Онтогенез, 2021, T. 52, № 4, стр. 254-259

Поводом к написанию данного обзора послужила для нас необходимость сохранения стволовых клеток (СК) после криохранения кератиноцитов в суспензии. Это важно, в частности, когда речь идет о применении клеток в составе биомедицинских клеточных продуктов для регенеративной медицины. Криохранение культур кератиноцитов дает возможность планирования хирургических вмешательств, накопления материала для последующих операций, проведения контроля качества, транспортировки полученных тканевых эквивалентов (Jackson et al., 2014). Данных о применении культивированных кератиноцитов человека, замороженных в суспензии, мало, но при этом показано, что жизнеспособность клеток после заморозки в суспензии и в монослое примерно одинакова при существенно более высокой сложности процедуры хранения в монослое (Pasch et al., 2000). Кроме того, доказано, что некоторые протоколы криохранения стимулируют пролиферативный потенциал клеток. Предположительно, это связано с селекцией наиболее устойчивых и быстро пролиферирующих кератиноцитов (Naaldijk et al., 2016). Сохранение недифференцированного фенотипа культивированных кератиноцитов кожи и роговицы после криоконсервации играет немаловажную роль для позитивного эффекта трансплантации у ожоговых пациентов (De Luca et al., 2006; Jackson et al., 2017). Так, высокий процент низкодифференцировнных кератиноцитов в составе трансплантата при лечении пациентов с лимбальноклеточной недостаточностью ожоговой этиологии приводит к значимому улучшению клинических результатов (Rama et al., 2010). Одновременное сохранение недифференцированного фенотипа и высокого пролиферативного потенциала в культуре кератиноцитов необходимо для формирования многослойного пласта кератиноцитов, в котором достигнут баланс между пролиферацией и дифференцировкой (Metral et al., 2017). Хранение кератиноцитов также необходимо в работе клеточных банков и коллекций клеточных культур. Поскольку популяция первичных кератиноцитов гетерогенна и содержит клетки разного уровня дифференцировки, в том числе эпидермальные стволовые, для успешной рекультивации после разморозки и ведения культуры критическим является сохранения пула стволовых и прогениторных клеток.

Хранение кератиноцитов в суспензии зачастую представляет собой проблему, поскольку жизнеспособность и степень дифференцировки этих клеток строго зависят от наличия контактов с субстратом. Таким образом, обычные для других клеток потери, вызванные повреждающим действием криохранения, усугубляются индукцией дифференцировочных процессов, которые в случае кератиноцитов означают выход из клеточного цикла и последующую гибель. Существует ряд концепций эффективного криохранения (Woelders, 2004; Muller, 2004; Meryman, 2007; Rao, 2012; Averill-Bates, 2014), однако очевидно, что для кератиноцитов одним из основных условий успешного выхода после заморозки является быстрое восстановление межклеточных и клеточно-матриксных контактов.

В нашей работе мы сталкиваемся с тем, что клетки, вышедшие живыми после криохранения в суспензии (окраска трипановым синим), оказываются неспособны прикрепиться к матриксу или открепляются от него в течение первых трех суток. Обращает на себя внимание тот факт, что количество прикрепившихся клеток зависит от состава внеклеточного матрикса (ВКМ) и от плотности посева кератиноцитов (неопубликованные данные). При этом не все клетки гибнут – продолжит кератиноцит пролиферировать или перейдет к дифференцировке либо апоптозу, как известно, напрямую зависит от количества β1-интегрина на его мембране (Tiberio et al., 2002). Так как сигналинг от интегринов является ключевым условием выживания клетки (Pozzi et al., 1998), мы рассмотрим здесь β1-интегрин как узловой элемент, который через взаимодействие с различными лигандами создает систему, необходимую для сохранения пролиферативной активности клеток и интегрирует пути апоптоза и дифференцировки кератиноцитов. В данном случае важно понять, как можно минимизировать массивные потери кератиноцитов и, в первую очередь, СК после криохранения кератиноцитов в суспензии. Мы рассмотрим различные варианты воздействия на молекулу β1-интегрина, чтобы определить, насколько разными могут быть механизмы и последствия такого воздействия, и какие воздействия можно оказывать для сохранения жизнеспособности кератиноцитов после травмы криохранения.

Роль межклеточных и клеточно-матриксных контактов в поддержании пролиферации и сохранении СК давно изучается. Ключевую роль в процессе дифференцировки кератиноцитов играет ERK-MAPK сигнальный путь (Zhu et al., 1999; Levy et al., 2000; Haase et al., 2001; Evans et al., 2003). Доказано, что система β1-интегрин–MAPK in vitro участвует в поддержании СК эпидермиса в недифференцированном состоянии. При нарушении сигналинга от интегринов, в частности от β1, этот баланс может быть нарушен. Так, трансфекция культуры человеческих кератиноцитов мутантным β1-интегрином (доминантная негативная мутация), уменьшая экспрессию β1 на поверхности клеток, приводит к снижению клеточной адгезии и супрессии MAPK пути, что является стимулом к дифференцировке СК (Zhu et al., 1999).

Кроме того, доказано, что процесс пролиферации и дифференцировки напрямую зависит от взаимодействия β1-интегрина с рецепторами к факторам роста. Известно, что один из основных путей влияния интегринов на рецепторы к факторам роста – процесс транзактивации. Рецепторы к эпидермальному фактору роста (EGFR), тромбоцитарному фактору роста (PDGFR), фактору роста эндотелия сосудов (VEGFR) и др. активируются в результате связывания интегринов с молекулами ВКМ (Moro et al., 1998; Soldi et al., 1999; Danilkovitch-Miagkova et al., 2000; Miranti et al., 2002). Обратное тоже справедливо, и рецепторы к факторам роста способны к транзактивации интегринов (Bagutti et al., 1996; Grassian et al., 2011). Активация EGFR, например, приводит к повышению экспрессии β1 и наоборот (Wang et al., 1998). В работе Багутти (Bagutti et al., 2001) авторы исследовали роль различных факторов в процессе дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши в эпидермальном направлении. Они показали, во-первых, что ни контакт с базальной мембраной, ни межклеточные взаимодействия с эпидермальными кератиноцитами так не стимулировали ЭСК к дифференцировке, как сокультивирование их с фибробластами, синтезирующими в среду факторы роста. Кроме того, они обнаружили, что ЭСК, полученные путем трансфекции вектором, блокирующим ген β1-интегрина, обладали меньшей чувствительностью к факторам роста фибробластов (aFGF, bFGF), фактору роста кератиноцитов (KGF), трансформирующему фактору роста (TGFα), чем ЭСК дикого типа, и нуждались в их более высокой концентрации в культуральной среде для начала дифференцировки.

Таким образом, сигнал от интегрина β1, связанного с ВКМ, а кроме того с рецепторами к факторам роста, необходим для сохранения баланса между пролиферацией и дифференцировкой. При этом отсутствие сигнала от β1-интегрина, связанного с матриксом, приводит к бесконтрольной пролиферации, что и наблюдается в ряде злокачественных опухолей, которые даже при потере контакта с белками матрикса продолжают пролиферировать (Hanahan et al., 2000; Reginato et al., 2003).

Одна из ключевых проблем криохранения кератиноцитов – перевод их в суспензию. Давно известно, что переход нормальных кератиноцитов в суспензию сопровождается началом их дифференцировки (Watt et al., 1993). Показано, что кератиноциты в суспензии начинают активно синтезировать маркер терминальной дифференцировки лорикрин, и через 24 ч уже 100% клеток лорикрин-позитивны. Дифференцировки можно избежать, если клетки в суспензии начнут формировать связи между β1-интегрином и растворимым фибронектином, добавленным в культуральную среду. Таким образом, удержание в недифференцированном состоянии напрямую зависит от наличия сигнала от β1-интегрина, связанного с фибронектином. Кроме этого, показано, что ламинин V и коллаген IV также образуют связи с β1‑интегрином, но в отсутствие фибронектина не способны останавливать процесс дифференцировки (Watt et al., 1993).

Кроме того, перевод кератиноцитов в суспензию может сопровождаться также и аноикисом – апоптозом, вызванным откреплением клеток от матрикса. Данный механизм описан в работе Реджинато (Reginato et al., 2003), авторы которой установили, что сигнал от интегрина, связанного с белками матрикса, влияет на сохранение экспрессии EGFR (рецептор одного из основных митогенов) кератиноцитов, находящихся в суспензии. Было показано, что присутствие в суспензии молекул ВКМ (Matrigel) сохраняет экспрессию EGFR на определенном уровне, при этом блокирование β1-интегрина моноклональными антителами приводит к снижению уровня экспрессии EGFR (Reginato et al., 2003) точно так же, как открепление кератиноцитов от ВКМ (Grassian et al., 2011), причем сигналом к дифференцировке является не соотношение связанных и несвязанных молекул β1, а абсолютное число связанных с ВКМ молекул β1-интегринов (здесь имеет место дозозависимый эффект взаимодействия β1-интегрина с белками матрикса). От уровня экспрессии EGFR напрямую зависит синтез проапоптотического белка Bim. В норме EGF подавляет экспрессию Bim, а значит и процесс апоптоза. Однако в процессе аноикиса, несмотря на присутствие в среде молекул EGF, авторы видели неуклонный рост экспрессии Bim. Как выяснилось, к 24 ч нахождения кератиноцитов в суспензии значительно снижалась экспрессия EGFR, соответственно сигнал от EGFR, связанного с EGF, не блокировал синтез Bim. Кроме того, повышение экспрессии Bim напрямую зависело от нарушения связи интегрина β1 с матриксом: при добавлении антител, блокирующих β1-интегрин, наблюдалось повышение экспрессии Bim в кератиноцитах, находившихся в суспензии, даже в присутствии молекул ВКМ в среде (Reginato et al., 2003). Здесь, по-видимому, происходило конкурентное ингибирование между антителами и фибронектином за молекулу β1-интегрина.

Что касается криохранения кератиноцитов в суспензии, оно приводит к увеличению доли клеток в состоянии апоптоза (Borderie et al., 1998; Xiao, 2003; Heng, 2006), то есть усугубляет процессы, которые запускаются в кератиноцитах при переводе их в суспензию.

В работе Тиберио (Tiberio et al., 2002) показано влияние концентрации β1-интегрина кератиноцитов на вероятность включения в них механизма апоптоза. Авторы данной работы анализировали три группы кератиноцитов, отличавшиеся скоростью адгезии к коллагену IV типа. Исследование гибели клеток, проведенное методом TUNEL в этих трех группах, показало, что в первой группе, содержащей высокий процент β1-интегрин-позитивных клеток, апоптоза практически не было. Авторы сделали вывод, что СК защищены от аноикиса благодаря, в первую очередь, их высокой адгезивности. Кроме того, было показано, что лиганд – связывающая способность α5β1-интегрина (основной рецептор к фибронектину) снижается после перевода кератиноцитов в суспензию и к 24 ч β1-интегрин полностью исчезает с поверхности кератиноцита, коммитированного к дифференцировке (Adams, 1990; Watt, 1993). Добавление антител к β1-интегрину, предотвращающих его связывание с фибронектином, но не активирующих его, в первой и второй группах (СК – экспрессировали максимальный уровень β1-интегрина – и ранние прогениторы) приводило к значительному усилению апоптоза в этих клетках (Tiberio, 2002). Таким образом, СК могут быть наиболее эффективной мишенью для снижения степени дифференцировки через β1-интегрин сигналинг.

От чего же зависит судьба кератиноцита, находящегося в суспензии? И какие процессы – апоптоза или дифференцировки – доминируют в кератиноцитах при переводе их в суспензию?

Анализом процессов апоптоза и дифференцировки кератиноцитов в суспензии исследователи занимаются давно (Terskikh, Vasil’ev, 2005). Ранее считалось, что они протекают по различным механизмам и могут не зависеть один от другого (Mitra et al., 1997). Позднее представления о взаимосвязи апоптоза и терминальной дифференцировки в суспензии эволюционировали.

Как уже сказано выше, сигналом к дифференцировке кератиноцитов в суспензии является потеря контакта β1-интегрина с ВКМ. В течение первых 4 часов кератиноциты необратимо выходят из клеточного цикла, в то время как лорикрин в клетках начинает появляться не раньше, чем через 10 часов нахождения в суспензии. Хорошо известно, что терминальную дифференцировку частично можно ингибировать антителами к β1-интегрину (Adams et al., 1989; Watt et al., 1993), однако важно понимать, что не все антитела к β1-интегрину обладают способностью блокировать дифференцировку. В работе Ватт (Watt et al., 1993) исследователи экспериментировали с разными типами антител к β1-интегрину (они использовали две группы моноклональных антител: блокирующих и не блокирующих связь β1-интегрина с белками ВКМ (фибронектином, ламинином и коллагеном IV)) и обнаружили, что только антитела из первой группы к субъединице β1 способны остановить дифференцировку в суспензии. Кроме этого, антитела из первой группы к гетеродимерам α3β1 и α5β1 также были способны существенно блокировать дифференцировку. Таким же эффектом обладали антитела первой группы к субъединицам α3, α2, α5, применяемые в комплексе с антителами к β1. Это подтвердилось тем, что коллаген IV и ламинин (лиганды к α3β1 и α5β1) блокировали дифференцировку лишь в комплексе с фибронектином (Darribère et al., 1990; Watt et al., 1991). Эффективность антител первой группы была дозозависимой: лишь взятые в концентрации 250 мкг/мл они блокировали дифференцировку с эффективностью, близкой к фибронектину (Watt et al., 1993), что может указывать на чувствительность дифференцировки к количеству активированных субъединиц β1. Однако стоит отметить, что даже сам фибронектин не был способен полностью блокировать дифференцировку в кератиноцитах, переведенных в суспензию. Авторы объясняют это тем, что связываясь с молекулой интегрина на поверхности клетки, фибронектин в то же время не предотвращает ингибирование внутриклеточного транспорта предшественников интегрина β1, а также не снимает блок гликозилирования β1-интегрина. Кроме того, добавление фибронектина не предотвращает снижение экспрессии белков, участвующих в формировании фокальных контактов наряду с интегринами (β-актин, филамин, α-актинин), при переводе кератиноцитов в суспензию. Антитела из второй группы не блокировали процесс дифференцировки, даже взятые в высокой концентрации.

Именно разрыв связи β1-интегрина с фибронектином стимулирует запуск в кератиноцитах процессов терминальной дифференцировки (Levy et al., 2000; Watt et al., 2002) и апоптоза (Stupack et al., 2001). В работе Джейнс (Janes et al., 2009) авторы показали, что включение этих процессов происходит в кератиноцитах практически одновременно и сопровождается активацией сигнального пути дифференцировки PI3K/Akt и апоптотического пути Caspase-8. Как известно, киназа PI3K может быть активирована белками Ras (Erk/MAPK-путь) и посредством других сигнальных путей (VEGFR, цитокины, инсулин). При помощи трансфекции кератиноцитов ретровирусным вектором, авторы вводили активируемый тамоксифеном (4-OHT) ген Akt (myrAktER) и показали, что in vitro PI3K/Akt-путь включается при переходе кератиноцитов из стволового компартмента в супрабазальные слои. Это было подтверждено с использованием двойной окраски антителами к Akt и β1-интегрину in vivo. Авторы обнаружили активацию PI3K/Akt пути в супрабазальных слоях эпидермиса, в то время как клетки базального слоя, активно экспрессировавшие β1-интегрин, были отрицательны по Akt. На основании этих экспериментов сделан вывод о том, что включение PI3K пути происходит на начальных стадиях дифференцировки (в зернистом и роговом слоях клетки были Akt негативны). Применение ингибиторов PI3K (LY294002) приводило к остановке терминальной дифференцировки в суспензии. Кроме того, процесс активации каспаз возможно было остановить при формировании связи β1‑интегрин-фибронектин и внесении ингибитора PI3K, что говорит о том, что PI3K/Akt осуществляет регуляцию каспазного пути. Между сигнальными путями PI3K/Akt и Caspase-8 существует обратная связь: активация казпаз приводит к снижению фосфорилирования Akt. Чтобы проанализировать вклад каспазного пути в стимуляцию кератиноцитов к дифференцировке в суспензии, авторы использовали ингибитор к широкому спектру каспаз z-VAD-fmk, а также специфические ингибиторы двух основных путей апоптоза – Caspase-8 и Caspase-9-зависимых. Выяснилось, что терминальная дифференцировка блокируется во всех трех случаях, но ингибитор Caspase-8 (z-IETD-fmk) так же эффективен, как z-VAD-fmk, в то время как ингибитор Caspase-9 (z-LEHD-fmk) блокирует дифференцировку только частично (Janes et al., 2009).

Переводя кератиноциты в суспензию и подвергая их травме криохранения, мы неизбежно нарушаем механизмы сигналинга, ответственные за сохранение жизнеспособности и степени дифференцировки этих клеток. Находясь в суспензии, кератиноциты стремительно теряют способность к адгезии, поскольку экспрессия интегринов, в частности β1-интегрина, постоянно снижается. Задача – приостановить процесс необратимого выхода кератиноцитов из клеточного цикла и сохранить максимальное количество β1-интегрин-позитивных клеток в культуре. Мы предполагаем, что замедляя процессы терминальной дифференцировки разными путями – добавляя растворимый фибронектин, а также ингибиторы к PI3-kinase и Caspase-8, в среду для разморозки – возможно минимизировать массивные потери кератиноцитов и, в первую очередь, стволовых клеток после криохранения кератиноцитов в суспензии.