Онтогенез, 2020, T. 51, № 5, стр. 369-378

ВВЕДЕНИЕ

Для контакта сперматозоида с яйцеклеткой и акросомального экзоцитоза, мужские гаметы млекопитающих должны пройти ряд биохимических превращений в женском репродуктивном тракте, т.е. подвергнуться капацитации. Капацитация характеризуется различными мембранными модификациями, приводящими к снижению содержания холестерола (Brouwers et al., 2011). При удалении холестерола снижается текучесть плазматической мембраны сперматозоидов, что приводит к увеличению ее проницаемости для различных ионов (Gadella, Boerke, 2016). В результате изменения проницаемости мембраны изменяются потоки Ca²⁺ и ${\text{HCO}}_{3}^{ - }$, что ведет к активации аденилилциклазы и изменению уровня сAMP (Harayama, 2013). Также во время капацитации происходят многочисленные биохимические изменения, в т.ч. увеличение концентраций интрацитоплазматического кальция, цАМФ, внутриклеточного рН и фосфорилирования белков по тирозину (Harrison, Gadella, 2005; Pons-Rejraji et al., 2009).

Регулирование внутриклеточной концентрации Ca²⁺ является одним из важнейших событий, происходящих во время капацитации (Darszon et al., 2005). В опубликованных работах было показано, что капацитация является Ca²⁺-зависимым процессом (Rodriguez et al., 2012), и кальций действует на различные сигнальные пути в сперме (Lawson et al., 2008). Увеличение рН, концентрации цАМФ и фосфорилирование тирозина не происходит, когда сперматозоиды инкубируют в бескальциевой среде (Battistone et al., 2013). Более того, аденилил циклаза спермы, которая значительно активируется ${\text{HCO}}_{3}^{ - }$, также активируется Ca²⁺ (Buffone et al., 2014). Механизмы, участвующие в регуляции Ca²⁺ во время капацитации, изучены недостаточно полно.

Имеются доказательства того, что акросомная реакция сперматозоидов, выражающаяся в виде экзоцитоза при приближении сперматозоида к ооциту, является Ca²⁺-зависимым процессом (Almadaly et al., 2015). Внеклеточный кальций необходим для акросомной реакции и использование некоторых блокаторов ионных каналов ингибирует этот процесс, указывая на важную роль этих ионов (Pons-Rejraji et al., 2009). В сперматозоидах некоторых видов грызунов, которые инкубировали в бескальциевой среде, акросомная реакция не проходила до тех пор, пока в среду не добавляли кальций (Jimenez-Gonzalez et al., 2006). Хотя точные механизмы, приводящие к увеличению Ca²⁺ в сперматозоидах во время акросомной реакции не известны, имеются данные, что необходимый для экзоцитоза акросомальных везикул Ca²⁺ входит в клетки через потенциалзависимые каналы T-типа (Florman et al., 2008). Кроме того, показано, что внутриклеточные депо Ca²⁺ также участвуют в инициации акросомной реакции. В отсутствие внеклеточного Ca²⁺ в капацитированных мышиных сперматозоидах акросомная реакция активировалась при действии тапсигаргина, который стимулировал освобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо (Herrick et al., 2005).

Использование флуоресцентных красителей, таких как Quin-2 и Fura-2 (Tsien et al., 1982; Halet, 2016), позволяет измерять концентрацию цитоплазматического Ca²⁺, однако эти зонды не дают ответ на вопрос об источнике увеличения Ca²⁺ – поступил ли он цитоплазму клетки из внеклеточной среды или из внутриклеточных депо. Концентрация цитоплазматического Ca²⁺ в сперматозоидах быков составляет от 50 до 200 нМ (Vijayaraghavan, Hoskins, 1989), тогда как константа диссоциации комплекса ХТЦ-Ca²⁺ составляет около 400 мкМ, что делает ХТЦ нечувствительным к низким концентрациям Ca²⁺ и не способным к измерениям Ca²⁺ в цитоплазме клеток (Caswell, Hutchinson, 1971). В то же время способность ХТЦ проникать через мебраны и накапливаться в местах скопления Ca²⁺ в высокой концентрации (внутриклеточные депо Ca²⁺) делает его использование удобным для изучения уровней Ca²⁺ в местах его высокой концентрации (Cerella et al., 2007).

Зависимость процессов капацитации и акросомной реакции от Ca²⁺ широко представлена в литературе, однако точные механизмы, с помощью которых Ca²⁺ мобилизуется в сперме млекопитающих, еще предстоит полностью установить.

Цель настоящего исследования – идентификация путей трансдукции кальция, мобилизованного из интрацитоплазматических депо сперматозоидов быков, в процессах капацитации и акросомной реакции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали сперматозоиды от разных быков, полученные непосредственно перед работой. В каждом опыте использовался эякулят спермы от трех быков голштинской породы. Освобождение спермы от семенной плазмы проводили центрифугированием при 300 g в течение 10 мин в среде TALP, содержащей 100 мМ NaCl, 3.1 мМ KCl, 25 мМ NaHCO₃, 0.3 мМ NaH₂PO₄, 21.6 мМ лактата натрия, 0.5 мМ CaCl₂, 0.4 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата (Sigma, США). Для отмывания спермы к среде TALP добавляли поливинилалкоголь (молекулярной массой 30 000–70 000 Да) (Sigma, США) в концентрации 0.1%. Процедуру отмывания повторяли дважды.

Измерение Ca²⁺ во внутриклеточных депо проводили с помощью флуоресцентного зонда хлортетрациклин (ХТЦ) (Sigma, США), обеспечивающего при проведении представленных экспериментов вход ГТФ и ГДФ в сперматозоиды. В случае использования другого зонда для измерения кальция требовалась бы процедура пермеабилизации для обеспечения входа в клетки ГТФ и ГДФ, в то время как ХТЦ способствовал входу в клетки ГТФ и ГДФ без дополнительных процедур (Денисенко, Кузьмина, 2005). Сперматозоиды инкубировали в присутствии ХТЦ в концентрации 100 мкМ в течение 30 мин при температуре 38.5°С, 95% влажности и 5% СО₂. После окрашивания клетки отмывали с помощью центрифугирования в среде TALP при 300 g в течение 10 мин. Процедуру повторяли три раза. Измерение интенсивности флуоресценции ХТЦ проводили на спектрофлуориметре (Hitachi, Япония) в среде TALP без добавления CaCl₂. Величина длин волн возбуждения и излучения для ХТЦ равнялась 380 и 530 нм, соответственно. Содержание в сперматозоидах кальция внутриклеточных депо измеряли в условных единицах (усл. ед.) интенсивности флуоресценции комплекса Ca²⁺-ХТЦ. Концентрация сперматозоидов при измерении составляла 1.5 × 10⁶ клеток/мл.

С целью активации процессов капацитации сперматозоиды быков инкубировали 4 ч при 38.5°С, 95% влажности и 5% СО₂. Для капацитации использовали среду Sp-TALP, в которую добавляли 6 мг/мл BSA и 0.5 мМ CaCl₂. Активацию акросомной реакции проводили с помощью лизофосфатидилхолина (Sigma, США) в концентрации 100 мкМ, который добавляли к предварительно капацитированным сперматозоидам (Parrish, 2014). Продолжительность акросомной реакции составляла 30 мин в условиях, аналогичных используемым для капацитации.

После прохождения капацитации или акросомной реакции из каждого экспериментального образца брали по 20 мкл суспензии сперматозоидов и 20 мкл раствора ХТЦ, смешивали и инкубировали при 38.5°С в течение 10 мин. Раствор ХТЦ (750 мкМ) готовили в буфере, который содержит 130 мМ NaCl, 5 мМ L-цистеина (Sigma, США) и 20 мМ Трис (рН 7.8) (Sigma, США). Раствор готовили ежедневно и хранили в темноте при 4°С. Затем в эту смесь для фиксации добавляли 10 мкл 25% глутаральдегида (Sigma, США) в 1 мМ Трисе (рН 7.4) до конечной концентрации 0.1%. В данной концентрации глутаральдегид обеспечивает стабильную флуоресценцию в течение 2 ч и не оказывает побочных эффектов на клетки (Ward, Storey, 1984). После этого при комнатной температуре каплю суспензии сперматозоидов (10 мкл) размещают на предметном стекле и смешивают с 10 мкл 0.22 М 1,4-диазобицикло [2.2.2]-октана (Sigma, США), растворенного в глицерол/PBS (9 : 1, v/v), для снижения выцветания флуоресценции. Образцы накрывают покровным стеклом и хранят в темноте при 4°С.

Оценку сперматозоидов проводили с использованием микроскопа ZEISS AxioLab. A1. (Zeiss, Германия) с фазовым контрастом и эпифлуоресцентной оптикой (возбуждение при 400–440 нм и излучение при 470 нм). Каждую из 200 клеток оценивали в соответствии с одним из трех типов флуоресценции ХТЦ (Fraser et al., 1995): равномерная флуоресценция во всей головке (некапацитированные клетки, образец F), свободная от флуоресценции полоса в постакросомальном районе (капацитированные клетки, образец В), и низкая флуоресценция во всей головке, за исключением тонкой яркой полосы флуоресценции в экваториальном сегменте (акросома-реактивные клетки, образец AR).

В работе использовали следующие реактивы: инкубационную среду TALP, ГДФβS, ГТФγS, ГТФ, ГДФ, дбцАМФ, пролактин, хлортетрациклин, ЭГТА (Sigma, США).

Достоверность различия сравниваемых средних значений для 4–5 независимых экспериментов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Обработку данных проводили с помощью пакета статистической программы SigmaStat.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты экспериментов, отражающие воздействие ГДФβS и ГТФγS на стимулированное дбцАМФ и ГДФ освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков представлены на рис. 1. В экспериментах использовали ГДФβS и ГТФγS в концентрациях 100 мкМ. Добавление дбцАМФ в концентрации 100 мкМ или ГДФ в концентрации 50 мкМ оказывало активирующий эффект на выход Са²⁺ из внутриклеточных депо сперматозоидов. Совместное действие дбцАМФ и ГДФ приводило к дополнительному освобождению Са²⁺ из депо. Предварительная инкубация сперматозоидов в присутствии ГДФβS ингибировала освобождение Са²⁺ из депо, стимулированное добавлением ГДФ. Однако, на освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо, активированное действием дбцАМФ, или дополнительный выход Са²⁺ из депо, стимулированный совместным действием дбцАМФ и ГДФ, обработка клеток ГДФβS влияния не оказывала. Внесение в среду инкубации сперматозоидов ГТФγS приводило к ингибированию освобождения Са²⁺ из депо, вызванного добавлением ГДФ. В то же время освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо, стимулированное добавлением одного дбцАМФ, или совместным действием дбцАМФ и ГДФ, по-прежнему отмечалось даже в присутствии ГТФγS.

Рис. 1.

Влияние ГДФβS и ГТФγS на стимулированное дбцАМФ и ГДФ освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков. Концентрации ГДФβS и ГТФγS – 100 мкМ, дбцАМФ – 100 мкМ, ГДФ – 50 мкМ. По вертикали: интенсивность флуоресценции ХТЦ, %. Различия достоверны: P < 0.001 (1 и 2; 2 и 8; 3 и 4; 3 и 5; 3 и 6; 3 и 7; 3 и 8; 5 и 6; 7 и 8), P < 0.01 (1 и 3; 2 и 4; 2 и 6).

На рис. 2 представлены данные о влиянии ГДФβS и ГТФγS на стимулированное пролактином и ГТФ освобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков. Выявлено, что добавление пролактина в концентрации 10 нг/мл или ГТФ в концентрации 10 мкМ активировало в клетках освобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо. При совместном действии пролактина и ГТФ в сперматозоидах отмечали дополнительный выход Ca²⁺ из депо. Инкубация сперматозоидов в присутствии ГДФβS в концентрации 100 мкМ оказывала ингибирующее влияние на освобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо при последующем добавлении ГТФ. В то же время на действие одного пролактина или на совместное действие пролактина и ГТФ предварительная обработка клеток ГДФβS не оказывала воздействия. В присутствии ГДФβS пролактин по-прежнему стимулировал выход Ca²⁺ из депо, а совместное действие пролактина и ГТФ активировало дополнительное освобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо. Предварительная инкубация сперматозоидов в присутствии ГТФγS приводила к ингибированию освобождения Ca²⁺ из внутриклеточных депо, вызванного добавлением ГТФ. Использование для активации клеток одного пролактина, или совместное действие пролактина и ГТФ, стимулировали освобождение Ca²⁺ из депо при действии одного реагента, или дополнительное освобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо при действии двух соединений даже в присутствии ГТФγS.

Рис. 2.

Влияние ГДФβS и ГТФγS на стимулированное пролактином и ГТФ освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков. Концентрации ГДФβS и ГТФγS – 100 мкМ, пролактина – 10 нг/мл, ГТФ – 10 мкМ. По вертикали: интенсивность флуоресценции ХТЦ, %. Различия достоверны: P < 0.001 (1 и 3; 1 и 2; 2 и 4; 3 и 4; 3 и 5; 3 и 7).

При анализе сперматозоидов, ранжированных в соответствии c их функциональным статусом (контрольные, капацитированные и акросома-реактивные клетки, рис. 3) использовали среду TALP с добавлением кальция в концентрации 0.5 мМ. На рис. 4 представлены данные о влиянии дбцАМФ и ГДФ на капацитацию сперматозоидов быков. После 4 ч инкубации в контрольных клетках в сравнении с контролем (0 ч инкубации) обнаружено снижение количества контрольных клеток (образец F) и увеличение числа акросомных клеток (образец AR). Совместное (в течение 4 ч) действие дбцАМФ и ГДФ вызывает значительное увеличение процентного содержания капацитированных клеток (образец B), эффект отсутствовал при воздействии каждого из этих соединений в отдельности.

Рис. 3.

Репрезентативные изображения образцов окрашивания сперматозоидов быков ХТЦ после инкубации в течение 4 ч в среде Sp-TALP и 6 мг/мл BSA: (а) образец F – некапацитированные клетки, (б) – капацитированные клетки, (в) AR – акросома-реактивные клетки; Са²⁺ – внутриклеточные депо кальция. Концентрация ХТЦ – 750 мкМ, для оценки использовали не менее 200 клеток. Длина волн возбуждения 400 нм, эмиссии – 470 нм. Стрелками указана локализация флуоресценции зонда отражающая изменения концентрации Са²⁺. Объектив ×40. Размер масштабной линейки соответствует 7 мкм.

Рис. 4.

Влияние дбцАМФ и ГДФ на капацитацию сперматозоидов быков. Концентрации дбцАМФ и ГДФ составляли 100 и 50 мкМ. По вертикали: доля клеток с разным функциональным статусом, %. Различия достоверны при P < 0.001 (a и d; a и g; a и j; a и m; o и l; o и i; n и k; n и h; n и e).

На рис. 5 представлены данные, отражающие эффекты пролактина и ГТФ на акросомную реакцию сперматозоидов. Инкубация контрольных клеток (4 ч) приводит к снижению количества контрольных клеток (образец F) и росту числа акросомных клеток (образец AR) в сравнении с клетками на 0 ч инкубации. После 4 ч инкубации сперматозоидов в присутствии пролактина и ГТФ отмечали значительное увеличение количества акросомных клеток (образец AR) и снижение числа капацитированных клеток (образец B), в сравнении с действием отдельно каждого из этих соединений.

Рис. 5.

Влияние пролактина и ГТФ на акросомную реакцию сперматозоидов быков. Концентрации пролактина и ГТФ составляли 10 нг/мл и 10 мкМ. По вертикали: доля клеток с разным функциональным статусом, %. Различия достоверны при P < 0.001 (a и d; a и g; a и j; a и m; n и k; n и h), P < 0.01 (o и l; o и i).

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате анализа данных, полученных в экспериментах, обнаружено, что добавление ГТФ или ГДФ к сперматозоидам быков стимулировало освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо. Ранее на клетках N1E-115 нейрональной клеточной линии было показано, что ГДФ стимулирует освобождение Са²⁺ из внутриклеточного депо с задержкой во времени, которая составляла примерно 90 с (Ueda et al., 1986). Фактически самостоятельно ГДФ не стимулирует освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо; ГДФβS, который не фосфорилируется до ГТФβS с помощью нуклеозиддифосфокиназы, не активирует освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо (Gill et al., 1988). Логично предположить, что эффект этого нуклеотида на освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо может быть обусловлен его превращением в ГТФ через катализируемую реакцию фосфорилирования, стимулируемую в присутствии АТФ. Этот процесс превращения ГДФ в ГТФ опосредуется ферментом нуклеозиддифосфокиназа (Ueda et al., 1986). ГДФβS и ГТФγS являются соединениями, которые не подвергаются реакции гидролизации. Отсутствие влияния ГТФγS на освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо и его ингибирующее действие на стимулированное ГТФ освобождение Са²⁺ из депо свидетельствуют о том, что для активации освобождения Са²⁺ необходим гидролиз ГТФ.

Таким образом, в сперматозоидах быков добавленные отдельно ГТФ и ГДФ стимулируют выход Са²⁺ из внутриклеточных депо, причем для реализации воздействия ГТФ необходим его гидролиз, в то время как эффект ГДФ предположительно связан с переходом его в ГТФ и последующим гидролизом.

Если добавленные отдельно ГТФ или ГДФ не стимулируют освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо в присутствии ГДФβS или ГТФγS, то при совместном действии пролактина и ГТФ, а также дбцАМФ и ГДФ в сперматозоидах быков по-прежнему отмечается дополнительное освобождение Са²⁺ из депо в присутствии ГДФβS и ГТФγS. Это позволяет предположить, что механизм действия на освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо при воздействии одного ГТФ или ГДФ, и при участии этих нуклеотидов в совместном действии в присутствии пролактина или дбцАМФ, различен.

В большинстве клеток млекопитающих показано наличие двух типов внутриклеточных депо кальция – инозитолтрифосфат- и рианодин-чувствительных внутриклеточных депо (Berridge, 2002). Согласно гипотезе, выдвинутой Mullaney et al. и Ghosh с соавторами, ГТФ способствует образованию связи между различными внутриклеточными депо кальция (IP₃-чувствительными и IP₃-нечувствительными) и обеспечивает переход Са²⁺ из IP₃-нечувствительных в IP₃-чувствительные внутриклеточные депо. Совместное действие IP₃ и ГТФ способствует дополнительному освобождению Са²⁺ из внутриклеточных депо (Mullaney et al., 1987; Ghosh et al., 1989). В сперматозоидах млекопитающих присутствуют не менее двух различных органелл для хранения кальция, расположенных в акросомной части и области шейки (Costello et al., 2009). Для образования связи между различными внутриклеточными депо кальция необходимо, чтобы взаимодействующие соединения активировали освобождение Са²⁺ из различных внутриклеточных депо и одним из соединений должны быть ГТФ или ГДФ. Ранее на сперматозоидах быков нами было показано, что пролактин и ГДФ стимулируют выход Са²⁺ из IP₃-чувствительных депо, а дбцАМФ (теофиллин) и ГТФ – из рианодин-чувствительных внутриклеточных депо кальция (Денисенко и др., 2015). Так как в сперматозоидах быков при совместном действии пролактина и ГТФ, а также дбцАМФ и ГДФ, присутствует дополнительное освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо, можно предположить, что в данном случае действие ГТФ и ГДФ направлено на образование связи и обеспечение перехода Са²⁺ между различными внутриклеточными депо.

Таким образом, из анализа результатов, полученных в наших экспериментах, следует, что, действуя отдельно, ГТФ или ГДФ стимулируют выход Са²⁺ из внутриклеточных депо, при совместном действии пролактина и ГТФ, а также дбцАМФ и ГДФ действие нуклеотидов, вероятно, направлено на образование связи и перемещение Са²⁺ между различными внутриклеточными депо.

После завершения капацитации сперматозоиды приобретают способность подвергаться акросомной реакции, при которой происходит экзоцитоз акросомных пузырьков. Связывание сперматозоида с одним из гликопротеинов зоны пеллюцида ооцита стимулировало вход Са²⁺ и акросомную реакцию в сперматозоидах млекопитающих (Abou-Haila et al., 2014). Cперматозоиды человека обладают внутриклеточными депо Са²⁺ и освобождение Са²⁺ из этих депо, стимулированное тапсигаргином, активирует вход Са²⁺ из внешней среды, который регулирует важные биологические процессы, являющиеся фундаментальными для акросомной реакции (Sosa et al., 2016; Engel et al., 2018). В сперматозоидах быков увеличение количества клеток на стадии акросомной реакции происходило при одновременном использовании для активации сперматозоидов пролактина и ГТФ. В этом случае действие ГТФ направлено на образование связи и обеспечение перехода Са²⁺ между различными (IP₃- и рианодинчувствительными) внутриклеточными депо.

В процессах капацитации участвует как внутриклеточный, так и внеклеточный кальций. Инкубация сперматозоидов свиней в бескальциевой среде приводила к ингибированию капацитации, что свидетельствует о необходимости внеклеточного Са²⁺ для активации процессов капацитации (Martinez-Abad et al., 2017). Также было обнаружено увеличение концентрации внутриклеточного кальция во время прохождения этого процесса (Lopez-Torres et al., 2017). В сперматозоидах быков рост числа клеток на стадии капацитации наблюдали в случае совместного использования дбцАМФ и ГДФ. Вероятно, в данном случае действие ГДФ, также как и ГТФ, направлено на образование связи между различными внутриклеточными депо кальция.

На основании результатов экспериментов предлагается гипотеза, согласно которой капацитация и акросомная реакция в сперматозоидах быков происходит вследствие перемещения Са²⁺ между различными внутриклеточными депо при воздействии дбцАМФ, пролактина, ГТФ и ГДФ, причем стимулированное совместным действием дбцАМФ и ГДФ перемещение кальция приводит к увеличению количества капацитированных клеток, тогда как рост числа сперматозоидов на стадии акросомной реакции отмечали при воздействии на мужские гаметы пролактина и ГТФ.