et al., 2005). Наконец, при работе с палеоДНК существует необходимость делать поправки на химическую модификацию последовательностей (Hofreiter et al., 2001). При небольшой длине палеосиквенсов оценки времен и скоростей могут быть смещены (см. раздел о занижении оценок скорости эволюции с течением времени).

Другая область, где продуктивно использование гетерохронных последовательностей для молекулярных датировок, – это филогения быстро эволюционирующих организмов, например, вирусов (в частности, у РНК вирусов скорость накопления замен может составлять 10^–3 на сайт в год (Duffy et al., 2008)). Важная практическая составляющая молекулярного датирования вирусных филогений – исследование историй эпидемий (например, Pekar et al., 2021).

Простейший способ оценить скорость и время, имея филогению для гетерохронных последовательностей, – использовать регрессию расстояния от корня древа до концов ветвей (root to tip distance) на время образцов, как это реализовано в программе TempEst (Rambaut et al., 2016). Предварительно необходимо проверить, достаточно ли информативны данные для этого анализа, что делается с помощью рандомизационного теста (Ramsden et al., 2009). Кроме этого, для гетерохронных данных активно используются методы ML (treedater; Volz, Frost, 2017) и байесовской статистики (BEAST; Heled, Drummond, 2010). Ситуация осложняется тем, что для описания эволюции вирусов часто требуется использование модели rate decay (Duchêne et al., 2014).

Модель FBD и датирование на объединенных данных

Классический метод использования калибровок сводится к двухстадийному анализу: сначала, исходя из филогенетического положения и возраста фоссилий, оценивается возраст одного или нескольких узлов дерева (node-dating), затем, используя эту информацию, определяется возраст остальных узлов древа. Принципиально иной подход – датирование на объединенных данных (total evidence dating) – заключается в построении хронограммы путем одновременного анализа молекулярных и морфологических данных, причем последние включают информацию как для современных видов, так и для ископаемых таксонов с известным возрастом (Stadler, 2010; Heath et al., 2014; Gavryushkina, Zhu, 2020). Эта процедура реализована в нескольких программах, использующих байесовский подход (MrBayes, BEAST 2). Анализ основан на модели фоссилизации – рождения–смерти (Fossilized birth–death, FBD), описывающей одновременно структуру древа, вероятность захоронения и обнаружения фоссилий. Если филогенетическое положение вымерших видов известно хотя бы приблизительно, то возможно использовать вариант анализа без привлечения морфологических данных (Heath et al., 2014). Исходный вариант FBD модели предполагал, что процессы фоссилизации и диверсификации описываются одним и тем же набором параметров во всех частях древа. Более реалистична модель фоссилизации кладообразования (fossilized birth–death process skyline model, FBD; Stadler et al., 2013; Gavryushkina et al., 2014), которая постулирует существование нескольких эпох, каждая со своей динамикой этих процессов.

Сильная сторона датирования на объединенных данных – возможность использовать максимум палеонтологической информации, большая часть которой при классическом подходе оказалась бы вне анализа, в частности, из-за неопределенности филогенетического положения ископаемого материала. Модель FBD в разных ее вариантах требует дальнейшего изучения. Пока же нельзя исключить, что результаты будут чрезмерно чувствительны к исходным допущениям (Matzke, Wright, 2016; O`Reilly, Donoghue, 2020). Отдельная проблема – надежность результатов совместного анализа морфологических и молекулярных данных. Это связано с неадекватностью существующих моделей морфологической эволюции, высокой вероятностью филогенетических ошибок из-за адаптивных параллелизмов, что, например, скомпрометировало результаты О’Лири (O`Leary et al., 2013). Наконец, насыщенность модели параметрами требует больших вычислительных мощностей.

Биогеографические калибровки

На практике датирование по ископаемым материалам осложняется целым рядом теоретических и эмпирических проблем. Хорошую альтернативу палеонтологической информации составляют биогеографические данные. К первым публикациям в этой области относится работа по гавайским цветочницам, или медоносам (Hemignathus spp.), в которой для калибровки времени радиации этих птиц использовали возраст Гавайских островов (Fleischer et al., 1998). Некоторые особенности Гавайских островов делают их подходящими для калибровки молекулярных часов. Считается, что они образовались вдоль “конвейерной ленты” и расположены последовательно по возрасту от самых старых (29.8 млн лет) островов на северо-западе до самых молодых (0.5 млн лет) на юго-востоке (Fleischer et al., 1998; Price, Clague, 2002).

Возраст островов может быть использован в качестве калибровки молекулярных часов, если соблюдается правило прогрессии (Hennig, 1966), согласно которому есть соответствие между возрастом островов и топологией филогенетического древа изучаемых таксонов. Например, в случае эндемичных гавайских цветочниц, дрозофил и бабочек самые молодые острова населяют виды, образующие внутренние ветви филогенетического древа, в то время как виды, распространенные на старых островах, располагаются на древе ближе к корню (Fleischer et al., 1998; Haines et al., 2014). Калибровка филогении по времени с помощью биогеографии и палеогеографии работает по принципу, что для данного палеогеографического контекста одни биогеографические сценарии более вероятны, чем альтернативные, и эта вероятность влияет на принимаемый в результате возраст изучаемых видов (Ho et al., 2015b; Baets et al., 2016).