Онтогенез, 2021, T. 52, № 4, стр. 260-286

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РПЭ – ретинальный пигментный эпителий

НС – нейральная сетчатка

ТФ – транскрипционный фактор

ЭМП – эпителиально-мезенхимный переход

ЭМ – эпиретинальная мембрана

ПВР – пролиферативная витреоретинопатия

ВКМ – внеклеточный матрикс

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ВВЕДЕНИЕ

В нормальных, не патологических для тканей организма условиях, клетки взрослых позвоночных сохраняют стабильность дифференцировки. Изменение клеточной идентичности означало бы невозможность для ткани сохранять свою целостность и должным образом функционировать в составе организма. Стабильность дифференцировки достигается посредством эпигенетической регуляции в совокупности с экспрессией транскрипционных факторов (ТФ). И то, и другое, в свою очередь, диктуется клеточным микроокружением и общеорганизменными регуляторными факторами (Holliday, 2006; Григорян, 2018; Basinski et al., 2021). Противоположными состоянию стабильности являются де- и трансдифференцировка клеток, широко исследуемые со времени открытия Дж. Гордоном (Gurdon, 1962) превращения дифференцированных зрелых клеток кишечного эпителия головастиков в клетки со свойствами оплодотворенных ооцитов при трансплантации ядер. Пристальный интерес к изменениям клеточной идентичности у позвоночных в течение полувека привел к накоплению данных, свидетельствующих о том, что подобное происходит в направленных лабораторных экспериментах, при патологии и болезнях, а также при регенерации (см. обзоры: Jopling et al., 2011; Merell, Stanger, 2016). У взрослых рыб и амфибий процессы клеточных де- и трансдифференцировки лежат в основе регенерации утраченных или поврежденных тканей и органов (Alvarado, Tsonis, 2006; Jobling et al., 2010).

Ярчайшими, ставшими классическими, примерами регенерации посредством трансдифференцировки является восстановление сетчатки и хрусталика из клеток пигментированных эпителиев глаза Urodela (Okada, 1980, 1991; Eguchi, 1986). Эти модели на протяжении многих лет многосторонне исследовались. Основными этапами были: изучение клеточного поведения, морфологии клеток, динамики пролиферации, изменений общих и специфических синтезов, изменений микроокружения и молекул надклеточной и внутриклеточной регуляции процесса, и наконец, исследования молекулярно-генетического паттерна экспрессии генов. Причиной столь масштабных исследований было стремление максимально раскрыть внутри- и внеклеточные механизмы, лежащие в основе тканевой и органной регенерации у позвоночных животных. Понимание трансдифференцировки на клеточном и молекулярном уровнях приближало разработку способов лечения заболеваний, при которых конверсия клеточного типа играет ключевую роль, а также формировало основу для биотехнологического воспроизводства условий, стимулирующих регенерацию тканей глаза у млекопитающих и человека.

В лабораториях ИБР РАН, благодаря профессорам О.Г. Строевой и В.И. Миташову, создавшим и обогатившим направление исследований развития и регенерации тканей глаза в норме и патологии, особое внимание уделялось модели регенерации сетчатки за счет клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) у Urodela (Stroeva, Mitashov, 1983; Mitashov, 1996, 1997). Параллельно в мире изучался вопрос пролиферативных заболеваний и эпителиально-мезенхимного перехода (ЭМП) клеток РПЭ сетчатки глаза млекопитающих и человека. В частности, изучались молекулярные механизмы процессов пролиферации и конверсии клеток РПЭ в мезенхимном направлении, приводящие к развитию пролиферативной витреоретинопатии (ПВР, PVR) (Morescalchi et al., 2013; Idrees et al., 2019; Zou et al., 2020), а также таких заболеваний как пролиферативная диабетическая ретинопатия (Abu El-Rasral, 2013) и субретинальный фиброз (Lopez et al., 1996).

В статье обобщен ряд ключевых, полученных ранее, и современных сведений, раскрывающих явление трансдифференцировки на примере конверсии клеток РПЭ глаза у амфибий и млекопитающих. Две различающиеся стратегии изменений дифференцировки РПЭ – в нейральном направлении у амфибий и мезенхимном у млекопитающих – находятся под многоуровневым регуляторным контролем, коротко освещенном в данном обзоре. Обсуждаются вопросы времени и условий выбора клетками РПЭ разных молекулярных стратегий для конверсии в разных направлениях. Внимание уделено вопросу генетического и эпигенетического состояний клеток РПЭ на ключевом этапе трансдифференцировки – при входе клеток в пролиферативный цикл и фазу репрограммирования генома.

РЕТИНАЛЬНЫЙ ПИГМЕНТНЫЙ ЭПИТЕЛИЙ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

РПЭ взрослых позвоночных является высокоспециализированной тканью – эпителиальным монослоем пигментированных, поляризованных клеток, с характерными и общими для всех изученных позвоночных чертами. РПЭ расположен между нейральной сетчаткой (НС) и ее васкулярным слоем, снабжающим НС необходимыми веществами и кислородом (Панова, 1993; Strauss, 2005; Fuhrmann, 2014) (рис. 1a). Помимо переноса веществ по базально-апикальному градиенту клеток, РПЭ выполняет ряд важных функций, производя факторы и сигнальные молекулы, поддерживающие гомеостаз и нормальное функционирование сетчатки (Strauss, 2005; Sparrow et al., 2010). При этом основной функцией РПЭ является фагоцитоз слущивающихся наружных сегментов фоторецепторов НС, а затем их переваривание с помощью лизосом. Это позволяет фоторецепторам синтезировать новые отростки для световосприятия, обеспечивает жизнеспособность клеток и метаболизм ретиноидов. До сих пор, несмотря на определенную гетерогенность клеточной популяции РПЭ, нет сведений о наличии в нативном его слое in situ стволовых или прогениторных клеток (Burke et al., 1996; Burke, Hjelmeland, 2005; Strauss, 2005).

Рис. 1.

Схематическое изображение ретинального пигментного эпителия во взаимодействии с окружающими тканями задней стенки глаза позвоночных животных. (a) – нормальный глаз. ФР – фоторецепторы, РПЭ – ретинальный пигментный эпителий; МБ – мембрана Бруха; ХО – хороидальная оболочка: СО – склеральная оболочка. (б) – разобщение ретинального пигментного эпителия с фоторецепторными клетками сетчатки (справа) по сравнению с нормальным состоянием (слева). С – колбочки (cones); R – палочки (rods).

ДЕ- И ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК РПЭ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ИДЕНТИЧНОСТИ

Термин дедифференцировка предполагает возврат дифференцированной клетки в состояние с бóльшим потенциалом развития, близким таковому у стволовых и прогениторных клеток. Наиболее ярким примером является получение индуцированных плюрипотентных клеток (ИПСК) из культивируемых эмбриональных и зрелых фибро-бластов мыши in vitro посредством создания условий для сверхэкспрессии в них ряда ТФ: Oct4, Sox2, Klf4 и c-myc (OSKM) (Takahashi, Yamanaka, 2006). Среди других, менее известных примеров, выявлен ТФ MyoD, экспрессия которого после трансфекции гена, способствует превращению клеток РПЭ, а также фибробластов и хондроцитов в мышечные клетки in vitro (Davis et al., 1987; Tapscott et al., 1987; Weintraub et al., 1989; Tapscott, Weintraub, 1991). In vivo явление дедифференцировки показано для различных тканей амфибий, а также высших позвоночных после повреждения и в условиях патологии (Szibor et al., 2014; Yao, Wang, 2020).

“Трансдифференцировка” – термин, вошедший в научный обиход в 60–70-х годах прошлого столетия (Weissenfels, Hundgen, 1968; Okada, 1975; Eguchi, 1979). Исходно он отражал превращение полностью дифференцированного клеточного типа в иной, также дифференцированный тип, минуя промежуточный этап – дедифференцировку (Mills et al., 2019). Позже термин “трансдифференцировка” утвердился как подразумевающий по умолчанию наличие промежуточного состояния, необходимого для потери клетками исходных фенотипических черт, пролиферации и возникновения черт другого клеточного типа (Okada, 1980). Трансдифференцировка является глубокой реорганизацией клетки на всех уровнях – от транскрипционного до морфогенетического (при формировании de novo ткани из претерпевших конверсию клеток). В этой связи внеклеточные сигналы, регулирующие процесс трансдифференцировки, должны работать координировано, носить четкий пространственно-временной характер. Многие из регулирующих факторов известны (см. ниже), однако, картина их динамической сети in vivo еще далека до полной. В настоящее время предполагается, что работа ТФ и регулируемый эпигенетический ландшафт, способные активировать или подавлять ту или иную программу экспрессии генов, лежат в центре событий трансдифференцировки (Powell, 2013; Merell, Stanger, 2018; Grigoryan, 2020; Vanden Bosch, Reh, 2020).

Таким образом, при трансдифференцировке имеет место смена “клеточной идентичности” (“cell identity”), определяемой в разное время с разной степенью точности. Традиционно специфические клеточные типы определяли, используя морфологические критерии. Позже выяснилось, что этого недостаточно: невидимая морфологически, но присутствующая на других уровнях изучения гетерогенность, как исходной ткани, так и формирующейся в ходе трансдифференцировки, требовала уточнений. В нативном РПЭ выявлены региональные отличия в экспрессии структурных молекул (Schmidt, Peisch, 1986; Burke et al., 1996; Burke, Hjelmeland, 2005; Durairaj et al., 2012) и в способности к пролиферации в слое (Строева, 1971; Al-Hussaini et al., 2008; Григорян, 2015). При ЭМП клетки РПЭ млекопитающих тоже имеют отличия по степени проявления мезенхимного фенотипа как in vitro, так и в ходе ПВР и других пролиферативных заболеваний сетчатки (Chtcheglova et al., 2020). Важным этапом стало применение иммунохимических и молекулярных методов, способных выявить локализацию и уровень экспрессии генов, отвечающих за синтез структурных белков, ТФ и сигнальных молекул. В последнее время стало возможным изучение геномов и транскриптомов представителей Urodela-объектов исследования трансдифференцировки (Bruckskotten et al., 2012; Nakamura et al., 2014; Nowoshilow et al., 2018; Biscotti et al., 2020); получило развитие изучение эпигенома клеток глаза позвоночных (Aldiri et al., 2017; Corso-Diaz et al., 2018; Dvorianchikova et al., 2019). Арсенал современных подходов и методов отсутствовал на этапе морфологических исследований трансдифференцировки, однако, именно тогда О.Г. Строевой и В.И. Миташовым в основу направления работы было заложено представление о “переключении работы генов”, как основополагающем событии конверсии клеточного типа (Строева, Миташов, 1970; Stroeva, Mitashov, 1981). Это позволило со временем вывести решение проблемы трансдифференцировки на уровень изучения ее молекулярных механизмов и регуляции in vivo.

ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК РПЭ У ВЗРОСЛЫХ АМФИБИЙ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VIVO

РПЭ хвостатых амфибий (Urodela) обладает способностью к регенерации сетчатки и дает яркий пример естественной конверсии в ретинальные клетки in vivo. После повреждений глаза (отслойки сетчатки, ее удаления, перерезки зрительного нерва) РПЭ становится источником воспроизводства новой сетчатки (Stone, 1950; Hasegawa, 1958; Keefe, 1973; Stroeva, Mitashov, 1983; Mitashov, 1996, 1997; Chiba, Mitashov, 2007; Yasumuro et al., 2017) (рис. 2а). Основными событиями процесса трансдифференцировки являются: выход клеток из слоя РПЭ, потеря исходных черт и свойств (дедифференцировка), амплификация, формирование промежуточной популяции пролиферирующих нейробластов, выход их из цикла репродукции и дифференцировка ретинальных клеточных типов. Потенции клеток РПЭ в качестве клеток-источников для восстановления сетчатки обнаружены и у взрослых бесхвостых амфибий, лягушек X. laevis (Свистунов, Миташов, 1983). Позже показано, что при сохранении ограничивающей внутренний край сетчатки васкулярной мембраны в ходе удаления исходной сетчатки, клетки РПЭ покидают слой, мигрируют, осев на мембране пролиферируют и формируют регенерат так же, как это происходит у Urodela (Yoshii et al., 2007; Araki et al., 2007).

Рис. 2.

Последовательные стадии регенерации сетчатки у амфибий (а) и развития пролиферативной ретинопатии у млекопитающих (б). НС – нейральная сетчатка; РПЭ – ретинальный пигментный эпителий; КлРПЭ – трансдифференцирующиеся клетки РПЭ; РС – регенерат сетчатки; ЭМП – эпителиомезенхимный переход; ЭМ – эпиретинальная мембрана.

У человека, как и у амфибий, в ответ на повреждение сетчатки клетки РПЭ теряют свои эпителиальные характеристики, вымещаются из слоя, мигрируют и пролиферируют, трансдифференцируясь при этом в мезенхимные клетки, подобные миофибробластам; при движении за пределы сетчатки они избегают клеточной гибели и синтезируют компоненты ВКМ, участвуя в формировании эпиретинальной мембраны (ЭМ) (рис. 2б) (Kirchhof, Sorgente, 1989; Abe et al., 1998; Tamiya et al., 2010; Wu et al., 2018). Образование ЭМ в ответ на повреждение НС (чаще разрыв и отслойку) приводит к сокращению ЭМ вместе с НС, что вызывает снижение зрения. Описаны этапы процесса и их регуляция (Garweg et al., 2013; Tamiya, Kaplan, 2016; Zou et al., 2020). ЭМП клеток РПЭ млекопитающих может иметь место не только при патологиях (заболеваниях) глаза, но и в процессе восстановления слоя, например, после воздействия лазером (Han et al., 2015). Превращения клеток РПЭ млекопитающих in vivo при ЭМП подпадает под определение “трансдифференцировка”, хотя встречаются и другие определения, например, “дисфункция РПЭ” (Zhou et al., 2020).

Большая информация, свидетельствующая о возможности трансдифференцировки клеток РПЭ млекопитающих и человека накоплена в результате экспериментов in vitro. Исследования свидетельствуют о проявлении клетками РПЭ свойств мультипотентных. РПЭ взрослых грызунов (Engelgardt et al., 2005) и человека (Милюшина и др., 2009; Milyushina et al., 2011, 2012; Li et al., 2019) в условиях in vitro в присутствии морфогенов и факторов роста демонстрирует пролиферацию, дедифференцировку и в некоторых случаях продукцию нейронов. На стадии дедифференцировки клетки РПЭ человека приобретают черты нейроэпителиальных клеток, экспрессируют гены OCT4, NANOG, KLF4, OTX2, PAX6 и NESTIN (Милюшина и др., 2009, 2011, 2012; Кузнецова и др., 2014). В работе Салеро и др. (Salero et al., 2012) показано, что клетки РПЭ человека in vitro способны не только к воспроизводству своего фенотипа и производству нейронов, но и клеток c признаками мезенхимных (адипо-, остео- и хондрогенной) дифференцировок. На линии клеток РПЭ человека ARPE-19 показано, что сигнальный путь Wnt является одним из регуляторов ЭМП (Chen et al., 2012). Все это позволило пересмотреть существовавший взгляд на то, что конверсия РПЭ может происходить только в пределах “возможностей глазного зачатка”, а именно в эктодермальном направлении. Все эти данные свидетельствует о заложенной в РПЭ двойной компетенции. Молекулярные изменения в клетках культивированного РПЭ млекопитающих имеют сходство с событиями, происходящими в РПЭ амфибий при регенерации сетчатки in vivo (Engelhardt et al., 2005; Milyushina et al., 2012). Это указывает на консервативную молекулярно-генетическую природу механизмов трансдифференцировки РПЭ у низших и высших позвоночных.

ИНИЦИАЦИЯ ПРОЦЕССА КЛЕТОЧНОЙ КОНВЕРСИИ В РПЭ АМФИБИЙ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Вопросы инициации конверсии клеток РПЭ у амфибий и у млекопитающих были подробно рассмотрены для определения сходства и отличий клеточных событий (обзоры: Grigoryan, 2012; Chiba, 2014). Установлено, что триггером трансдифференцировки является разобщение НС и РПЭ, в частности разрушение интерфоторецепторного матрикса (IPM), обеспечивающего взаимодействие между двумя тканями сетчатки и их жизнеспособность (Lazarus, Hagemann, 1992; Панова, 1994; Uehara et al., 2001) (рис. 1б). Дезинтеграция является триггером событий, суммированных в общем виде в табл. 1. Ранние события после разобщения НС и РПЭ у позвоночных связаны с нарушениями редокс-гомеостаза, развитием окислительного стресса, запускающими в клетках воспалительную реакцию и иммунный ответ (Маркитантова, Симирский, 2020). На самых начальных этапах превращений клеток РПЭ существует большое сходство вне зависимости от того, что стало причиной разобщения РПЭ с НС, и какую стратегию клетки РПЭ выберут в дальнейшем – стать нейронами при регенерации НС у амфибий или приобрести мезенхимную дифференцировку при ЭМП у млекопитающих. В обоих случаях наблюдается дезинтеграция клеток в слое РПЭ, нарушение в системе контактов и межклеточных взаимодействий, изменения во взаимодействиях с подлежащими тканями, приобретение способности к миграции (обзоры: Grigoryan, 2012; Chiba, 2014). Имеют место реорганизация цитоскелета и композиции ВКМ на фоне изменений со стороны циркулирующей крови и иммунной системы. Все эти изменения, приводят к дестабилизации фенотипа РПЭ, фенотипической трансформации при выходе из слоя и миграции клеток. Параллельно происходит down-регуляция экспрессии молекул – компонентов зрительного цикла (Rattner et al., 2008; Garcia-Ramirez et al., 2009) и экспрессии белков специфичных для РПЭ (Chiba et al., 2006; Авдонин и др., 2008). В то же время имеет место up-регуляция экспрессии белков теплового шока (HSPs) (Faktorovich et al., 1992; Geller et al., 2001), ряда ростовых факторов (PEDF, VEGF, FGF, CNTF, IGF, TGF) и компонентов их сигнальных путей (обзор: Strauss, 2005; Abu El-Asrar et al., 2007; Chen et al., 2015; Farjood, Vargis, 2017). Увеличивается экспрессия проапоптотических ферментов и генов быстрого реагирования на стресс (“immediate early response genes” и AP-1 complex) (Kaneko et al., 1999; Reme et al., 2003; Geller et al., 2001). Все связанные с разобщением РПЭ и НС события, и у амфибий, и у млекопитающих, можно расценивать как универсальные ответы на клеточный стресс (Rattner et al., 2008; Grigoryan, 2012). Тем не менее, помимо сходства и универсальности ранних клеточных реакций, участия сигнальных путей, действие которых направленно на защиту клетки от стресса, существуют эволюционно закрепленные функциональные особенности в стратегиях поведения клеток РПЭ у хвостатых амфибий и млекопитающих (Маркитантова, Симирский, 2020).

ИЗМЕНЕНИЯ ЦИТОСКЕЛЕТА, КОНТАКТОВ И КОМПОНЕНТОВ ВКМ В ХОДЕ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК РПЭ АМФИБИЙ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Цитоскелет клеток РПЭ является отражением его эпителиальной и функциональной специализации, а также фенотипической пластичности. Мы исследовали состояние цитоскелета клеток РПЭ тритона Pl. waltlii в норме и в начале конверсии. Индукция к репрограммированию РПЭ путем изоляции НС (удаление, отслойка) приводила к ингибированию экспрессии цитокератинов в клетках, находящихся еще в слое РПЭ (Григорян, 1995; Григорян, Антон, 1995). То же наблюдалось при изоляции и диссоциации клеток РПЭ тритона, что было вызвано меняющимися условиями: потерей контактов клеток друг с другом, выстилающей РПЭ мембраной Бруха и фоторецепторами НС, т.е. с утерей трехмерного окружения. В то же время, в первых, выселяющихся из слоя и меняющих фенотип клетках РПЭ, инициировалась экспрессия пан-нейрального белка NF-200, при наличии в цитоплазме пигментных гранул (Григорян, Антон, 1993). В ходе развития популяции нейробластов (клеток потомков РПЭ) ее дифференцировки и морфогенеза белки NF-200 накапливались. Данные свидетельствуют о том, что замещение специфических белков цитоскелета РПЭ (цитокератинов на пан-нейральные белки) входит в программу трансдифференцировки. Высокая скорость переключения на считывание с генов, кодирующих белки NF-200, свидетельствует о лабильном состоянии системы регуляции экспрессии генов. Вопрос молекулярных изменений в системе клеточных контактов, мало изучен. Предварительные данные о локализации белков ZO (zonula occludens), ассоциированных с плотными контактами РПЭ, показали увеличение экспрессии ZO-1 и перераспределение по клеточным поверхностям РПЭ. По мере дальнейшей миграции и дедифференцировки клеток РПЭ экспрессия белка ZO-1 снижалась, что вызвано полной утерей контактов и контактного ингибирования в слое РПЭ (Николаев, 2018). В стабилизации и пластичности клеточной дифференцировки существенную роль играет ВКМ (Hausman, 2007; Bonnans et al., 2014). Нами отмечены динамические изменения в локализации и экспрессии фибронектина (FN) в случае микрохирургической отслойки сетчатки у тритона. На 10-е сут иммунореакция FN-антигенов на обработку антителами снижалась на базальной поверхности, но усиливалась на латеральных поверхностях клеток РПЭ, входящих в это время в фазу пролиферации (Григорян и др., 1990). Те же закономерности в норме и процессе конверсии РПЭ тритона отмечены позже Ортизом и соавторами (Ortiz et al., 1992). Поскольку FN-адгезионный компонент мембраны Бруха и способствует прикреплению клеток РПЭ, снижение его содержания при конверсии можно рассматривать как явление, способствующее выходу клеток из слоя. На роль регуляторов трансдифференцировки РПЭ претендуют и другие компоненты ВКМ и базальных мембран: тенасцин и N-CAM, также меняющие свою экспрессию в процессе конверсии РПЭ тритона (Mitashov et al., 1995). На раннем этапе трансдифференцировки РПЭ тритона, обнаружена ядерная транслокация бета-катенина (β-catenin) одновременно со снижением иммунореактивности N-Сad (N-кадгерина), что служит входу клеток в S-фазу (Yasumuro et al., 2017).

Состояние межклеточных контактов и ВКМ во многом определяют судьбу клеток РПЭ при пролиферативных заболеваниях сетчатки млекопитающих (Hiscott et al., 1999). Существенная роль в конверсии клеток РПЭ при ПВР принадлежит полипептиду ZO-1 и Е-Cad (Е-кадгерину), присутствующему в сайтах межклеточной адгезии. Белки обоих типов участвуют в формировании плотных контактов и адгезии, необходимых для сохранения эпителиальной дифференцировки и функции РПЭ (Stevenson et al., 1986; Lee et al., 2007). Внутриклеточным белком-маркером эпителио-мезенхимной дифференцировки, прежде всего, является сократительный белок α-SMA (гладкомышечный актин альфа), обеспечивающий клеточную подвижность РПЭ. Кроме того, присутствует виментин (Vim), играющий важную роль в стабилизации структуры мигрирующих клеток. Продуцируемый клетками FN является маркерным белком фиброза при формировании ЭМ, необходимым для депонирования микрофибрилл (Lee et al., 2007; Zou et al., 2020). В результате перестройки межклеточных контактов, подвергающийся ЭМП РПЭ приобретает мезенхимоподобный фенотип, характеризующийся усиленной экспрессией белков цитоскелета (Vim, a-SMA), повышенным отложением белков ВКМ, включая коллаген и фибронектин (Imamichi, Menke, 2007). В процессе ЭМП в РПЭ in vivo происходит снижение экспрессии десмоплакина, белков промежуточных филаментов и других компонентов участвующих в формировании десмосом. Процесс сопровождается также сменой паттерна экспрессии цитокератинов, свойственных нативному РПЭ (цитокератины 8 и 18) (Sheridan et al., 2005), заменяются цитокератинами 7 и 19, усиливается экспрессия коллагена I типа и FN (Philp, Nachmias, 1987; Kigasawa et al., 1998). Фенотипические изменения РПЭ при ЭМП и миграции включают снижение экспрессии эпителиальных маркеров ZO-1 и E-Cad, и увеличение экспрессии мезенхимных маркеров – α-SMA, Vim, и FN (Lee et al., 2007). Для мыши показано увеличение активности ТФ ZONAB и снижение ZO-1 при изменении фенотипа РПЭ от пигментированного эпителиального к фибробластоподобному (Georgiadis et al., 2010).

ПРОЛИФЕРАЦИЯ, КАК СОСТАВЛЯЮЩАЯ ПРОЦЕССА КОНВЕРСИИ КЛЕТОК РПЭ У АМФИБИЙ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ

В изучении пролиферативных процессов в РПЭ в развитии глаза и при клеточной конверсии большой вклад внесен О.Г. Строевой и В.И. Миташовым (Строева, 1962; Stroeva, Mitashov, 1983; Миташов, 1969а, 1969б, 1970, 1974). С помощью импульсного мечения ³Н-тимидином у тритонов T. vulgaris в нативном РПЭ удалось выявить до 3% синтезирующих ДНК клеток (Григорян, Миташов, 1979). Позже при использовании метода долговременной доставки аналога тимидина – бромдезоксиуридина (BrdU), а также при многократном введении ³Н-тимидина, наличие в РПЭ тритонов редких клеток в фазе синтеза ДНК подтвердилось (Новикова и др., 2008). Пролиферация клеток нативного РПЭ характеризовалась длинным S-периодом и крайне редкими митозами. Есть данные, свидетельствующие о присутствии пролиферирующих клеток в РПЭ млекопитающих (Al-Hussaini et al., 2008; Stern, Temple, 2015). Отмечено, что медленно пролиферирующие клетки в слое РПЭ позвоночных в норме и при повреждении локализованы на периферии – области наиболее позднего созревания этой ткани (Строева, 1971; Синицина, 1971; Миташов, 1974; Kiilgaard et al., 2007). У тритона пролиферация в РПЭ инициируется на первой неделе после разобщения его с клетками НС, затем возрастает и в течение 2 нед. держится на высоком уровне. Параллельным событием является прекращение синтеза меланина и все более углубляющаяся дедифференцировка (Григорян, Миташов, 1979). В ходе амплификации для клеток РПЭ показаны уменьшение времени клеточного цикла и изменения его параметров: сокращение G₁ и увеличение S-фазы (Миташов, 1969б; Stroeva, Mitashov, 1983). Выяснено также, что у тритона для проявления первых черт специализации в регенерате сетчатки клеткам нужно пройти 6–7 делений, что свидетельствует о необходимости накопления определенной численности клеток в бластеме сетчатки для окончательного приобретения клетками новых черт – нейрональной и глиальной дифференцировок (Миташов, 1970; Mitashov, 1980). Позже сделаны попытки выявления молекулярного механизма входа клеток РПЭ в S-фазу клеточного цикла, вызванного разобщением РПЭ и НС (Mizuno et al., 2012; Yoshikawa et al., 2012; Yasumuro et al., 2017). Мизуно и соавторы исследовали активацию MEK–ERK-каскада в РПЭ in vivo после удаления НС (Mizuno et al., 2012). Активация сигнального пути была выявлена через 30 мин после ретинэктомии. Изменения активности пути MEK–ERK изучали при кратковременном культивирования РПЭ в составе задней стенки глаза тритона (Yoshikawa et al., 2012). Отмечены основные составляющие этого события: высвобождение клеток РПЭ из-под влияния контактного ингибирования, MEK–ERK, гепарин-зависимый сигнальный путь. По мнению авторов, активация MEK–ERK происходит за счет up-регуляции сигнального пути по механизму положительной обратной связи. Данные свидетельствуют о том, что клетки РПЭ тритона обладают механизмом быстрого запуска индуцирующего пролиферацию сигнального каскада и о поддержании его в активированной форме еще в течение 7–10 дней (Mizuno et al., 2012; Yoshikawa et al., 2012).

Вопрос пролиферативной активности РПЭ млекопитающих и человека подробно рассмотрен в обзоре (Stern, Temple, 2015). Раннее созревание и стабилизация дифференцировки РПЭ, а также численности популяции в норме in vivo определяют возможность крайне редких митотических делений (Строева, 1961). Однако ситуация меняется если дифференцировка РПЭ дестабилизирована разобщением с НС, при патологиях, а также в условиях in vitro в результате воздействий со стороны вносимых в среду ростовых факторов. У человека, как указано выше, индукция пролиферации in vivo чаще всего сопровождается ЭМП и возникновением мезенхимных клеток (Casaroli-Marano et al., 1999; Tamiya et al., 2010). В ряде других случаев, таких, например при возраст-зависимой макулярной дегенерации, пролиферация – нечастое событие и не приводит к восполнению слоя РПЭ после гибели части его клеток (Stern, Temple, 2015).

Пролиферативная активность РПЭ млекопитающих и человека изучалась in vitro (Flood et al., 1980; Stern, Temple, 2015). Отмечено, что активный рост РПЭ in vitro чаще всего приводит к появлению клеток, различающейся морфологии в спектре от эпителиальных до фибробластоподобных (Tamiya et al., 2010; Милюшина и др., 2011). Пролиферация сопровождает и проявление более широких, свойственных стволовым клеткам потенций РПЭ, в определенных условиях in vitro оказывающихся способными входить в клеточный цикл и продуцировать клетки как нейрональной, так и мезенхимной линий (Salero et al., 2012). В настоящее время разработаны условия in vitro, позволяющие избежать ЭМП и нарабатывать большую численность клеток, имеющих фенотип, близкий к исходному. Исследования их свойств на уровне транскриптома выявляют экспрессию маркеров поверхности и функционирования, близкие таковым нативных клеток РПЭ (Hu, Bok, 2001; Blenkinsop et al., 2013, 2015). При изучении механизма входа клеток РПЭ человека в фазу синтеза ДНК in vitro установлено, что, как и в случае инициации пролиферации клеток РПЭ амфибий, ключевую роль играют митоген-активированная протеин киназа (MAPK) и киназа, регулируемая внеклеточным сигналом (ERK) (Zhang, Liu, 2002). На этом сигнальном пути рецептор ростового фактора активирует rasGTP-азу, что приводит к MAPK/ERK фосфорилированию (Hecquet et al., 2002). MAPK/ERK в свою очередь, регулирует экспрессию транскриптов: c-myc, Pax6, klf4, и MITF, свидетельствующих о понижении уровня дифференцировки РПЭ (Bharti et al., 2006).

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СОБЫТИЯ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ПРИ РЕПРОГРАММИРОВАНИИ РПЭ IN VIVO У ХВОСТАТЫХ АМФИБИЙ

Регенерация НС у хвостатых амфибий осуществляется под координированным контролем работы генных сетей, в которых ведущую роль играют ТФ и сигнальные белки, запускающие или ингибирующие ключевые сигнальные каскады (Chiba, Mitashov, 2007). В лаборатории под руководством В.И. Миташова в середине 90-х начались работы по определению молекулярно-генетического профиля клеток РПЭ и пигментного эпителия радужки на разных этапах регенерации сетчатки и хрусталика у взрослого тритона Pl. waltlii (Mitashov et al., 1995; Markitantova et al., 2003; Маркитантова и др., 2004; Миташов, 2007). Изучение нативного РПЭ тритона показало, что клетки экспрессируют гены, ответственные за специализацию и меланогенную дифференцировку (Маркитантова и др., 2004; Авдонин и др., 2008; 2010; Маркитантова и др., 2010, 2014, 2015; Grigoryan, Markitantova, 2016). Основное направление наших исследований было связано с поиском и изучением экспрессии регуляторных генов, и генов, кодирующих молекулы, взаимодействия которых могут запускать и контролировать трансдифференцировку РПЭ, последующую пролиферацию нейробластов и дифференцировку клеток, приводящих к восстановлению НС.

В основу подхода к изучению механизмов репрограммирования РПЭ и регенерации сетчатки легла гипотеза сходства регуляторных механизмов, контролирующих процессы развития и регенерации одноименных тканей. Впервые с использованием метода ОТ-ПЦР и гибридизации in situ, в регенерирующей сетчатке взрослых Pl. waltlii мы идентифицировали гомеобокссодержащие гены “глазного поля” Pax6, Prox1, Six3, принадлежащие регуляторной сети, контролирующей процессы развития тканей глаза (Маркитантова и др., 2004). Со временем реэкспрессия ряда ключевых эволюционно консервативных генов, кодирующих ТФ и сигнальные белки Pax6, Prox1, Six3, Otx2, Fgf2 была выявлена в регенерации хрусталика и сетчатки у других видов амфибий, в том числе хвостатых (Markitantova et al., 2004; Chiba, Mitashov, 2007; Veldman et al., 2007; Авдонин и др., 2010; Маркитантова и др., 2010, 2014; Sousounis et al., 2013). Мы исследовали пространственно-временной характер распределения гомеобоксных Pax6, Prox1, Six3, Pitx1, Pitx2 и тканеспецифичных генов RPE65 и Otx2 в начале конверсии РПЭ и на последовательных стадиях регенерации сетчатки тритона Pl. waltlii, с использованием методов ПЦР, гибридизации in situ и иммунохимии (Маркитантова и др., 2004, 2010; Авдонин и др., 2010). Изучение локализации и распределения мРНК показало, что транскрипция мРНК генов Pax6, Prox1 и Six3 в нативном РПЭ не наблюдается, и что эти гены активируются на ранних этапах регенерации сетчатки (Маркитантова и др., 2004). С внедрением в исследование методов ПЦР, удалось получить более полную картину динамики экспрессии изучаемых генов на последовательных стадиях регенерации, начиная с ранних. Так, с помощью ОТ-ПЦР было показано, что активация генов Pax6, Six3, FGF2 происходит на фоне подавления уровня экспрессии мРНК регуляторного гена Otx2, контролирующего исходную меланогенную дифференцировку клеток РПЭ, а также гена-маркера дифференцировки РПЭ – RPE65 (Авдонин и др., 2008). По данным литературы на ранней стадии регенерации сетчатки наблюдается снижение уровня экспрессии не только гена Otx2, но и маркеров меланогенеза – RPE65, CRBP, являющихся мишенями для Otx2 (Sakami et al., 2005). Наши результаты нашли соответствие с данными об изменении уровня экспрессии ключевых регуляторных генов Pах6, Mitf, Otx2 на ранних стадиях развития глаза позвоночных. Показано, что в основе формирования нейробластов развивающейся сетчатки лежат антагонистические взаимодействия между этими генами (Baumer et al., 2002). Следует отметить, что в депигментирующихся клетках РПЭ зарегистрированы низкие уровни мРНК Pax6, Prox1 и Six3, по сравнению с пролиферирующими нейробластами, образующими зачаток сетчатки и характеризующимися активной экспрессией, обнаруженной на ранних стадиях регенерации во всех нейробластах зачатка НС (Маркитантова и др., 2004). В активно пролиферирующих нейробластах будущей сетчатки мы идентифицировали транскрипционную активность гена нуклеостемина (Ns), кодирующего белок ядрышка. Cолокализация нуклеостемина и Fgf2 в нейробластах регенерирующей сетчатки позволила выдвинуть предположение об их участии в регуляции пролиферации клеток в составе общего сигнального пути (Маркитантова и др., 2014, 2015; Markitantova et al., 2020). При этом, с учетом профиля экспрессии ряда изученных регуляторных генов и белков, клетки РПЭ тритонов могут быть отнесены к категории клеток с “молодым” фенотипом. Это означает, что в них на низком уровне поддерживается экспрессия ТФ из числа регуляторов раннего развития глаза (early eye-field genes) (Рах6, Otx2, Mitf, Pitx1, Pitx2, Hes1), участвующих в специфическом молекулярном контексте в контроле дифференцировки РПЭ в эмбриогенезе (RPE65, Pax6, Otx2, Mitf, Pitx1, Pitx2) (рис. 3) (Grigoryan, Markitantova, 2016).

Рис. 3.

Микрофото (слева) клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) вскоре после разобщения его с фоторецепторами в результате отслойки сетчатки у тритона. Голубые стрелки – клетки, находящиеся еще в слое РПЭ; красные стрелки – клетки РПЭ, в начале процесса трансдифференцировки, покинувшие слой РПЭ. Видны отличия в состоянии хроматина. Справа – выявленные гены и белки (суммированные сведения), красные стрелки указывают отличия в экспрессии по сравнению с клетками, сохраняющимися в слое РПЭ.

Наши данные продемонстрировали участие перечисленных выше генов в формировании регуляторной сети, контролирующей как трансдифференцировку клеток РПЭ, так и последовательные стадии регенерации сетчатки. Одним из важных результатов явилось обнаружение сходного с развитием паттерна экспрессии генов интереса на ранней стадии регенерации – в нейробластах регенерирующей НС. Полученные данные позволили также сделать вывод о том, что после ретинэктомии в клетках РПЭ глаза тритона репрессируются гены, определяющие их исходный фенотип, и одновременно экспрессируются новые регуляторные гены, перепрограммирующие РПЭ для приобретения ими свойств стволовых клеток (Маркитантова и др., 2004; Chiba, Mitashov, 2007). Таким образом, предположения, сделанные О.Г. Строевой и В.И. Миташовым о “переключении работы генов” (Строева, Миташов, 1970; Stroeva, Mitashov, 1981) нашли свое экспериментальное подтверждение.

В РПЭ и при регенерации сетчатки глаза тритона вида Pl. waltlii мы впервые идентифицировали гомеобокс-содержащие гены Pitx1, Pitx2 и определили локализацию соответствующих белковых продуктов (Авдонин и др., 2008; Маркитантова и др., 2010; Авдонин и др., 2010). Ранее с помощью генного нокаута, было продемонстрировано участие Pitx2 в регуляции экспрессии генов Otx2 и Mitf, контролирующих меланогенез в ходе дифференцировки клеток РПЭ мыши. В экспериментах по оверэкспрессии гена Pitx1 было обнаружено существенное снижение экспрессии генов Otx2, Pax6, а также нейрального маркера b-тубулина в глазном бокале и мозге (Evans, Gage, 2005). Согласно этим сведениям, и Pitx1, и Pitx2 находятся на верхней ступени иерархии генов, контролирующих процессы меланогенеза и нейрогенеза. У хвостатых амфибий после травмы тканей отмечена также активация генов иммунного ответа и протоонкогенов, из числа ТФ – с‑fos, c-myc, c-jun (Maki et al., 2009).

Важным стало определение времени, когда происходит репрограммирование, когда реализуется решение клеток РПЭ тритона пойти по иному пути. С помощью количественной ПЦР на изолированных клетках удалось выяснить, что первые дочерние клетки РПЭ на 10-й день после ретинэктомии инициируют работу генов плюрипотентности c-Myc, Klf4 и Sox2, а также Mitf и Pax6 (Islam et al., 2014). По времени это совпадает со входом клеток в пролиферативную фазу и экспрессией маркера нейральных стволовых клеток Musashi-1 (Kaneko, Chiba, 2009), а также пан-нейрального маркера NF (Григорян, Антон, 1993). Важно, что в это время экспрессия гена, кодирующего специфический белок РПЭ – RPE65, была сходной по уровню как для интактных клеток РПЭ, так и для первых клеток зачатка НС. Это свидетельствовало о сохранении одного из основных признаков исходной дифференцировки в момент появления клеток с признаками мультипотентности. Позже в клетках зачатка экспрессия RPE65 подавлялась, в то время как гены мультипотентности продолжали экспрессироваться до 14–15-го дней регенерации, до формирования многорядного зачатка НС, после чего уже в полную силу включались гены пронейральной дифференцировки и затем гены специфических клеточных типов и глии.

Совокупность полученных нами и коллегами сведений, свидетельствует о частичном сохранении РПЭ интактных, половозрелых хвостатых амфибий клеточного, молекулярно-генетического и эпигенетического профилей, характерных для ювенильных состояний, наряду с экспрессией всех признаков функциональной специализации (Grigoryan, Markitantova, 2016; Grigoryan, 2020). Эти данные согласуются с результатами работы на РПЭ куриного эмбриона (ст. Е4), также способного к смене клеточного типа in vivo и экспрессирующего ряд факторов – маркеров клеточной плюрипотентности (klf4, c-myc, lin-28) (Luz-Madrigal et al., 2014). Некоторые регуляторные белки, такие как Wnt, гликопротеины, в кооперации с ТФ плюрипотентности Oct4, Sox2, Nanog, участвуют в регуляции пролиферации клеток, в частности, поддержании пула стволовых клеток при регенерации тканей (Desai et al., 2010; Katsman et al., 2012; Khan et al., 2015). Накопленные экспериментальные результаты дают основания предполагать, что на самых ранних стадиях регенерации НС в тканях заднего сектора глаза в большей мере востребованы факторы, участвующие в защите клеток РПЭ от гибели и поддержании их функций. Для амфибий и высших позвоночных в качестве еще одного из таких факторов обсуждается эпидермальный фактор роста (Egf) (Defoe, Grindstaff, 2004).

Итак, существенным достижением в исследованиях молекулярных механизмов регенерации сетчатки у хвостатых амфибий стало обнаружение сходства основной сети регуляторных генов, контролирующей процессы развития и регенерации сетчатки, сходство молекулярных механизмов процессов клеточной дифференцировки после образования слоя нейробластов в развитии и при регенерации. Однако, существуют и различия. Они связаны с отличием клеточных источников формирования НС: в ходе эмбрионального развития источником служат клетки внутреннего слоя глазного бокала, а в процессе регенерации сетчатки клетки РПЭ.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СОБЫТИЯ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ПРИ РЕПРОГРАММИРОВАНИИ РПЭ IN VIVO У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА

Процесс ЭМП играет важную роль в развитии органов, клеточном репрограммировании, а также процессах метастазирования (Kalluri, Weinberg, 2009). Целостность РПЭ поддерживается координированным взаимодействием генов, контролирующих процессы, обеспечивающие стабильное дифференцированное состояние этой ткани (Strauss, 2005). Утрата фенотипических черт РПЭ при патологических состояниях лежит в основе возникновения и прогрессирования пролиферативных нарушений в глазу, таких как ПВР. ЭМП клеток РПЭ как часть аберрантной реакции при ранозаживлении при данной патологии способствует формированию ЭМ (Snead et al., 2008; Tamiya, Kaplan, 2016). Особенности ЭМП в РПЭ млекопитающих связаны с утратой полярности, специализированных плотных межклеточных контактов (tight junctions), реорганизацией цитоскелета, и приобретением свойств мезенхимальных клеток (Philp, Nachmias, 1987; Huang et al., 2012). Основным событием реорганизации цитоскелета в РПЭ при ЭМП является смена паттернов экспрессии кадгеринов (Thiery, Sleeman, 2006; Imamichi, Menke, 2007): при каноническом ЭМП в РПЭ происходит подавление экспрессии N-кадгерина (CDH2) и переключение на экспрессию кадгеринов, специфичных для РПЭ, таких как E (CDH1) и R (CDH3) (Maeda et al., 2005; Nieto, 2011).

Молекулярные основы ЭМП в РПЭ, включая изменения в экспрессии и регуляции генов, остаются плохо изученными (Vadigepalli et al., 2003; Nazarieh et al., 2016). Они включают изменения в экспрессии функционально значимых генов под контролем специфических ТФ в генетической сети, в контексте паттернов скоординированной регуляции в РПЭ в норме и в процессе ЭМП. Один из аспектов этой регуляции предполагает упомянутое выше переключение экспрессии подтипов кадгериновых белков. Процесс ЭМП в РПЭ сопровождается подавлением экспрессии ТФ, индуцирующих ЭМП (ЭМП-ТФ), таких как Snail, Slug, ZEB1/2, TWIST, GSC (Choudhary et al., 2015) и других, вызывающих классический ЭМП при фиброзной и онкотрансформации (Hua et al., 1998; Kang, Massague, 2004). Взаимодействия с этими TФ играют центральную роль в механизмах репрессии E-кадгерина в мезенхимальных клетках, поскольку она является одним из важных условий для возврата в эпителиальное состояние.

С применением методов компьютерного моделирования, биоинформационного и биохимического анализа, обнаружены биологически значимые ТФ, способные регулировать фенотип клеток РПЭ (Pratt et al., 2008). В промоторах ряда генов идентифицированы специфические элементы, отвечающие за транскрипцию (TRE) при связывании с ТФ – кандидатами на роль главных “узлов” в транскрипционной сети, регулирующей ЭМП в РПЭ. Среди предсказанных мишеней действия ТФ, рассматриваемых в качестве потенциальных терапевтических мишеней в профилактике и лечении пролиферативных заболеваний сетчатки и РПЭ человека находятся: Oct-1, ядерный фактор гепатоцитов 1 (HNF-1), ядерный фактор транскрипции GATA-1, SMAD3, фактор транскрипции E (TFE), фактор регуляции интерферона-1 (IRF), HNF3alpha, E2F, CDP, SP3, гомео-бокссодержащий ген NKX3A, связывающий регуляторный элемент стерола белок-1 (SREBP-1), фактор-усилитель лимфоцитов-1 (LEF-1), а также N- и R-кадгеринов. Дифференциальная и скоординированная экспрессия функциональных кластеров регуляторных генов во время ЭМП РПЭ подтверждена ПЦР с обратной транскрипцией (Pratt et al., 2008).

В качестве моделей для выявления механизмов приобретения эпителиального фенотипа и ЭМП, широко используются клетки РПЭ, полученные из человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC), РПЭ плода человека и РПЭ клеточной линии ARPE19 (Vaajasaari et al., 2011; Buchholz et al., 2013; Lynn et al., 2017; Zhou et al., 2020). Важную роль в определении эпителиальной судьбы РПЭ играет ТФ – протоонкоген FOXM1 (Benayoun et al., 2011). На отмеченных модельных системах показано, что РПЭ претерпевает ЭМП, зависимым от ТФ FOXM1 способом. Сверхэкспрессия FOXM1 приводит к усилению свойств эпителиального фенотипа, о чем свидетельствует повышенная экспрессия маркера РПЭ – премеланосомного белка PMEL17. Предполагается, что это достигается за счет непосредственной регуляции пролиферации РПЭ. Установлено также, что FOXM1 напрямую регулирует пролиферацию клеток РПЭ посредством контроля кластеров генов, связанных с пролиферацией (клеточным циклом, репликацией ДНК, биогенезом рибосом). Связь с пролиферацией подтверждается ассоциацией FOXM1 с промоторами генов, регулирующий клеточный цикл (Chen et al., 2013). Нокдаун FOXM1 с помощью siRNA приводит к снижению экспрессии позитивных регуляторов клеточного цикла (CDC5L, CDK12 и FZR1) и увеличению экспрессии CDKN1A, известного ингибитора клеточного цикла (Wang et al., 2005; Qu et al., 2013). Механизм ЭМП включает также участие ТФ FOXM1 в модуляции экспрессии сигнальных белков BMP7 и Wnt5B, способных передавать внеклеточные сигналы и влиять на судьбу эпителия антагонистическим образом. Действуя реципрокно, они обеспечивают поддержание эпителиального фенотипа. Экзогенный рекомбинантный Wnt5B существенно снижает экспрессию эпителиальных маркеров, меняя фенотип эпителиальных клеток в сторону мезенхимального (Choudhary et al., 2015). Взаимные антагонистические взаимодействия BMP/Wnt необходимы для самообновления РПЭ, что продемонстрировано в различных клеточных системах РПЭ (Kandyba et al., 2013; Stewart et al., 2014). Действие FOXM1 на BMP7 и Wnt5B может быть опосредованным, поскольку связывание с промоторами их генов не обнаружено. Регуляция со стороны FOXM1 может происходить посредством воздействия на другие, вышестоящие факторы, или на пост-транскрипционном уровне, как это описано для регуляции комплекса SMAD3/4 (Xue et al., 2014). В совокупности, имеющиеся экспериментальные данные указывают на то, что FOXM1 регулирует пролиферацию клеток РПЭ, действуя как активатор или репрессор генно-зависимым образом.

В наших работах, а также коллегами из Японии, были выявлены некоторые особенности экспрессии ряда генов, кодирующих ТФ, в том числе Pax6, Otx2, Fgf2 при регенерации сетчатки у хвостатых амфибий, в отличие от моделей повреждения сетчатки у млекопитающих. Дополнительным подтверждением выдвинутой нами гипотезы о клеточных и молекулярных особенностях РПЭ Urodela, позволяющих этим клеткам естественное репрограммирование (natural reprogramming) в нейроны сетчатки, являются результаты, полученные японскими исследователями в 2016 г. (Casco-Robles et al., 2016). Эта работа, проведенная с помощью нокаута гена Pax6 с использованием технологии Cre-lox у личинок тритонов Cynops pyrrhogaster, явилась ключевым исследованием в понимании различий в выборе путей конверсии РПЭ – приобретении нейральной или мезенхимной дифференцировок (Сasco-Robles et al., 2016). Так, у хвостатых амфибий ключевой фактор транскрипции Pax6 отвечает за репрограммирование клеток РПЭ в клетки НС при ее регенерации in vivo. Оказалось, что отсутствие экспрессии этого мастер гена блокирует регенерацию НС у взрослых тритонов и индуцирует в клетках РПЭ тритона выход в мезенхимную дифференцировку, как известно, обусловливающую ПВР у человека. Вместо участия в регенерации НС клетки, покидая слой РПЭ, формировали многоклеточные агрегаты, не способные к организации упорядоченного слоя. В агрегатах наблюдалась экспрессия маркерных белков миофибробластов – альфа-гладкомышечного актина (alpha-SMA), виментина (Vim) и N-кадгерина (N-Cad). Предполагается, что в ходе эволюции механизм, используемый Urodela для регенерации сетчатки, эволюционировал таким образом, что его модификация в конечном итоге у амниот легла в основу РПЭ-зависимых патологий (Сasco-Robles et al., 2016). Важно отметить тот факт, что данный выбор клетками РПЭ осуществляется рано, сразу после выхода клеток из слоя, в норме сдерживающего трансформации фенотипа РПЭ. Кроме консервативных функций, установленных для ТФ, и, в частности для Pax6, существуют различия в стратегиях поведения и трансдифференцировки клеток РПЭ у эволюционно отдаленных видов позвоночных, объясняемые особенностями в регуляции клеточными процессами, как на локальном, эпигенетическом, так и организменном уровнях (Маркитантова, Симирский, 2020). Следовательно, для рассматриваемой нами системы трансдифференцировки клеток РПЭ в нейральную ткань сетчатки у взрослых амфибий и при ЭМП клеток РПЭ у млекопитающих, напрашивается заключение, что в обоих случаях имеет место близкая молекулярная основа, но содержащая модификации работы ключевых генов. В свою очередь, эти модификации обусловлены действием регуляторных механизмов (как вне- так и внутриклеточных), влияющих на эпигеном клеток РПЭ.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СО СТОРОНЫ МИКРООКРУЖЕНИЯ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РПЭ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ СЕТЧАТКИ У АМФИБИЙ

Понимание регуляции со стороны клеточного микроокружения являются ключом к направленному изменению поведения клеток РПЭ с целью восстановления сетчатки и/или ингибированию патологических состояний РПЭ. В процессе изучения двух стратегий конверсии РПЭ у амфибий и млекопитающих выше мы отметили сходство в клеточном поведении, инициации, прогрессе трансдифференцировки, а также последовательности ее основных этапов. В то же время накопленная информация свидетельствует о том, что в регуляционных факторах микроокружения и в малоизученном пока паттерне их экспрессии присутствуют отличия. Известно, что многие регуляторные факторы производятся и секретируются как НС, так и собственно клетками РПЭ, в ответ на разобщение с сетчаткой (Grigoryan et al., 2012; Pastor et al., 2016).

Среди изучаемых сигнальных белков, которые вовлечены в контроль регенерации сетчатки, внимание приковано к участникам молекулярных каскадов Fgf, Bmp, Wnt, Shh (Hayashi et al., 2004; Mercer et al., 2012; Григорян и др., 2013; Sherpa et al., 2014; Grigoryan, Markitantova, 2016). В наибольшей степени нами изучена роль сигнального пути FGF2, являющегося ключевым для регенерации сетчатки у тритона (Маркитантова и др., 2014). В исследованиях работы компонентов сигнального каскада FGF2 обнаружено, что в ранний период после удаления сетчатки в регенерате происходит down-регуляция гена fgf2, что свидетельствует о подавлении сигналов Fgf2 до инициации пролиферации клеток РПЭ, сразу после ретинэктомии (Маркитантова и др., 2014). Согласно сведениям, полученным зарубежными коллегами для других видов Urodela, и нашим данным по Pl. waltlii, Fgf2 не является первичным, индуцирующим процесс конверсии клеток РПЭ, а выполняет эволюционно консервативную функцию митогена. Усиление экспрессии и митогенный эффект Fgf2 связан с более поздней по времени стимуляцией пролиферативной активности нейробластов регенерата НС и периодом резкого ее возрастания (Susaki, Chiba, 2007; Mercer et al., 2012; Маркитантова и др., 2014). Основным источником сигналов FGF может служить сосудистая оболочка глаза (Azuma et al., 2005; Araki et al., 2007). Наблюдаемая нами активация FGF2 в раннем регенерате НС, представленном слоем нейробластов, и в клетках Мюллера дифференцированной НС (Маркитантова и др., 2014), коррелирует с ранним формированием в ходе регенерации клеток макроглии, которая, возможно, является еще одним источником этого фактора (Sakami et al., 2005). Иммуногистохимически определена локализация белка FGF2 и его рецепторов Fgfr2 в РПЭ и хороиде, а также во внутренней НС, зрительном нерве и ростовой зоне (pars ciliaris и ora serrata) нативного глаза тритона. С помощью ПЦР в реальном времени обнаружено, что гены и белки FGF2 обладают дифференциальной экспрессией не только в ходе регенерации сетчатки in vivo, но и in vitro (Маркитантова и др., 2014; Markitantova et al., 2020). Для белков теплового шока (HSPs), обнаруженных нами в сетчатке тритонов и различно экспрессируемых в норме и при регенерации, помимо их шаперонной активности, также предполагается регуляторная роль в конверсии РПЭ. В трансдифференцировке РПЭ у тритона показано участие сигнального пути Notch (Kaneko et al., 2001; Nakamura, Chiba, 2007). Прослежена динамика экспрессии Notch-1, возрастающей по мере развития регенерата НС и снижающаяся при выходе клеток в дифференцировку. Введение блокатора DAPT приводит к преждевременному созреванию нейронов в бластеме НС. Выяснено также, что клетки РПЭ тритона в ходе регенерации НС дифференциально экспрессируют сигнальные молекулы Hes-1, neurogenin1 и Delta. На роль участника регуляционной сети микроокружения клеток РПЭ претендует и сигнальный путь Wnt/β-catenin, регулирующий регенерацию сетчатки у рыб и куриного эмбриона (Meyers et al., 2012; Gallina et al., 2016).

Факторы микроокружения работают локально и короткодистантно, и в экспрессии обнаруживают сходство с активностью в период гистогенеза сетчатки глаза. Однако эти события в иерархии системы надклеточного сигнализирования находятся ниже системных, общеорганизменных факторов. К последним относятся: гормоны, факторы иммунной системы и крови. Хвостатые амфибии, животные с наиболее высоким регенераторным потенциалом, являясь педоморфными, демонстрируют ускоренное половое созревание, тормозящее соматическое развитие (Grigoryan, 2021). В основе феномена лежит активность тиреоидного гормона (ТГ) – главного регулятора метаморфоза у амфибий. В свою очередь, действие ТГ опосредовано его рецепторами, являющимися ядерными ТФ, и экспрессией генов met1–3. Показана регуляция функции ТГ со стороны “гена гетерохронии” lin28, члена семейства генов Lin28, кодирующих ТФ, известные в качестве индукторов плюрипотентности соматических клеток высших позвоночных (Faunes et al., 2017). Можно предположить роль этого и подобных ему генов в поддержании клеток на уровне дифференцировки, пермиссивном для конверсии в нейрональном направлении через регуляцию ТГ, TСГ (тироид-стимулирующего гормона) и других гормонов. В областях регенерации хрусталика, конечности и сетчатки у тритона была выявлена экспрессия факторов иммунной системы комплемента – С3 и С5 (Kimura et al., 2003). Комплемент C3a способен индуцировать регенерацию сетчатки из РПЭ у эмбриона цыпленка через активацию регулятора транскрипции STAT3, в свою очередь активирующего факторы ответа на повреждение и воспаление IL-6, IL-8 и TNF. Это, в итоге, приводит к регуляции генов сигнального пути Wnt2b, а также генов Six3 и Sox2, кодирующих ТФ, характерные для прогениторных клеток (Haynes et al., 2013). Все эти данные служат накоплению информации, необходимой для последовательного выстраивания сети, регулирующей трансдифференцировку РПЭ у Urodela.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССА ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РПЭ СО СТОРОНЫ МИКРООКРУЖЕНИЯ ПРИ ПВР У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

В качестве основного регулятора стабилизации эпителиального фенотипа РПЭ, кадгерин-зависимой межклеточной адгезии и пигментации клеток у млекопитающих рассматривается сигнальный путь Wnt/β-catenin (Burke, 2008). В ходе ЭМП клетки РПЭ теряют черты специализации, межклеточные контакты и адгезию, приобретают характеристики мигрирующих мезенхимных клеток (Kigasawa et al., 1998; Tosi et al., 2014; Tamiya, Kaplan, 2016). Вместо синтеза характерных для РПЭ внутриклеточных белков, таких как цитокератины, клетки экспрессируют α-SMA и белки стресс фибрилл (Feist et al., 2014). Эти события происходят под контролем ростовых факторов и резидентных клеток воспаления, находящихся в циркулирующей крови и стекловидном теле глаза (Wiedemann, 1992; Pastor et al., 2002) (рис. 4). В контроле со стороны иммунной системы участвуют цитокины – интерлейкины – (IL-) 1, IL-6, IL-8, IL-10, а также интерферон-гамма (INF-γ) (Morescalchi et al., 2013). Существующие представления о патогенезе ПВР включают изменение локальных концентраций не только цитокинов, но и ряда ростовых факторов, управляющих процессами трансдифференцировки, миграции, пролиферации и формирования ВКМ (Parmeggiani et al., 2010). В первую очередь к ним относится трансформирующий фактор роста бета (TGFβ), а также фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста, выделенный из тромбоцитов (PDGF), сигнальные пути Notch, Wnt/β-catenin, и сигнальный путь Hippo (Bochaton-Piallat et al., 2000; Spraul et al., 2004; Stern, Temple, 2015; Chen et al., 2015). TGFβ обнаруживается в глазах пациентов с ПВР, на уровне экспрессии, положительно коррелирующим с развитием патологии (Connor et al., 1989; Shu et al., 2017). Роль TGFβ в трансдифференцировке в мезенхимном направлении многократно показана как для человека (Stocks et al., 2001; Li et al., 2011; Xiao et al., 2014; Dvashi et al., 2015), так и на мышиной модели PVR (Saika et al., 2004; Saika et al., 2007). У человека TGFβ2 активирует p38 MAPK сигнальный путь, а при его ингибировании происходит подавление синтеза коллагена I типа (Kimoto et al., 2004). Обнаружено, что наряду с TGFβ активируется и TNFα, то есть имеет место влияющее на прогресс ЭМП комбинаторное действие этих факторов. У человека рецепторы этих сигнальных молекул обнаружены в нативном РПЭ (Strunnikova et al., 2010; Boles et al., 2020). Роль TGFβ, привлекающая наибольшее внимание исследователей, выявлена в активации многих сигнальных каскадов при ЭМП клеток РПЭ, что, в свою очередь, дает ключи к лечению ПВР (Yang et al., 2015). Помимо TGFβ в исследованиях моделей ЭМП клеток РПЭ in vivo и in vitro продемонстрирована важная роль сигнального пути Smad. У мышей, дефицитных по Smad показано подавление процесса конверсии РПЭ после индукции ЭМП с помощью TGFβ, а также в случае экспериментальной отслойки НС (Saika et al., 2004). Как отмечено выше, клетки РПЭ быстро отвечают на отслойку НС активацией ERK сигнального пути и повышением экспрессии ТФ AP-1. Основной фактор роста FGF2 также включен в ранний ответ РПЭ на отслойку НС (Geller et al., 2001), как и при конверсии РПЭ у тритона.

Рис. 4.

Изменения композиции белков контактов клеток РПЭ и ВКМ при пролиферативной ретинопатии у млекопитающих. ЭМТ – эпиталиально-мезенхимный переход; MMPs/TIMPs – матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы.

Как упомянуто выше, есть экспериментальные доказательства того, что клетки РПЭ взрослого человека in vitro могут демонстрировать свойства нейрональных клеток. Это предполагает поиск факторов, препятствующих трансдифференцировке РПЭ в нейральные клетки сетчатки in situ и, напротив, индуцирующих дифференцировку клеток РПЭ в нейрональном направлении, за счет подавления ЭМП, для восстановления НС после травмы или патологии. Действие FGF2 in vitro на клетки РПЭ человека проявляется в консервативной функции в качестве митогена для поддержания пролиферации клеток, а на генном уровне – для модуляции экспрессии генов, принимающих участие в нейральной дифференцировке (Шафеи и др., 2017). Однако, в данной системе, появление клеток нейрального фенотипа регистрируется на фоне сохранения свойств клеток мезенхимной линии дифференцировки, о чем свидетельствует экспрессия широкого ряда маркеров не нейрональной природы. Методами иммуноцитохимии, ПЦР, ПЦР-РВ и МТТ-теста получены данные о роли сигнальных путей TGFb/BMPs, WNT, Notch и FGF в регуляции пластичности клеток ARPE-19 взрослого человека. В клетках РПЭ глаза взрослого человека in vitro зарегистрирована транскрипция мРНК Notch и BMPs, лигандов сигнальных путей, способных ингибировать нейральную дифференцировку клеток. Сигналы Wnt способны модулировать экспрессию белков Notch и BMPs. Wnt1 усиливает пронейральную дифференцировку, в то время как Wnt7a влияет на дедифференцирующиеся in vitro клетки РПЭ контекст зависимо, усиливая в одних клетках процессы нейральной дифференцировки, в других – редифференцировку в пигментированные эпителиальные клетки (Kuznetsova et al., 2014; Ржанова и др., 2020).

Таким образом, регуляторные события, происходящие при конверсии клеток РПЭ млекопитающих в мезенхимном направлении, как и в случае конверсии РПЭ в нейральном направлении у амфибий, разнообразны, имеют сходства и отличия, но до конца не определены. Это делает сопоставления затруднительными, однако, очевидно, что регуляционные сети при выборе разных стратегий трансдифференцировки имеют для амфибий и млекопитающих свои специфические динамические паттерны.

ИЗМЕНЕНИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛАНДШАФТА В ХОДЕ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РПЭ У АМФИБИЙ И ПАТОЛОГИИ СЕТЧАТКИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Как мы видим, ключевым и в настоящее время хорошо документированным событием трансдиффренцировки РПЭ у амфибий является репрограммирование, переключение генной программы, обеспечивающей эпителиальную, меланогенную дифференцировку, на программу, приводящую к нейральной и глиальной дифференцировкам. Каким образом осуществляется регуляция репрограммирования со стороны эпигенома – вопрос детального изучения в будущем. В настоящее время есть понимание того, что существенную роль в уровне экспрессии тех или иных генов играет динамическая композиция хроматина (Venters, Pugh, 2009; Chen, Dent, 2014). Характер перестроек хроматина при репрограммировании РПЭ тритона и их роль в активации транскрипционной программы, обеспечивающей ретиногенную дифференцировку изучен предварительно. Мы предприняли попытку охарактеризовать состояние хроматина в начале конверсии РПЭ тритона при разобщении РПЭ и НС, вызванном облучением сетчатки ярким светом или механической отслойкой (Маркитантова и др., 2015; Николаев и др., 2017). Данные свидетельствуют о том, что на 7–10-й дни после разобщения РПЭ и НС в вымещающихся из слоя клетках РПЭ, происходит реорганизация хроматина, очевидная на окрашенных полутонких срезах, при сравнении с клетками, сохраняющимися в слое РПЭ (рис. 3). В ядрах клеток в слое РПЭ наблюдалось диффузное распределение небольших локусов компактизации, прикрепленных к ядерной мембране (пристеночный гетерохроматин). В вымещающихся клетках РПЭ имело место увеличение объемов компактизованного хроматина (прицентромерный гетерохроматин), менялось соотношение конденсированного и диффузного хроматина в пользу первого, происходило центробежное его смещение, снижалось число компактизованных областей хроматина при увеличении их объемов, имел место фолдинг ядерной мембраны (Маркитантова и др., 2015). Всем этим изменениям была дана количественная оценка при использовании программ компьютера (Николаев, 2018). Описанные изменения, как известно, не предусматривают активной транскрипции, но напротив, свидетельствуют о репрессии этого процесса (Popova, Barnstable, 2019). Мы предполагаем, что обнаруженные нами изменения хроматина и ядерной мембраны в репрограммируемых клетках РПЭ тритонов связаны с ответом на клеточный стресс, уходом от клеточной гибели и подготовкой к пролиферации. Помимо событий, связанных с реорганизацией хроматина, известно также, что в РПЭ взрослых тритонов присутствует экспрессия кодируемого геном Ns нуклеостемина, регулятора транскрипционной активности, характерного для стволовых и малодифференцированных клеток, маркера пролиферации (Maki et al., 2009; Маркитантова и др., 2014, 2015). Работа гена Ns в ткани РПЭ также является эпигенетическим пререквизитом высокой пластичности их дифференцировки при регенерации in vivo (Маркитантова и др., 2014).

В исследовании эпигенетического ландшафта клеток нативного РПЭ взрослых мышей Дворянчикова и соавторы (Dvoriantchikova et al., 2019) опирались на факты о свойствах ретинальных прогениторов, общих для РПЭ и НС, развивающихся из общего зачатка (Лопашов, Строева, 1961; Chow, Lang, 2001; Graw, 2010). Возникло предположение, что клетки РПЭ взрослых мышей могут сохранять сходства эпигенома, присущие ретинальным предшественникам. Авторам (Dvoriantchikova et al., 2019) удалось показать, что состояние метиломов в клетках РПЭ эмбрионов и взрослых мышей, действительно, сходно: большинство промоторов генов находится в открытом (активном) хроматине, характерном для эпигенетически мобильных стволовых и прогениторных клеток. В то же время детальный анализ метилирования генов, ответственных за спецификацию ретинальных фенотипов, указал на локализацию промоторов генов, контролирующих дифференцировку не фоторецепторных нейронов, в репрессированных участках хроматина, находящихся в неметилированных (слабо метилированных) его областях. По мнению авторов (Dvoriantchikova et al., 2019), активация этих генов возможна в присутствии “пионерских” ТФ, способных инициировать транскрипционные события в закрытом хроматине. В то же время большинство генов, ответственных за фоторецепторную дифференцировку, оказались высоко метилированы. Таким образом, деметилирование регуляторных элементов фоторецепторных генов – второй механизм, необходимый для реализации конверсии клеток РПЭ в ретинальном направлении. Предполагается, что оба механизма (работа пионерских ТФ и деметилирование регуляторных элементов фоторецепторных генов) присущи РПЭ амфибий и работают при регенерации сетчатки после повреждения (Dvoriantchikova et al., 2019). Не исключено также, что у тритонов, исходно обладающих ювенильными свойствами (Григорян, 2016; Grigoryan, 2021) понижение уровня дифференцировки в ходе репрограммирования, не требует масштабных модификаций работы генов, при одновременном наличии пермиссивного для быстрого переключения программ эпигеноме. Подтверждением этого предположения может быть упомянутая выше, обнаруженная нами в нативных клетках РПЭ тритонов совместная работа генов, кодирующих признаки как исходной, так и новой дифференцировок (Grigoryan, Markitantova, 2016). Роль ТФ, обладающих свойствами “пионерских”, то есть способных индуцировать прямое репрограммирование клеток РПЭ человека, обсуждается в обзоре Ржановой и соавторов (2020). Авторы предполагают, что терминально дифференцированный РПЭ млекопитающих богат эпигенетическими регуляторными механизмами, жестко фиксирующими специфические паттерны экспрессии генов (Ржанова и др., 2020).

У млекопитающих и человека нарушения состояния хроматина и изменения эпигенетической регуляции работы генов при многих заболеваниях приводят к использованию патологических программ экспрессии генов, в том числе кодирующих ферменты, отвечающие за модификации ДНК и гистоновых белков, в свою очередь определяющих архитектуру хроматина (Mirabella et al., 2016; Popova, Barnstable, 2019; Basinski et al., 2021). Врожденные нарушения в сетчатке млекопитающих, такие как микрофтальмия, анофтальмия и колобома ассоциируются с изменениями в работе регуляторных генов, кодирующих ТФ (Markitantova, Simirskii, 2020), а также генов, кодирующих эпигенетические белки, в свою очередь, реорганизующие хроматин (Oliver et al., 2016; Basinski et al., 2021). Накоплена информация об эпигенетических изменениях и их связи с ТФ и о последствиях этой связи в ходе ЭМП. Однако, внимание в основном уделено случаям ЭМП при развитии опухолей (Wang, Shang, 2013; Sun, Fang, 2016). Если опираться на эту информацию в совокупности с полученной на моделях РПЭ-зависимой патологии НС, а также в экспериментах in vitro, становится ясно, что программа конверсии РПЭ при ЭМП в ходе развития ПВР регулируется как ТФ, так и эпигенетическими изменениями. Последними являются – метилирование ДНК, модификации гистонов, а также микроРНК (miRNAs), способные ингибировать трансляцию ряда генов. В патогенезе ПВР выявлена важная роль miR-29b, осуществляющей негативную регуляцию Akt2 сигнального пути (Li et al., 2016). Определена роль ингибитора деацетилазы гистонов (HDACi) – трихостатина, ингибирующего канонический сигнальный путь Smad и сигнальные пути Jagged/Notch, PI3K/Akt, и MAPK/ERK1/2. Ингибитор устранял TGFβ-индуцированные морфологические изменения клеток РПЭ человека в мезенхимном направлении и предотвращал up-регуляцию α-SMA, FN, коллагена I и IV типов (Xiao et al., 2014). Попытки воздействия с помощью miRNA на ключевые, определяющие ЭМП сигнальные пути, были сделаны на культуре клеток линии ARPE-19 человека (Fuches et al., 2020). TGFβ, активирующий сигнальные белки SMAD2 и SMAD3, воздействует на активность ряда генов, среди которых VEGFA. Ингибируя этот процесс, Fuchs et al. (2020) использовали miR-302d и miR-93, способные регулировать сигнальный путь TGFβ на разных уровнях. miR-302d и miR-93 направляли TGFβ-зависимую конверсию клеток ARPE-19 в мезенхимном направлении вспять, возвращая клеткам ARPE-19 признаки эпителиальной дифференцировки. Предполагается, что данный подход в дальнейшем может быть использован при лечении ПВР (Fuchs et al., 2020).

Продолжается поиск молекулярных регуляторов детерминации эпителиальной судьбы РПЭ и ее переключения на путь мезенхимной или иной дифференцировки, с использованием современных методов анализа транскриптома, генома, протеома, что лежит в основе разработки перспективных подходов клеточной терапии для поддержания стабильности и жизнеспособности РПЭ (Alge et al., 2003; Pratt et al., 2008; Du et al., 2016; Saini et al., 2017; Boles et al., 2020). Возникновение ЭМ, полученных от пациентов с ПВР, связано с активацией сигнальных путей TGF-b и TNF-a (Asato et al., 2013; Roybal et al., 2018), которые синергетически могут активировать программу ЭМП в клетках РПЭ взрослого человека (RPESC). Повышение уровня TGF-b (Kita et al., 2008) и TNF-a (Korthagen et al., 2015) было отмечено в стекловидном теле пациентов с ПВР и коррелирует с тяжестью этого заболевания. Для выявления механизмов этих процессов предпринимаются попытки создания карты связанных эпигенетических и транскрипционных изменений в РПЭ в норме и в случае ЭМП (Choudhary et al., 2015). Показано, что наиболее заметные эпигеномные изменения, сопровождающие ЭМП, связаны с усилением меток активного хроматина на многих элементах энхансеров предполагаемых мишеней связывания с ТФ – ключевыми кандидатами, которые могут быть вовлечены в регуляцию этого процесса. При сопоставлении данных анализа эпигенома и транскриптома РПЭ в норме и после обработки факторами TGF-b1 и TNF-a, был идентифицирован ландшафт регуляции генов, сопровождающий ЭМП. Ранее установлено, что в клетках РПЭ, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека и индуцированных в направлении ЭМП, происходит ингибирование пути TGF-b, и развитие воспалительных процессов, после обработки никотинамидом (NAM, производное витамина B3) (Saini et al., 2017). Воздействие NAM на RPESC-RPE взрослого человека, усиливающее эпителиальный фенотип, предотвращает ЭМП трансформацию и рассматривается в качестве способа терапии пациентов с ЭМ (Schiff et al., 2019). Среди эффективных стратегий, направленных на подавление сигнальных путей, вовлеченных в патологию РПЭ, рассматривается модуляция передачи сигналов RhoA/Rho-kinase, Smad или MAPK (Saika et al., 2009; Yan et al., 2009). Другие подходы предполагают блокирование экспрессии ALK5, что эффективно подавляет развитие фиброза (Ishida et al., 2006; Pannu et al., 2007), ингибирование ключевых факторов ангиогенеза (Fernґandez-Robredo et al., 2014) и деацетилазы гистонов (Xiao et al., 2014).

Подводя итоги, можно констатировать, что РПЭ низших и высших позвоночных животных обладает высокой степенью пластичности, проявляющейся в способности к смене клеточного типа – трансдифференцировке. При наблюдении за этим процессом in vivo, мы обнаруживаем две различные стратегии поведения: конверсию в нейрональном и глиальном направлении при регенерации сетчатки у амфибий и в мезенхимном при патологии сетчатки у млекопитающих и человека. В направленных условиях in vitro РПЭ млекопитающих раздвигает рамки этих возможностей, демонстрируя конверсию в фенотипы, несущие пронейральные признаки. В основе механизмов конверсии in vivo в обеих стратегиях можно обнаружить сходство, например, в инициации процесса и сопряженных с нею изменений цитоскелета и ВКМ, в пролиферативной активности, способности к миграции клеток РПЭ. Однако имеет место ряд существенных отличий, прежде всего, в молекулярно-генетических регуляционных механизмах: работе ТФ, ростовых факторов и цитокинов, компонентов сигнальных путей, а также в отличающемся эпигенетическом ландшафте. Отметим, что все три ключевые системы регуляции находятся в динамическом взаимодействии. В этой связи, опора на одну из перечисленных систем вряд ли может помочь в понимании того, каким образом можно экспериментально менять стратегии конверсии РПЭ. В этой связи дальнейшие исследования биологии клеток РПЭ, феномена трансдифференцировки РПЭ, и связи ключевых регулирующих ее разноуровневых событий, необходимы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данном обзоре, посвященном памяти О.Г. Строевой и В.И. Миташова, приведены полученные с помощью современных методов свидетельства, подтверждающие ранее заложенную ими в основе работы гипотезу о “переключении работы генов”, как базового явления процесса клеточной конверсии. За последние два десятилетия, осуществлены исследования, раскрывающие сложные молекулярные механизмы явления. Обнаружены ключевые гены и белки, определяющие исходную меланогенную, эпителиальную дифференцировку РПЭ и вновь возникающие при конверсии нейральную, глиальную и спектр мезенхимных дифференцировок как in vivo, так и in vitro. Определены системы внутриклеточных перестроек цитоскелета, клеточной поверхности и ВКМ, а также изменения молекулярных межклеточных взаимоотношений в слое РПЭ и с прилежащими тканями за его пределами. Выявлены регуляторные механизмы процесса конверсии РПЭ в терминах работы цитокинов, ростовых факторов и их сигнальных путей. И, наконец, начаты исследования изменений эпигенетического ландшафта и других условий экспрессии генов в ходе конверсии клеток РПЭ, в перспективе открывающих возможность экспериментального “переключения работы генов”. По-видимому, этот аспект изучения процесса трансдифференцировки, как и дальнейшее выстраивание сетей его регулирования, а также поиск их ключевых молекулярных участников – представляет собой логическое продолжение направления, заложенного в свое время О.Г. Строевой и В.И. Миташовым. Параллельные исследования стратегии трансдифференцировки клеток РПЭ в мезенхимном направлении у млекопитающих in vivo дают возможность не только сопоставления двух различных молекулярных стратегий РПЭ (ведущих к регенерации сетчатки у амфибий и патологии у млекопитающих), но и для попытки моделирования условий, пермиссивных для регенерации сетчатки и запрещающих развитие патологии.

Исследование регенерации сетчатки за счет РПЭ имеет и другие важные точки современных приложений. Оно необходимо для понимания способов репрограммирования in vivo (naturally regulated reprogramming), способов индукции мультипотентности, а также способов обретения клетками полноценной, стабилизированной нейральной дифференцировки. Важно, что клетки РПЭ у Urodela и высших позвоночных обнаруживают сходство по многим своим свойствам, а потому дальнейшее изучение и понимание сходств и отличий на молекулярном уровне двух различных стратегий конверсии клеток, имеющих один и тот же фенотип, более чем уместно. Оно, в свою очередь, требует введения в обиход дополнительных современных методов изучения, в том числе исследования транскриптомов отдельных клеток в динамике развития процесса трансдифференцировки, методов определения и индукции генетической и эпигенетической модификаций и других.