Онтогенез, 2022, T. 53, № 1, стр. 46-57

ВВЕДЕНИЕ

Исследование молекулярных механизмов развития органов млекопитающих является актуальной задачей современной биологии. Решение этой задачи перспективно не только для фундаментальной науки, но и для выявления причин возникновения различных патологий (Sassin, 2018, 2020). В связи с этим все более важным становится изучение тонких механизмов функционирования протеасом, мультисубъединичных протеаз, участвующих в поддержании гомеостаза белков и регулирующих многочисленные клеточные процессы. Протеасомы образуют биологически активные пептиды, гидролизуют факторы роста, рецепторы, транскрипционные факторы, компоненты сигнальных путей и другие белки (Abramova et al., 2002; Spirina et al., 2013; Kondakova et al., 2020). Многообразие функций протеасом обеспечивается множественностью их форм, основанной на структурных различиях и способах гидролиза белков.

Наименьшей функциональной структурой является 20S коровая субчастица протеасом, доступ в которую для белковых субстратов, как правило, заблокирован. Тем не менее, 20S субчастица сама по себе способна утилизировать белки, поврежденные окислительным стрессом, и ряд иных белков (Davies, Shringarpure, 2006; Voigt et al., 2007; Raynes et al., 2016). Проникновение большинства белков в протеолитическую камеру протеасом обеспечивают активаторы 19S (PA700), 11S (PA28αβ, PA28γ), PA200, образующие крупные комплексы при соединении с 20S субчастицей (Tanaka, 2009; Stadtmueller, Hill, 2011; Kish-Trier, Hill, 2013). Активатор 19S способен распознавать, захватывать и пропускать в протеолитическую камеру белки, меченные убиквитиновой цепочкой, за счет своей многофункциональной мультисубъединичной структуры. В отличие от активатора 19S, регуляторы 11S и РА200, как правило, не пропускают в протеолитическую камеру полноразмерные убиквитинированные белки, но открывают вход для полипептидов среднего и малого размеров без предварительного их убиквитинирования.

По набору протеолитически активных субъединиц пул протеасом можно разделить на конститутивные протеасомы или протеасомы “домашнего хозяйства”, содержащие субъединицы β1, β2 и β5, и несколько субтипов иммунных протеасом, встраивающих иммунные субъединицы LMP2 (β1i), LMP10 (MECL1, β2i) и LMP7 (β5i) вместо конститутивных субъединиц либо полностью, либо в различных сочетаниях с ними (Groettrup et al., 1997; Griffin et al., 1998; Guillaume et al., 2010; Dahlmann, 2016). Конститутивные субъединицы β1, β2 и β5 проявляют соответственно каспазаподобную (КП), трипсинподобную и химотрипсинподобную (ХТП) активность, при замене конститутивных субъединиц на иммунные увеличивается ХТП и трипсинподобная активность и уменьшается КП активность. Если основная функция конститутивных протеасом заключается в выполнении рутинного белкового обмена и устранении поврежденных белков, то иммунные протеасомы, образуя специфические пептиды, регулируют развитие и подавление иммунных реакций, клеточную пролиферацию, адаптивные процессы (Caudill et al., 2006; Sharova, 2006; Tanaka, 2009; Lyupina et al., 2013; Erokhov et al., 2017; Astakhova et al., 2019).

Иммунные протеасомы настолько важны для развития организма, что образование их начинается уже в эмбриональный период в тимусе, селезенке, печени (Melnikova et al., 2008; Sharova et al., 2009; Melnikova et al., 2010; Karpova et al., 2013). Динамика экспрессии иммунных протеасом в развитии этих органов различна, что обусловлено разницей в их клеточном составе и функциях. В тимусе крысы экспрессия иммунных протеасом выходит на максимальный уровень уже на 21-й эмбриональный день в связи с обеспечением ими начинающегося в этот период процесса отрицательной селекции тимоцитов (Melnikova et al., 2008, 2010). В развивающихся селезенке и печени крысы уровень иммунных протеасом увеличивается в течение трех постнатальных недель. В селезенке этот процесс осуществляется последовательно в тесной связи с постепенным формированием белой пульпы. В печени нарастание экспрессии иммунных протеасом носит волнообразный характер: первая волна совпадает с функционированием печени как первичного лимфоидного органа, а вторая – с экспрессией иммунных протеасом в гепатоцитах (Sharova et al., 2009; Karpova et al., 2013). Очевидно, что низкое количество иммунных протеасом в гепатоцитах в первые две постнатальные недели неспособно обеспечить эффективное образование антигенных эпитопов для молекул главного комплекса гистосовместимости класса I в случае инфицирования и инициировать полноценный иммунный ответ. Согласно полученным данным, такой ответ возможен на третьей постнатальной неделе, когда, во-первых, гепатоциты уже обладают базовым уровнем иммунных протеасом и, во-вторых, сформирована белая пульпа селезенки клетками иммунной системы, обогащенными иммунными протеасомами. Начиная с этого периода клетки печени способны сигнализировать иммунной системе о синтезе ими чужеродных белков, а клетки белой пульпы селезенки способны реагировать на эти сигналы.

Несмотря на достигнутые успехи в выявлении протеасомных механизмов развития ряда органов, не изучен пул протеасом, включающий различные структурные формы, в эмбриональном и раннем постнатальном онтогенезе кишечника, выполняющего важнейшие функции не только в пищеварении, но и в иммунных процессах. Цель настоящей работы – исследовать, каким образом различные периоды раннего развития тонкого кишечника крысы связаны с изменениями в пуле протеасом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Работу выполняли на крысах породы Вистар в соответствии с положениями Комиссии по биоэтике ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Для исследования использовали целый кишечник плодов на 18-й день эмбрионального развития (Э18), тонкий кишечник самок на Э21 и постнатальные дни П0 (день рождения), П1, П5, П8, П12, П15, П18, П22, П30, а также тонкий кишечник самцов на Э21, П0, П30.

Антитела и основные реактивы. Для Вестерн-блоттинга использовали моноклональные антитела мыши к субъединицам α1,2,3,5,6,7 протеасом, иммунным субъединицам LMP2 и LMP7 протеасом, субъединице Rpt6 активатора РА700 протеасом, поликлональные антитела кролика к субъединице РА28α активатора РА28αβ протеасом (Enzo Life Sciences, США), моноклональные антитела мыши к β-актину (Santa Cruz Biotechnology, США), антитела козы к IgG мыши и кролика, конъюгированные с пероксидазой (Amersham Biosciences, Великобритания).

Для определения ХТП активности протеасом использовали субстрат N-succinyl-leu-leu-val-tyr-7-amido-4-methyl coumarin (Suc-LLVY-AMC), КП активности – субстрат Z-Leu-Leu-Glu-7-amido-4-methyl coumarin (Z-LLE-AMC) (Sigma-Aldrich, США), LMP2 и LMP7 активности – субстраты Ac-Pro-Ala-Leu-AMC (Ac-PAL-AMC) и Ac-Ala-Asn-Trp-AMC (Ac-ANW-AMC) (Boston Biochem, США) соответственно. Наличие примесных протеаз выявляли с помощью ингибитора протеасом Z-leucyl-leucyl-leucinal (MG132) (Sigma-Aldrich, США).

Препарирование кишечника и приготовление осветленных гомогенатов. Выделенный орган (целый кишечник или тонкий кишечник) погружали в фосфатный солевой буфер (PBS, рН 7.4), содержащий 1 мМ фенилметилсульфонил фторид (PMSF) для ингибирования активности протеаз внутрикишечной полости. Все дальнейшие процедуры, связанные с очисткой кишечника от соединительнотканных пленок и внутриполостного содержимого, проводили в PBS с 1 мМ PMSF. Образцы очищенного кишечника обсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и замораживали при температуре −70°С.

Для определения активности протеасом in vitro и Вестерн-блоттинга запасенные образцы размораживали, гомогенизировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ АТФ, 1 мМ PMSF, лейпептин (0.5 мкг/мл), пепстатин (1 мкг/мл), апротинин (1 мкг/мл), в соотношении 1 : 6 (вес : объем) при 0°С и осветляли центрифугированием при 15400 g и 4°С в течение 30 мин. Надосадочную жидкость (осветленные гомогенаты) использовали для дальнейших исследований.

Для нативного электрофореза образцы гомогенизировали в буфере, содержащем 50 мМ Na-HEPES, pH 7.5, 200 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА, в соотношении 1 : 3 (вес : объем).

Определение активности протеасом in vitro. Реакцию проводили в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 1 мМ дитиотреитол, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ АТФ, 30 мкМ соответствующего флуорогенного субстрата и 2 мкл осветленного гомогената, при 37°С в течение 20 мин и останавливали 1%-ным SDS. В данных условиях зависимость количества образующегося продукта от времени соответствовала прямолинейному участку графика (Erokhov et al., 2017). Интенсивность флуоресценции регистрировали на флуориметре (Bio-Rad, США) при длине волны возбуждения 380 нм и длине волны испускания 440 нм. Для оценки активности примесных протеаз использовали ингибитор активности протеасом MG132 в концентрации 5–10 мкМ.

Определение активности протеасом в неденатурирующем геле. Активность протеасом в градиентном 4–10% полиакриламидном геле (5 мкл осветленного гомогената или 70–90 мкг белка на дорожку) в нативных условиях определяли с использованием 300 мкМ флуорогенного субстрата в 200 мM Na-HEPES буфере, pH 7.5 (1/20 от объема геля) после электрофореза при 60 В в течение 14 ч, 140 В в течение 10 ч и 260 В в течение 20 ч (Erokhov et al., 2017). Следует отметить, что описанные в литературе протоколы нативного электрофореза применяются, как правило, для очищенных фракций протеасом или для разделения протеасом клеточных линий (Lyupina et al., 2013). При использовании грубых фракций, полученных из целых органов, содержащиеся в них нуклеиновые кислоты, микросомы, мелкие фрагменты соединительной ткани препятствуют проникновению белков с высокой молекулярной массой в гель и представляют собой основную проблему электрофореза. В условиях стандартного начального напряжения 140 В протеасомы, неспецифически связанные с нуклеиновыми кислотами или микросомами, “размываются” по гелю, начиная со стартовой позиции. Мы решили эту проблему главным образом путем снижения начального напряжения до 60 В и поэтапным его увеличением до 260 В (Erokhov et al., 2017).

Флуоресцентные полосы в геле фотографировали при 365 нм. Анализ активности протеасом в геле осуществляли с помощью стандартной программы ImageJ.

Вестерн-блоттинг. После электрофореза в денатурирующих условиях в 13% полиакриламидном геле (10 мкл осветленного гомогената или 60–78 мкг белка на дорожку), полипептиды переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану с помощью полусухого блоттинга. Обработку мембраны осуществляли стандартным методом с использованием первых антител к субъединицам α1,2,3,5,6,7, LMP7, LMP2, β-actin (1 : 1000), Rpt6 или PA28α (1 : 1500) и соответствующих вторых антител, конъюгированных с пероксидазой (1 : 2000). Изображение анализировали с помощью стандартной программы ImageJ, как описано ранее (Astakhova et al., 2018).

Результаты нормализовали на содержание β-актина. Несмотря на добавление коктейля ингибиторов протеаз в гомогенизирующий буфер, β-актин не детектировался во фракциях тонкого кишечника на П3–П8, но в них выявлялся полипептид меньшей молекулярной массы, который взаимодействовал с антителами к β-актину. Этот результат указывал на отщепление части молекулы β-актина в приготовленных образцах. Добавление ингибитора протеасом MG132 в концентрации 5 мкМ к гомогенизирующему буферу подавляло расщепление β-актина. Очевидно, при приготовлении образцов тонкого кишечника на П3–П8 имела место модификация молекулы β-актина, которая делала ее доступной для протеасом. Поэтому протокол определения количества β-актина предусматривал введение в гомогенизирующий буфер ингибитора протеасом MG132 в концентрации 5 мкМ.

Статистический анализ. Статистический анализ проводился в пакете программ GraphPad Prism 8.0 с использованием статистических методов: Brown-Forsythe ANOVA, Welch ANOVA, Kruskal-Wallis тест и two-way ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Активность протеасом в раннем онтогенезе тонкого кишечника крыс. Исследована ХТП и КП активность протеасом, проявляемая в совокупности конститутивными и иммунными субъединицами β5 + LMP7 и β1 + LMP2 соответственно, а также индивидуальная активность иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 в раннем онтогенезе тонкого кишечника. Проведено детальное исследование этих типов активности у самок крыс в эмбриональный период (на Э21) и в первый месяц постнатального развития. На Э18 половую принадлежность у плодов идентифицировать невозможно, так же как и вычленить тонкий кишечник. Поэтому на Э18 анализировали активность протеасом целого кишечника плодов крыс безотносительно пола.

Выявлено, что все исследуемые типы активности протеасом изменяются в раннем развитии, при этом обнаруживаются как сходные характеристики, так и различия (рис. 1). Сходство проявляется в следующем. Во-первых, вся исследуемая активность повышались после Э18 и достигала максимума на П5–П15. Такая динамика логична, так как переход организма от in utero к ex-utero сопровождается значительными перестройками в кишечнике: изменением кровотока и роста, развитием пищеварительной и иммунной функций, колонизацией микроорганизмами и адаптационными процессами (Nanthakumar et al., 2000; Claud et al., 2003). Во-вторых, сходство заключается в уменьшении всей исследуемой активности к П22. Очевидно, в этот период нет потребности кишечника в высокоактивных протеасомах. Разница касается следующего. Во-первых, ХТП и LMP7 активность падала к П22 в существенно меньшей степени по сравнению с КП и LMP2 активностью. Во-вторых, к П30 только ХТП и LMP7 активность вновь возрастала до максимальных уровней. Отметим, что к П30 животные были изолированы от матери и адаптировались к внешнему питанию. Очевидно, эта адаптация требует высокой ХТП и LMP7 активности.

Рис. 1.

Динамика активности протеасом в раннем онтогенезе тонкого кишечника самок крыс. Активность приведена для 100 мкл осветленных гомогенатов и представлена как среднее ± стандартное отклонение, n = 6, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001. ХТП активность – химотрипсинподобная активность, КП активность – каспазаподобная активность, Э – эмбриональный день, П – постнатальный день. На Э18 использовали целый кишечник плодов крыс безотносительно пола.

Особый вопрос в исследовании кишечника касается вклада в детектируемую активность протеасом активности бактериальных протеасом. Несмотря на проводимую нами обязательную процедуру отмывания внутренней полости кишечника, следует учитывать наличие в ней несмываемой части бактериальной флоры. В отличие от клеток эукариот прокариоты проявляют всего лишь один тип активности протеасом, бортезомиб-чувствительную активность (Risa et al., 2020). Поскольку бортезомиб – ингибитор ХТП активности протеасом эукариот, нельзя полностью исключить, что бактерии могут вносить вклад в эту активность, хотя используемый в данной работе субстрат для них не оптимален. Тем не менее, если этот вклад и имеет место, он незначителен и не может существенно исказить выявленную динамику, подтверждением чему служит сходство графиков для ХТП и LMP7 активности (рис. 1), последняя из которых присуща только млекопитающим.

Таким образом, выявлены переломные временные точки в динамике активности протеасом тонкого кишечника самок крыс. Для всех исследованных типов активности это перинатальный период, Э21 и/или П0. Кроме того, для ХТП и LMP7 активности детектирована дополнительная переломная точка, П30 (рис. 1). К П30 у самок крыс изменяется гормональный фон, и к П32–П33 наступает стадия первого проэструса (Vidal, 2017). Для оценки влияния фактора пола на образование переломных точек проведено сравнительное исследование активности протеасом тонкого кишечника самок и самцов крыс на Э21, П0 и П30. Оказалось, что фактор пола не оказывает влияния на активность протеасом в указанные переломные периоды (рис. 2).

Рис. 2.

Активность протеасом тонкого кишечника самцов и самок крыс в разные периоды раннего онтогенеза. Активность приведена для 100 мкл осветленных гомогенатов и представлена как среднее ± стандартное отклонение, n = 5. ХТП активность – химотрипсинподобная активность, КП активность – каспазаподобная активность, Э – эмбриональный день, П – постнатальный день.

Что в таком случае обеспечивает выявленную нами сложную динамику протеасомной активности в развивающемся кишечнике крысы? Ранее было показано, что активность протеасом может определяться различными факторами, к числу которых относятся общее количество протеасом, сочетание протеолитических субъединиц, наличие того или иного регулятора, окислительный стресс и др. (Tanaka, 2009; Astakhova et al., 2018; Erokhov et al., 2021). В настоящей работе мы исследовали уровень тотального пула протеасом и динамику содержания в нем иммунных субъединиц и активаторов в сравнении с динамикой активности протеасом.

Содержание субъединиц протеасом и активаторов в раннем онтогенезе тонкого кишечника крыс. Уровень тотального пула протеасом оценивали по содержанию субъединиц α1,2,3,5,6,7, входящих в состав всех субтипов протеасом. Изменение количества активатора 19S изучали по содержанию входящей в его состав субъединицы Rpt6, а активатора PA28αβ – по содержанию субъединицы PA28α. Изменение количества иммунных протеасом исследовали по содержанию иммунных субъединиц LMP7 и LMP2. Иммунная субъединица LMP10 встраивается в протеасомы, как правило, совместно с субъединицей LMP2 (Groettrup et al., 1997; Griffin et al., 1998), поэтому отдельно уровень LMP10 субъединицы не изучали.

Уровень тотального пула протеасом тонкого кишечника самок крыс достоверно не изменялся в перинатальный период и на протяжении первого месяца постнатального развития (рис. 3, 4) и не мог повлиять на активность протеасом. Вместе с тем, на фоне постоянного количества протеасом произошли перестройки в их структуре за счет увеличения содержания протеолитических иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 (рис. 3, 4) и, следовательно, LMP10, замещающих протеолитические конститутивные субъединицы. Причем наиболее значимый “скачок” в содержании иммунных субъединиц, подобно протеасомной активности, выявлен на Э21 и П0. Таким образом, дополнительная наработка иммунных протеасом может быть одним из факторов, способствующих существенному повышению активности в перинатальный период. Дальнейшее развитие кишечника с П1 по П30 сопровождалось более плавным повышением количества иммунных субъединиц с достоверным “провалом” на П22 в графике для LMP7 (рис. 4). Эта динамика похожа на динамику ХТП и LMP7 активности и может служить ее обоснованием.

Рис. 3.

Вестерн-блоты субъединиц протеасом и активаторов в разные периоды раннего развития тонкого кишечника самок и самцов крыс с использованием соответствующих антител. Указана локализация в геле маркеров молекулярной массы. В качестве внутреннего контроля использован β-актин. Э – эмбриональный день, П – постнатальный день. На Э18 использовали целый кишечник плодов крыс безотносительно пола.

Рис. 4.

Динамика содержания субъединиц протеасом и активаторов в тонком кишечнике самок крыс в раннем развитии. За 100% принимали значения на П30. Данные нормализованы на содержание β-актина и представлены как среднее ± стандартное отклонение, n = 5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001. Э – эмбриональный день, П – постнатальный день. На Э18 использовали целый кишечник плодов крыс безотносительно пола.

Отметим, что замена конститутивных протеолитических субъединиц иммунными субъединицами приводит к увеличению ХТП активности и уменьшению КП активности (Tanaka, 2009). Возможно, количество субъединицы LMP2 на П18–П30 стало достаточно высоким для того, чтобы объяснить падение КП активности в этот период. Нельзя исключить в данном случае и наличие иных регуляторов. Вместе с тем, остается непонятным падение LMP2 активности на П18–П30 по сравнению с П15, динамика которой именно в эти дни не соответствует динамике количества самой субъединицы. Очевидно, в кишечнике существуют дополнительные факторы, подавляющие LMP2 активность. Мы полагаем, что к ним можно причислить выявленное в данной работе уменьшение содержания активатора PA28αβ после П18 (рис. 3, 4).

Динамика содержания активатора PA28αβ (но не активатора 19S) в раннем развитии тонкого кишечника крысы оказалась разнонаправленной. С Э18 до П15 количество этого активатора четырехкратно увеличилось, что может быть связано с его участием в развитии адаптивных процессов и образовании регуляторных пептидов. Содержание активатора 19S, напротив, не менялась (рис. 3, 4). Очевидно, исходный уровень 19S активатора, свойственный эмбриональному периоду, достаточен для осуществления основных его функций – обеспечения устранения поврежденных убиквитинированных белков и убиквитинзависимого рутинного белкого обмена в тонком кишечнике в течение первого месяца постнатального развития.

Количество всех исследуемых субъединиц протеасом и активаторов в переломные временные точки, Э21, П0 и П30, выявленные для активности, было одинаково у самок и самцов (рис. 3), что указывает на независимость протеасомной системы в целом от половых различий, по крайней мере, в указанные периоды.

Следует отметить, что ранее были обнаружены иммунные субъединицы протеасом в кишечнике крысы, начиная с 3-й недели постнатального развития (Claud et al., 2014). Нам же удалось детектировать их, начиная с эмбрионального периода. Такая разница в результатах связана, на наш взгляд, с анализом разных фракций протеасом. Авторы приведенной работы исследовали очищенную фракцию 26S протеасом. Мы изучали грубую фракцию протеасом – осветленный гомогенат, обогащенный цитоплазматическими формами протеасом, в том числе формами, включающими иммунные субъединицы. На следующем этапе работы мы разделили формы протеасом развивающегося кишечника и проанализировали активность, с ними связанную.

Распределение активности протеасом тонкого кишечника крыс в неденатурирующем геле. Протеасомы разделяли с помощью метода нативного электрофореза, разработанного нами для грубых фракций (Erokhov et al., 2017). Для исследования выбрали два периода: П3 – один из первых дней развития животных вне материнского организма и П15 – период высокой активности протеасом и содержания иммунных субъединиц и активатора PA28αβ. Формы протеасом идентифицировали по их локализации в геле в соответствии с опубликованными ранее результатами (Erokhov et al., 2017).

Как на П3, так и на П15 в кишечнике выявлены три формы протеасом, 20S-19S, 20S-PA28αβ и 20S, которые проявляли все четыре исследуемые типа активности, но в разной степени (рис. 5). ХТП активность в большей мере была связана со структурами 20S-19S и 20S-PA28αβ, активность субъединицы LMP7 была распределена между всеми структурами протеасом равномерно (рис. 5, табл. 1). Вместе с тем, КП и LMP2 активность детектировалась, в основном, во фракции 20S (рис. 5, табл. 1). Можно полагать, что такое распределение активности важно для образования биологически активных пептидов в несколько этапов. По-видимому, протеасомы 20S-19S, содержащие иммунные субъединицы, на первом этапе образуют из полноразмерных убиквитинированных белков полипептиды меньшего размера со специфической структурой, которые служат субстратами для 20S-PA28αβ и/или 20S протеасом. Последние на заключительном этапе, вероятно, образуют пептиды, непосредственно участвующие в межклеточных взаимодействиях и развитии адаптационных процессов и иммунной функции. Особая роль при этом, очевидно, принадлежит наиболее выраженной КП и LMP2 активности 20S протеасом.

Рис. 5.

Распределение активности протеасом тонкого кишечника самок крыс в неденатурирующем геле на П3 и П15. Тироглобулин (670 кДа), меченный красителем Cy-3.5, использован как маркер (М) молекулярной массы. ХТП активность – химотрипсинподобная активность, КП активность – каспазаподобная активность, П – постнатальный день.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в настоящей работе впервые показано, что в конце эмбрионального развития и на протяжении первого месяца постнатального развития в пуле протеасом тонкого кишечника крысы происходит смещение баланса в сторону увеличения доли иммунных протеасом. Если сравнить динамику уровня иммунных протеасом в развивающемся кишечнике с опубликованными ранее данными по развивающимся тимусу и селезенке (Melnikova et al., 2008; Karpova et al., 2013), то можно заключить, что кишечник занимает промежуточное положение между этими органами. В тимусе, первичном лимфоидном органе, содержание иммунных протеасом достигает максимума уже на Э21, что свидетельствует о начале процесса отрицательной селекции тимоцитов с участием иммунных протеасом в эмбриональном развитии. В селезенке, вторичном лимфоидном органе, основной прирост количества иммунных протеасом приходится на третью постнатальную неделю и совпадает с завершением формирования белой пульпы Т-лимфоцитами, обогащенными иммунными протеасомами. Кишечник является не только органом пищеварения, но и выполняет иммунную функцию за счет лимфоидной ткани слизистой оболочки. Функцию пищеварения кишечник приобретает сразу после рождения, что сопровождается его адаптацией к пищевым антигенам и заселяющей его микробиоте. К тому же, в этот период начинается формирование иммунной функции. Неудивительно, что резкий подъем количества иммунных протеасом, участвующих в адаптивных процессах и иммунных реакциях, обнаружен при переходе от in utero к ex-utero, на Э21 и П0 (рис. 3, 4). За этим подъемом следует менее значительное увеличение содержания иммунных протеасом в первый постнатальный месяц, что отличает кишечник и от тимуса, и от селезенки.

В настоящей работе обнаружены различные формы протеасом, 20S-19S, 20S-PA28αβ и 20S, проявляющие активность иммунных субъединиц, в развивающемся тонком кишечнике крысы (рис. 5). Не исключено, что каждая из этих форм объединяет субтипы иммунных протеасом с разным сочетанием протеолитически активных иммунных и конститутивных субъединиц. Иммунные протеасомы, по-видимому, экспрессируются в различных клетках тонкого кишечника, включая клетки эпителия и клетки лимфоидных скоплений, что обусловлено разнообразием функций множественных субтипов иммунных протеасом. Так, протеасомы, содержащие все иммунные субъединицы, образуют антигенные эпитопы для молекул главного комплекса гистосовместимости класса I. Субъединицы LMP7 и LMP10 важны для контроля клеточной пролиферации (Caudill et al., 2006). Протеасомы с субъединицами LMP2 и/или LMP7 играют роль в межклеточных взаимодействиях и адаптационных процессах (Lyupina et al., 2013; Erokhov et al., 2017).

Следует подчеркнуть, что баланс в клеточном пуле протеасом смещается в сторону увеличения количества иммунных протеасом и в опухолевом процессе, в том числе в развитии опухолей кишечника (Astakhova et al., 2017, 2020; Erokhov et al., 2021). Однако при опухолевом росте экспрессия LMP2-содержащих субтипов возрастает гораздо более значительно, чем экспрессия LMP7-содержащих субтипов. В развивающемся кишечнике динамика экспрессии LMP2 и LMP7 субъединиц, выявленная в настоящей работе, в основном, сходна (рис. 4), что является признаком нормального процесса.

Таким образом, можно заключить, что различные структуры протеасом с иммунными субъединицами, формирующиеся в раннем онтогенезе тонкого кишечника, играют важную роль в адаптации к микробиоте и изменяющимся условиям и рациону питания, а также в обеспечении нормальной клеточной пролиферации и становлении иммунной функции.