Онтогенез, 2022, T. 53, № 6, стр. 454-487

Канонический TGF-β сигнальный путь/TGF-β/Smad-зависимый сигнальный путь

Каждый лиганд семейства TGF-β связывается со специфической парой рецепторных серин/треонин протеинкиназ, принадлежащих к рецепторам I и II типа, оба из которых необходимы для трансдукции сигнала (рис. 1). Так факторы роста TGF-β связываются с TGFβR-I (другое название activin receptor-like kinase 5, ALK5) и TGFβR-II, а белки семейства BMP – с BMPR-I (BMPR-IА/ALK3, BMPR-IB/ALK6) и BMPR-II рецепторами. Соединение лиганда с рецептором II типа приводит к связыванию рецепторов I и II типа. В этом комплексе рецептор II типа вызывает фосфорилирование и активацию рецептора I типа. Рецептор I типа затем фосфорилирует рецептор-активируемые белки Smads: Smad2 и Smad3 в TGF-β сигнальном пути и Smad1, Smad5 и Smad8 в BMP сигнальном пути (Mitsuhiro et al., 2003; Xu et al., 2009). Фосфорилированные рецепторные белки Smads формируют гетеромерные комплексы с общим белком Smad4, и транслоцируются в ядро, где они взаимодействуют с ДНК-связанными транскрипционными факторами семейств SNAIL, zinc finger E-box-binding homeobox (ZEB) и basic helix-loop-helix (bHLH), которые регулируют ЭМП, активируя экспрессию генов мезенхимальной дифференцировки и подавляя экспрессию генов эпителиальной дифференцировки. ZEB1 и ZEB2 (также известный как SIP1) являются критическими транскрипционными факторами, репрессирующими экспрессию эпителиальных генов для запуска ЭМП. Показано, что избыточная экспрессия ZEB1 в первичных культурах РПЭ мыши приводит к ЭМП (Liu et al., 2010).

Рис. 1.

miRNAs в регуляции TGF-β сигнальных путей и контроле ЭМП при пролиферативных витреоретинальных заболеваниях. ЭМП – эпителиально-мезенхимальный переход; ALK5 – активин рецептор-подобная киназа 5 (англ. activin receptor-like kinase 5, другое название – TGF-β рецептор I типа, англ. TGFβR-I – TGF-β-receptor I); JNK – c-Jun N-терминальная киназа (англ. c-Jun N-terminal kinase); MEK или MKK – другие названия MAPK kinase; PI3K – фосфоинозитид-3-киназа (англ. phosphoinositide 3-kinases); P указывает на фосфорилирование. См. текст для других сокращений.

Сигнальные белки семейства TGF-β оказывают регуляторное влияние на ЭМП и могут обратить этот процесс вспять во время эмбрионального развития и нормального заживления ран. Однако повышение уровня TGF-β приводит к нарушению баланса между ЭМП и обратным переходом при патологических состояниях, таких как хроническое воспаление, что приводит к развитию фиброзных нарушений (Xu et al., 2009).

TGF-β и его посредник фактор роста соединительной ткани (англ. connective tissue growth factor, CTGF) – индукторы синтеза и аккумуляции белков ВКМ (фибронектина, ламинина, коллагена I типа) – являются ключевыми медиаторами в развитии ПВР и в трансформации РПЭ в фибробластоподобные клетки in vitro (Grisanti, Guidry, 1995; Zhu et al., 2013). При ПВР в аспиратах стекловидного тела с интраокулярным фиброзом содержится более чем в три раза больше TGF-β по сравнению с неосложненными формами отслоения сетчатки без интраокулярного фиброза (Connor et al., 1989). Кроме того, при ПВР в эпиретинальных мембранах наблюдается активация экспрессии Snail (SNAI1) (Li et al., 2011).

Обработка клеток РПЭ взрослого человека ранних пассажей стекловидным телом приводит к увеличение экспрессии мезенхимальных маркеров, а именно фибронектина и альфа-гладкомышечного актина (англ. alpha-smooth muscle actin, αSMA) (Huang et al., 2012). Воздействие TGF-β1 и CTGF на клетки ARPE-19 способствует схожим изменениям. В клетках увеличивается экспрессия таких компонентов ВКМ, как фибронектина, ламинина, MMP2 и коллагена I типа, что сопровождается снижением экспрессии E-кадгерина и ZO-1, а также усилением экспрессии Snail, как мРНК, так и белка. В самих клетках при этом происходит реорганизация цитоскелета: клетки экспрессируют αSMA и приобретают мезенхимальный фенотип (Lee et al., 2008; Li et al., 2011; Zhu et al., 2013). Подавление Snail значительно ослабляет TGF-β1-индуцированный ЭМП, что выражается в уменьшении экспрессии мезенхимальных маркеров (фибронектина, αSMA) и повышением эпителиальных маркеров (E-кадгерина, ZO-1) (Li et al., 2011).

TGF-β и активин А, кроме реорганизации цитоскелета, стимулируют миграцию клеток линии РПЭ человека D407 (линия получена из глазного яблока 12-летнего ребенка), которая происходит через TGF-β/Smad-зависимый сигнальный путь (Mitsuhiro et al., 2003). Нокдаун Snail приводит к эффективному подавлению миграции клеток ARPE-19 (Li et al., 2011). Таким образом, Snail также как и ZEB1 играет важную роль в TGF-β1-индуцированном ЭМП клеток РПЭ человека и может способствовать развитию ПВР. Специфическое ингибирование Snail может обеспечить новый подход к лечению и предотвращению ПВР.

Во многих работах, выполненных на нокаутных животных, показана существенная роль белков семейства BMP, в частности BMP4 и 7, в морфогенезе глаза (Dudley et al., 1995; Luo et al., 1995; Furuta, Hogan, 1998) и специализации РПЭ (Wordinger, Clark, 2007; Müller et al., 2007). Более подробно механизм передачи сигналов белков семейства BMP – от регуляции секреции, локализации и активации рецепторов до влияния на передачу сигналов – описан в обзоре Брэгдон и соавт. (Bragdon et al., 2011). Однако информации о роли белков BMP и его рецепторах во взрослом РПЭ в норме и патологии существует мало. Матхура и соавт. впервые определили экспрессию мРНК BMP4 и BMPR-II в свежевыделенных клетках РПЭ, в первичных культурах взрослого человека и постоянной линии ARPE-19 (Mathura et al., 2000). Авторами показано также, что экзогенное добавление BMP4 и BMP2 к культивируемым клеткам РПЭ ингибирует их пролиферацию. В последующих работах выявлено, что BMP4 дифференциально экспрессируется в макулярной области РПЭ пациентов с сухой и влажной ВМД, что зависит от микроокружения (Xu et al., 2011). Так при сухой форме ВМД отмечается увеличение экспрессии BMP4, а при влажной – снижение или даже отсутствие белка на иммуногистохимическом уровне в хирургически удаленных хориваскулярных мембранах (Zhu et al., 2009a). При сухой форме ВМД, по мнению авторов, ВМР4 опосредует окислительный стресс-индуцированное старение РПЭ и отвечает за повышенное содержание в них белка p53 (Zhu et al., 2009b). При влажной ВМД, как показано на модели CNV, вызванной лазерным повреждением сетчатки у мышей, уровень BMP4 обратно коррелирует с уровнем основного плейотропного воспалительного цитокина TNFα (Xu et al., 2011). Данный факт указывает на то, что TNFα ингибирует экспрессию BMP4 в клетках РПЭ во время активного развития CNV. Кроме того, добавление TNFα значительно снижало экспрессию BMP4 в культивируемых фетальных клетках РПЭ человека, ARPE-19 и клетках РПЭ в эксплантатах задней чаши глаза мыши (Xu et al., 2011). Таким образом, механизм подавления BMP4, выявленный Сюй и соавт., может быть полезным для определения новых мишеней для лечения ВМД.

Важную роль BMP белков в подавлении фиброза при ПВР показывают работы с использованием их антагонистов. Так, гремлин (англ. gremlin), один из антагонистов BMP белков, способствовал ЭМП в клетках ARPE-19, на что указывает повышение экспрессии αSMA и активности MMP2, подавление экспрессии ZO-1 и повышенная миграционная способность клеток (Lee et al., 2007). В дополнение к этому, недавние исследования демонстрируют важную роль BMP4 и ВМР7 в подавлении фиброза при ПВР (Yao et al., 2016, 2019). Так, добавление экзогенных BMP4 и BMP7 к первичным клеткам РПЭ ингибировало TGF-β-индуцированное подавление эпителиальных маркеров (ZO-1, Е-кадгерина (кодируется геном CDH1)), а также активацию мезенхимальных маркеров (фибронектин, αSMA) как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Кроме того, обработка BMP4 ослабляла вызванное TGF-β сокращение коллагенового геля, миграцию клеток и фосфорилирование Smad2/3. Напротив, нокдаун эндогенного BMP4 стимулировал изменения в маркерах ЭМП (Yao et al., 2016, 2019). Результаты Яо и соавт. свидетельствуют о том, что BMP4 и ВМР7 могут ингибировать TGF-β-опосредованный ЭМП в клетках РПЭ и, таким образом, их можно рассматривать в качестве потенциальных терапевтических агентов для лечения ПВР.

Неканонические TGF-β сигнальные пути

Помимо канонического TGF-β/Smad-зависимого сигнального пути выделяют также Smad-независимые сигнальные каскады, которые активируются в ответ на TGF-β (рис. 1).

Сигнальные каскады митоген-активируемой протеинкиназы (англ. mitogen-activated protein kinase, MAPK). На сегодняшний день у млекопитающих идентифицировано 14 членов MAPK, которые разделены на 7 подгрупп. Выделяют четыре обычные подгруппы MAPK (ERK1/2, c-Jun N‑terminal kinase (JNK), p38 MAPK и ERK5), работающие в типичном трехуровневом модуле с двойным фосфорилированием, и три атипичных подгруппы MAPK (ERK3/4, ERK7/8 и nemo-like kinase (NLK)), которые не следуют классической трехуровневой сигнальной структуре с двойным фосфорилированием (Yue, López, 2020). МАРК играют ключевую роль в преобразовании внеклеточных стимулов в широкий спектр клеточных ответов, включая рост, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток (Nishimoto, Nishida, 2006). В зависимости от типа клеток и стимула МАРК могут действовать как активаторы или ингибиторы клеточных ответов (Yue, López, 2020).

ERK1/2 каскады стимулируются в основном факторами роста, тогда как JNK и p38 MAPK активируются наиболее заметно после воздействия на клетки факторов (физических, химических и биологических), вызывающих стресс. Активируемые стрессом JNK и p38 MAPK играют ключевую роль в балансировании выживания и гибели клеток.

MAPK/ERK сигнальный каскад наиболее изучен среди MAPK каскадов. На клеточной культуре РПЭ мыши показано, что TGF-β активирует белок Ras (Chung et al., 2011), который участвует в различных MAPK каскадах передачи информации от рецепторов плазматической мембраны к ядерным факторам транскрипции (рис. 1). В клетках РПЭ в течении ЭМП ERK1/2 сигнальный путь может перекрестно взаимодействовать с каноническим TGF-β/Smad и Jagged/Notch путями. Так, в клетках ARPE-19 инактивация ERK1/2 с помощью U0126, низкомолекулярного ингибитора фосфорилирования MEK1/2 (mitogen extracellular signal regulated kinases 1/2), предотвращала TGF-β2-индуцированное подавление P-кадгерина и активацию αSMA, коллагена IV типа, N-кадгерина и фибронектина путем ингибирования как канонического TGF-β2/Smad, так и Jagged/Notch сигнальных путей. Кроме того, блокада Notch пути специфическим ингибитором DAPT подавляла индуцированную TGF-β2 активацию пути ERK1/2 (Chen et al., 2014a). В другом исследовании, напротив, активация ERK1/2 сигнального пути с помощью кемпферола (англ. kaempferol), флавоноида с противораковой и антиметастатической активностью, ингибировала экспрессию белка MMP2 и миграцию клеток ARPE-19 (Chien et al., 2019).

Ras-ERK сигнальный путь, помимо индукции мезенхимальной дифференцировки, может участвовать в регуляции нейрональной дифференцировки клеток РПЭ (Chung et al., 2011). При добавлении TGF-β в среду культивирования клеток РПЭ мыши в последних отмечено усиление экспрессия нейрон-ассоциированных генов, в частности TUBB3 (Chung et al., 2011). В то время как, при предобработке клеток U0126 эффективно блокировалось TGF-β-вызванное фосфорилирование ERK и значительно уменьшалась экспрессия TUBB3. Данный факт указывает на то, что TGF-β стимулирует экспрессию TUBB3 через активацию MAPK/ERK сигнального пути. Результаты работы этих авторов согласуются с данными литературы, свидетельствующими об участии MAPK/ERK сигнального пути в трансдифференцировке РПЭ в нейральную сетчатку у куриного эмбриона (Galy et al., 2002). Так в сетчатке куриного эмбриона in ovo эктопическая экспрессия аллели MEK1 (MEK^DD), непосредственного активатора ERK в MAPK сигнальном пути, вызывала трансдифференцировку РПЭ в клетки подобные нейроэпителиальному слою сетчатки, что коррелировало c ингибированием экспрессии Mitf в презумптивном РПЭ (Galy et al., 2002). Следовательно, TGF-β через активацию MAPK/ERK сигнального каскада индуцирует и нейрональную и мезенхимальную дифференцировку клеток РПЭ, т.е. их дедифференцировку и ЭМП.

Известно, что в регуляции JNK и p38 MAPK сигнальных каскадов участвует член семейства MAPK киназ-киназ – TGF-β-активированная киназа 1 (англ. TGF-β-activated kinase 1, TAK1, альтернативное имя МАPK kinase kinase 7, MAP3K7) (рис. 1).

В ряде работ, выполненных на линейных клетках РПЭ человека, выявлено участие протеинкиназы p38 MAPK в ЭМП (Saika et al., 2005; Dvashi et al., 2015). Так, использование 5Z-7-оксозеенола, ингибитора TAK1, предотвращало развитие признаков ЭМП, вызванных стимуляцией TGF-β1: миграцию клеток, увеличение экспрессии αSMA и сократительной способности клеток ARPE-19 (Dvashi et al., 2015). В другой работе ингибирование p38 MAPK специфическим ингибитором SB202190 препятствовало стимулирующему действию экзогенного TGF-β2 на миграцию клеток ARPE-19 и на продукцию компонентов ВКМ, такие как коллаген I типа и фибронектин (Saika et al., 2005).

PI3K/AKT/mTOR сигнальный путь. Доказательства того, что TGF-β активирует не только MAPK, но и фосфоинозитид-3-киназный (англ. phosphoinositide 3-kinase, PI3K) сигнальный каскад (рис. 1) находятся в работах Ли и соавт. (Lee et al., 2008) и Хуанг и соавт. (Huang et al., 2012). Они свидетельствуют об увеличение фосфорилирования не только ERK1/2, но и нижестоящей мишени PI3K – AKT (протеинкиназа В, кодируемая AKT), после воздействия TGF-β1 на клетки РПЭ человека. Нижестоящей мишенью AKT является белок механическая мишень рапамицина (англ. mechanistic (formerly “mammalian”) target of rapamycin, mTOR), который регулирует трансляцию многих белков, в том числе тех, которые связаны с ростом клетки и ее размножением. mTOR представляет собой серин/треониновую протеинкиназу из семейства PI3K-родственных киназ (англ. PI3K-related kinase, PIKK), которая образует каталитическую субъединицу двух различных белковых комплексов, известных как mTOR комплекс 1 (англ. mTOR complex 1, mTORС1) и 2 (mTORC2) (Saxton, Sabatini, 2017). Если mTORC1 регулирует рост и метаболизм клеток, способствуя синтезу белков, липидов и нуклеотидов, одновременно подавляя катаболические пути, такие как аутофагия, то mTORC2 контролирует пролиферацию и выживание (Saxton, Sabatini, 2017).

Исследования по ингибированию mTORС1 сигнального пути в культурах клеток РПЭ ведутся с целью регуляции ЭМП. Так, использование рапамицина, ингибитора mTORС1, способствовало снижению в клетках ARPE-19, обработанных TGF-β1, экспрессии NADPH oxidase 4 (NOX4) (Kim et al., 2020). Ингибирование NOX4 в клетках ARPE-19 предотвращало образование активных форм кислорода, TGF-β-индуцированного ЭМП и фиброза. Интересно, что обработка рапамицином полностью блокировала фосфорилирование ERK1/2, указывая на ингибирование петли обратной связи от mTORC1 к ERK1/2. Авторы предполагают, что ось TGF-β1/ERK1/2/mTORC1/NOX4 может быть использована в качестве новой стратегической мишени для предотвращения заболеваний сетчатки, связанных с ЭМП и фиброзом (Kim et al., 2020).

Дедифференцировка клеток РПЭ, опосредованная активацией mTOR в ответ на химическое окислительное повреждение, блокировалась рапамицином в эксперименте на мышах с селективной по отношению к РПЭ постнатальной потерей окислительного фосфорилирования. Ингибирование реакции на стресс путем блокирования активации mTOR оказывало заметное благотворное влияние не только на РПЭ, но и на фоторецепторы (Zhao et al., 2011). В связи с чем, ингибирование mTOR является вполне убедительной терапевтической стратегией для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки человека, вызванных повреждением РПЭ (Zhao et al., 2011).

На мышиной модели со специфическим нокаутом в РПЭ гена tuberous sclerosis 1 (Tsc1), который кодирует вышестоящий супрессор mTORC1, подтверждено участие mTORC1 в дегенерации РПЭ (Go et al., 2020). Использовав метаболомный и геномный анализы, исследователи выявили, что гиперактивный mTORC1 приводит к преобразованию метаболического пути в РПЭ за счет увеличения гликолиза (Go et al., 2020). Однако, несмотря на очевидную роль mTORC1 в старении РПЭ и возрастной дегенерации, клинические испытания рапамицина у пациентов с географической атрофией не увенчались успехом (Petrou et al., 2014). Го и соавт. предполагают, что сетчатка и РПЭ имеют разные метаболические пути, а сигнал mTORC1 является фактором выживания фоторецепторных клеток. Соответственно, рапамицин оказался токсичным для клеток сетчатки у пациентов с ВМД. Поскольку mTORC1 находится на вершине сигнальной сети и контролирует несколько направлений клеточных процессов, необходимы дополнительные исследования, направленные на рассечение сигнала ниже по течению, чтобы избежать полного ингибирования эффектов mTORC1 при возрастных заболеваниях (Go et al., 2020).

В работах по изучению изменений цитоскелета клеток РПЭ под действием TGF-β показана активация RhoА/Rho-associated protein kinase (ROCK) сигнального каскада (Lee et al., 2008; Huang et al., 2012; Zhu et al., 2013). Rho-семейство малых ГТФаз – это семейство “малых” клеточных сигнальных белков (около 21 кДа), принадлежащих к суперсемейству Ras-подобных белков. Среди 20 белков млекопитающих наиболее изучены Rac1 и RhoA (Boureux et al., 2007). Показано, что Rac1 белок играет ключевую роль в регуляции полимеризации актина и способствуют формированию ламеллоподий на переднем крае мигрирующих клеток (Bustelo et al., 2007; Huang et al., 2012). Белок RhoA играет важную роль в образовании и стабильности клеточных контактов, он активирует ROCK, относящуюся к типу серин/треониновых протеинкиназ (Bustelo et al., 2007). Известно около 20 субстратов, фосфорилируемых ROCK, включая белки цитоскелета, легкие цепи миозина, фосфатазу миозина, LIM-киназу, которая через фосфорилирование кофилина играет важную роль в полимеризации актина. ROCK вовлечена в различные виды активности клетки, такие как организация цитоскелета, формирование стресс-волокон и фокальных контактов, деление, миграция, апоптоз (Boureux et al., 2007; Bustelo et al., 2007).

Сравнение эффектов TGF-β2 и стекловидного тела, основного источника TGF-β2, выявило разный ответ нетрансформированных клеток РПЭ (Parapuram et al., 2009). Так, только TGF-β2 стимулировал в клетках РПЭ дифференцировку в миофибробласты, которые, как предполагается, вызывают сокращение эпиретинальных мембран. О дифференцировке в миофибробласты свидетельствовали изменения в цитоскелете клеток, проявляющиеся в формировании стресс-волокон с комплексами фокальной адгезии, и повышение экспрессии специфичных для миофибробластов генов αSMA и CTGF. И наоборот, при обработке стекловидным телом отмечено формирование коротких филаментов, которые концентрировались в ламеллоподиях или филоподиях, и снижение экспрессии мРНК αSMA и CTGF (Parapuram et al., 2009). Кроме того, при обработке стекловидным телом, исследователи отметили более выраженную подвижность клеток РПЭ, что, по мнению авторов, не может быть объяснено присутствием в стекловидном теле одного только TGF-β2, а указывает на роль других сигнальных молекул. Исследователи предполагают, что витреальный TGF-β2 играет важную начальную роль в ЭПМ, однако в последующем происходит подавление TGF-β пути (Parapuram et al., 2009). И в этом подавлении может участвовать BMP2 сигнальный путь, активацию которого при обработке клеток РПЭ стекловидным телом наблюдали другие исследователи (Ganti et al., 2007).

Воздействие TGF-β1 на первичные клетки РПЭ взрослого человека ранних пассажей и клетки линии ARPE-19 приводило не только к увеличению фосфорилирования Smad2/3, но и к активации Rac1 и RhoA, что сопровождалось увеличением мезенхимальных маркеров (Lee et al., 2008; Huang et al., 2012). Воздействие на RhoА/ROCK сигнальный каскад как потенциальную мишень ЭМП клеток РПЭ и новый терапевтический подход в лечении ПВР активно разрабатывается in vitro (Zhu et al., 2013). Предобработка специфическими ингибиторами: малой молекулой NSC23766 (ингибитор белка Rac1), гидроксифасудилом (активный метаболит фасудила) или малой молекулой Y-27632 (ингибиторы ROCK) предотвращала фибробластоподобные изменения в цитоскелете клеток РПЭ (Lee et al., 2008; Huang et al., 2012; Zhu et al., 2013). Кроме того, фасудил значительно ингибировал развитие экспериментального ПВР в глазах кроликов, не влияя на жизнеспособность клеток сетчатки по данным электроретинографического и гистологического анализов (Kita et al., 2008).

Помимо специфических ингибиторов ROCK (фасудила и Y-27632) ингибитором ROCK и casein kinase 1 (CK1) является никотинамид, дериват витамина B3 (Meng et al., 2018). С 2009 года никотинамид активно используют в протоколах направленной дифференцировки iPSCs и ESCs человека в РПЭ (Buchholz et al., 2013; Zhao et al., 2017; Saini et al., 2017), когда Идельсон с соавт. показали увеличение эффективности генерации РПЭ из ESCs человека до 33% через 6 недель после добавления никотинамида и активина А (Idelson et al., 2009). Никотинамид подавляет фосфорилирование легкой цепи миозина, подавляет сокращение актомиозина и приводит к повышению выживаемости клеток (Meng et al., 2018). В последнее время роль никотинамида в возврате клеток РПЭ из дедифференцированного при ЭМП в дифференцированное состоянии пристально изучается in vitro (Hazim et al., 2019; Boles et al., 2020; Zhou et al., 2020).

Таким образом, различные исследования TGF-β сигнальных путей, участвующих в патологических процессах в РПЭ, выполненных в основном на клеточной линии РПЭ человека ARPE-19, выявили, что ведущая роль в ЭМП клеток РПЭ принадлежит двум изоформам TGF-β1 (Mitsuhiro et al., 2003; Lee et al., 2008; Li et al., 2011; Dvashi et al., 2015; Kim et al., 2020) и TGF-β2 (Priglinger et al., 2004; Saika et al., 2005; Chen et al., 2014a), тогда как BMP4 и BMP7 противодействуют их эффектам (Yao et al., 2016, 2019). Хотя TGF‑β1 в стекловидном теле обнаруживается лишь в латентной форме, его активация возможна при патологии, чему может способствовать, например, снижение pH среды при воспалении. Поскольку участие TGF-β1 в ЭМП клеток РПЭ продемонстрировано в ряде исследований in vitro, высвобожденный активный TGF-β1 из латентной формы в стекловидном теле также может вызывать ЭМП клеток РПЭ при контакте с компонентами стекловидного тела. В связи со сказанным роли витреальных TGF-β (TGF-β1 и TGF-β2) в ЭМП клеток РПЭ еще предстоит уточнить.

Факторы роста и цитокины в активации неканонических TGF-β сигнальных путей и развитии ЭМП

Хотя TGF-β, по-видимому, играет ключевую роль в стимуляции клеток РПЭ для формирования эпиретинальных мембран, многие другие факторы так же могут быть вовлечены в патогенез витреоретинальных расстройств и других, связанных с ЭМП ретинохориоидальных заболеваний. Так, в аспиратах стекловидного тела при ПВР помимо повышенного содержания TGF-β, обнаружены и такие факторы роста, как фактор роста гепатоцитов (HGF) и эпидермальный фактор роста (EGF), и провоспалительный цитокин TNFα (табл. 1).

Воздействие TNFα на клетки ARPE-19 индуцировало образование фиброзных очагов (Takahashi et al., 2010). Через взаимодействие гиалуроновой кислоты с CD44–моэзином TNFα опосредовал активацию TGF-β сигнального пути. TNFα способствует экспрессии CD44, основного рецептора трансмембранной адгезии для гиалуроновой кислоты, и фосфорилированию моэзина с помощью протеинкиназы C (англ. protein kinase C, PKC), что приводит к перицеллюлярному взаимодействию гиалуроновой кислоты и CD44. Образование комплекса гиалуроновая кислота–CD44–моэзин приводит к нарушению межклеточных контактов и повышению подвижности клеток за счет ремоделирования актина. Кроме того, комплекс гиалуроновая кислота–CD44–моэзин связывается с TGFβR-II и клатрином в актиновых микродоменах с последующей активацией передачи сигналов TGF-β и индукцией мезенхимального фенотипа в клетках РПЭ (Takahashi et al., 2010). Помимо этого, авторы продемонстрировали, что фиброз, индуцированный инъекцией TNFα в сетчатку мыши, заметно подавлялся у мышей, нокаутированных по CD44. Эти данные указывают на то, что взаимодействие гиалуроновой кислоты с CD44 играет ключевую роль в фиброзных расстройствах, ассоциированных с ЭМП. Как показано на клетках ARPE-19, TNFα активирует AKT, mTORC1 и mTORC2. Однако только AKT/mTORC1 сигнальный путь необходим для TNFα-опосредованной миграции клеток РПЭ (Liu et al., 2012) и экспрессии MMP9 в клетках РПЭ in vitro (Wang et al., 2012).

Активация ERK и PKCδ сигнальных путей отмечена и при экзогенном добавлении HGF в сочетании с EGF к линейным ARPE-19 и первичным клеткам РПЭ, синергетическое действие которых стимулировало миграцию клеток (Chen et al., 2012c).

МикроРНК (miRNAs) в регуляции TGF-β сигнального пути и ЭМП

В настоящее время появляется все больше исследований, направленных на изучение роли miRNAs в регуляции дифференцировки и ЭМП клеток РПЭ (Wang et al., 2010; Adijanto et al., 2012; Donato et al., 2018; Shahriari et al., 2020). Так, показано, что при TGF-β2-индуцированном ЭМП в клетках ARPE-19 по-разному экспрессируется 304 miRNAs. Из этих дифференциально экспрессируемых miRNAs регуляция 185 подавлена, тогда как регуляция 119 повышена как минимум в два раза (Chen et al., 2014b). Отмечено, что в клетках ARPE-19 после обработки TGF-β2 резко снижается экспрессия miR-let7c и активируется путь передачи сигнала nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) (Deji et al., 2020). NF-κB регулирует большое число генов, многие из которых являются критическими для выживания клеток. NF-κB является ключевым регулятором воспалительных сигнальных каскадов, он участвует в индукции и поддержании ЭМП и в неоваскуляризации сетчатки (Yang et al., 2015b; Moon et al., 2017b; Luo et al., 2018). NF-κB стимулирует выработку различных факторов роста, включая TGF-β, и провоспалительных цитокинов (например, IL-8, TNFα), молекул адгезии, ангиогенных факторов (например, фактора роста эндотелия сосудов, англ. vascular endothelial growth factor, VEGF), а также ферментов деградации ВКМ (например, MMP9), активность которых связана с миграцией клеток. В то же время NF-κB активируется в ответ на различные стимулы – воспалительные цитокины, клеточный стресс, а также факторы роста (Yang et al., 2015a). Известно, что NF-κB способствует стабилизации белка Snail, предотвращая его фосфорилирование внутриклеточной киназой гликогенсинтазы-3β (англ. glycogen synthase kinase 3 beta, GSK3β) и последующую деградацию (Thiery et al., 2009). Потеря активности NF-κB снижает экспрессию генов, связанных с ЭМП (Moon et al., 2017b).

В ряде исследований показано, что критическую роль в дифференцировке клеток РПЭ играет семейство miR-204/211 (Wang et al., 2010; Adijanto et al., 2012). MiR-204/211 регулируют MITF, что способствует поддержанию эпителиального фенотипа в фетальных клетках РПЭ человека (Adijanto et al., 2012). Кроме того, прямыми мишенями miR-204 являются TGFβR-II и SNAI2 (также известный как SLUG) (Wang et al., 2010). Помимо miR-204/211 и семейства let7 ряд других miRNAs, такие как miR-29b (Li et al., 2016), miR-93 (Fuchs et al., 2020), miR-124 (Jun, Joo, 2016) и miR-194 (Cui et al., 2019) могут быть молекулярными регуляторами и потенциальными терапевтическими мишенями при развитии ЭМП при ПВР.

Например, ингибирование miR-29b в клетках ARPE-19 напрямую запускает процесс ЭМП, который характеризуется фенотипическими изменениями, активацией αSMA, подавлением E-кадгерина и ZO-1 и повышенной миграцией клеток (Li et al., 2016). Мишенью miR-29b является AKT2, подавление которого ингибирует TGF-β1-индуцированный ЭМП (Li et al., 2016). Сверхэкспрессия miR-194 значительно ингибирует TGF-β1-индуцированный ЭМП клеток ARPE-19, при этом значительно снижается экспрессия CDH2 (ген N‑кадгерина) и других генов, которые регулируются ZEB1 (Cui et al., 2019). При прогрессировании ЭМП в клетках ARPE-19 снижается уровень экспрессии miR-124, а ингибирование эндогенной miR-124 способствует увеличению мезенхимальных и снижению эпителиальных маркеров (Jun, Joo, 2016). Сверхэкспрессия miR-124 увеличивает уровни ZO-1 и окклюдина, подавляет уровни фибронектина, αSMA и виментина, а также подавляет TGF-β1-индуцированное сокращение коллагенового геля клетками РПЭ (Jun, Joo, 2016).

Как показано в исследовании Фукса и соавт., мишенями для miR-302d являются TGFβR-II, SMAD2 и SMAD3, три основных гена TGF-β/Smad сигнального каскада, тогда как miR-93 регулирует только TGFβR-II (Fuchs et al., 2020). После воздействия TGF-β и трансфекции miR-302d или miR-93 в клетках ARPE-19 выявлено значительное снижение секреции VEGF-A, играющего решающую роль в CNV при ВМД. Однако роль miR-302d в дифференцировке клеток РПЭ остается противоречивой. Так, по мнению Фукса и соавт., обе miRNAs (miR-302d и miR-93) могут возвращать TGF-β-индуцированные мезенхимальные клетки ARPE-19 в эпителиоподобное состояние и, следовательно, способствовать МЭП (Fuchs et al., 2020). Однако в другом исследовании показано, что miR-302d-3p индуцирует дедифференцировку клеток ARPE-19, что проявляется снижением характерных маркеров РПЭ и прерыванием фагоцитоза, а также способствует миграции клеток, их пролиферации и прогрессированию клеточного цикла (Jiang et al., 2018). В этом же исследовании потенциальным вышестоящим фактором транскрипции для miR-302d-3p был идентифицирован c-Jun, а нижестоящей мишенью – p21, ингибитор циклинзависимой киназы, кодируемый геном CDKN1A. Данные этой работы свидетельствуют о том, что p21 может способствовать дифференцировке РПЭ, ингибировать его пролиферацию, развитие клеточного цикла и миграцию, тогда как miR-302d-3p подавляет дифференцировку РПЭ посредством прямого нацеливания на p21 (Jiang et al., 2018).

Стратегии воздействия на TGF-β сигнальный путь и ЭМП клеток РПЭ

На сегодняшний день очевидно, что комплекс растворимых факторов, в том числе из сыворотки крови и стекловидного тела, и ВКМ тесно переплетены при развитии ЭМП клеток РПЭ. Результаты работ, выполненных в основном на клеточной линии ARPE-19, свидетельствуют о том, что различные факторы роста и сигнальные молекулы могут запускать ЭМП клеток РПЭ, понижая их уровень дифференцировки и способствуя пролиферации (Yang et al., 2015b; Dvashi et al., 2015; Yao et al., 2016). Рецепторы с высоким сродством к таким факторам роста, как EGF, FGF, IGF, HGF, TGFα и PDGF, которые обнаруживаются в стекловидном теле при пролиферативных витреоретинопатиях (табл. 1), принадлежат к разным подклассам рецепторных тирозинкиназ. Однако все они могут активировать сходные внутриклеточные сигнальные пути, в том числе MAPK/ERK и PI3K/AKT/mTOR (Thiery et al., 2009; Gonzalez, Medici, 2014; Liu et al., 2015).

В отличие от факторов, которые запускают ЭМП, очевидно, что TGF-β является его основным регулятором (Dvashi et al., 2015; Yao et al., 2016). Он способствует миграции клеток РПЭ и активирует в них синтез компонентов ВКМ. Участие двух изоформ TGF-β (TGF-β1 и TGF-β2) в ЭМП клеток РПЭ продемонстрировано в ряде исследований (Mitsuhiro et al., 2003; Priglinger et al., 2004; Saika et al., 2005; Lee et al., 2008; Li et al., 2011; Chen et al., 2014a; Dvashi et al., 2015; Kim et al., 2020).

Учитывая важную роль ЭМП в патогенезе ПВР, таргетная терапия ЭМП считается потенциальным методом лечения этого заболевания. В настоящее время ведутся исследования по блокированию TGF-β сигнального пути на всех уровнях – от его лигандов и рецепторов до ядерных рецепторов. Эти ингибиторы включают как малые молекулы (англ. small molecule drugs), так и большие молекулы или биопрепараты (англ. large molecules or biologics).

Большинство современных ингибиторов передачи сигналов TGF-β, которые нацелены на нейтрализацию всех его изоформ или на прямое ингибирование киназной активности его рецепторов, более подробно рассмотрены в обзорах (Yang et al., 2015b; Györfi et al., 2018; Huynh et al., 2019). Среди них, например, LY-364947, селективный ингибитор TGFβR-I. Так, LY-364947 предотвращал ЭМП клеток РПЭ быка in vitro, а также уменьшал площадь фиброза в месте травмы и предотвращал тракционную отслойку сетчатки на модели ПВР кролика in vivo (Nassar et al., 2014). Другой препарат, глюкозамин (англ. glucosamine), снижающий уровень экспрессии рецептора TGF-β и ингибирующий связывание TGF-β с поверхностью клеток, ослаблял ЭМП в клетках ARPE-19 и уменьшал морфологические изменения на модели ПВР (отслойки сетчатки) мыши (Liang et al., 2011).

Однако стратегии по прямому нацеливанию на TGF-β и его рецепторы ингибируют все функции передачи сигналов семейства TGF-β, что может быть связано с неприемлемыми побочными эффектами (Györfi et al., 2018). Поэтому было разработано множество альтернативных стратегий для воздействия на TGF-β на других уровнях, в том числе на уровне внутриклеточных сигнальных каскадов, задействованных в профибротических эффектах, а также на уровне транскрипционных факторов, ядерных рецепторов и miRNAs. Например, деацетилирование Smad4 при использование биологически активной добавки ресвератрола (англ. resveratrol) приводило к ингибированию ЭМП (подавление пролиферации и миграции клеток и синтеза фибронектина) в фетальных клетках РПЭ, а также к подавлению прогрессирования ПВР в модели кролика (Ishikawa et al., 2015).

Специфическое ингибирование транскрипционного фактора Snail, участника Smad-зависимой передачи сигналов TGF-β, репрессирующего экспрессию адгезивных молекул, и, таким образом, регулирующего переход от эпителия к мезенхиме, может обеспечить новый подход к лечению и предотвращению ПВР (Li et al., 2011).

В дополнение к сказанному, в качестве терапевтических подходов в лечении ПВР предлагают подавлять в клетках РПЭ следующие мишени Smad-независимой передачи сигналов TGF-β: p38 MAPK (Saika et al., 2005; Dvashi et al., 2015), ERK1/2 (Chen et al., 2014a), mTOR (Zhao et al., 2011; Kim et al., 2020) и RhoА/ROCK (Lee et al., 2008; Kita et al., 2008; Zhu et al., 2013).

Важная роль в дифференцировке клеток РПЭ показана в ряде исследований с использованием таких ингибиторов ROCK, как Y-27632 (Zhu et al., 2013), фасудил (Lee et al., 2008; Kita et al., 2008) и никотинамид (Hazim et al., 2019; Boles et al., 2020). Для примера, обработка никотинамидом первичных клеток РПЭ человека предотвращала ЭМП и сократительное поведение, стимулированное комбинированным воздействием TGF-β1 и TNFα (Boles et al., 2020).

В дополнение к этому, ингибирование NF-κB представляет собой многообещающую терапевтическую стратегию для предотвращения или контроля глазных фиброзных заболеваний, возникающих из-за ЭМП (Moon et al., 2017b). Так, обработка клеток ARPE-19, стимулированных TGF-β1, препаратом бортезомиб (англ. bortezomib), применяемым в противоопухолевой терапии, подавляла сигнальный каскад NF-κB и повышала экспрессию ингибитора NF-κB – IκBα (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha). Бортезомиб подавлял регуляцию мезенхимальных маркеров (N-кадгерин, виментин, αSMA и β-катенин) и повышал активность эпителиальных маркеров (ZO-1 и окклюдин), что свидетельствует об ингибировании ЭМП в клетках РПЭ и предотвращении развития ПВР путем подавления пути TGF-β (Moon et al., 2017b).

Исследование влияния агониста ядерного рецептора peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ) троглитазона (англ. troglitazone), препарата из группы пероральных гипогликемических препаратов, на TGF-β2-опосредованные ответы в клетках ARPE-19 показало, что троглитазон эффективно ингибировал продукцию компонентов ВКМ (коллагена I типа и фибронектина) как на уровне мРНК, так и на уровне белка, и подавлял миграцию клеток РПЭ (Cheng et al., 2008). Кроме того, троглитазон подавлял индуцированное TGF-β2 фосфорилирование Smad2 и Smad3 и их последующую ядерную транслокацию, что, возможно, является молекулярным механизмом, объясняющим подавление ЭМП в клетках РПЭ. В дополнение к этому, троглитазон не влиял на индуцированное TGF-β2 фосфорилирование p38 MAPK (Cheng et al., 2008).

В дополнение к сказанному, в настоящее время ряд miRNAs (например, miR-204/211, семейство let7, miR-29b, miR-93, miR-124, miR-194 и miR-302d) и длинные некодирующие (lnc) RNA (lncRNA) рассматриваются в качестве важных модуляторов передачи сигналов TGF-β и ЭМП клеток РПЭ (Wang et al., 2010; Adijanto et al., 2012; Jun, Joo, 2016; Li et al., 2016; Cui et al., 2019; Fuchs et al., 2020; Salmaninejad et al., 2022). Хотя lncRNA менее изучены, они могут быть не менее важными, поскольку могут выполнять свои регуляторные роли через спонжирование miRNA (Salmaninejad et al., 2022). Поскольку miRNAs могут подавлять экспрессию практически всех генов и их транскриптов мРНК, они имеют преимущества над препаратами на основе малых молекул, воздействующих только на определенные классы белков, и препаратов на основе белков, включая высокоспецифичные моноклональные антитела, мишени которых в основном ограничены рецепторами на поверхности клетки или циркулирующими белками (Lam et al., 2015). Возможность локальной доставки miRNAs непосредственно в глаз может быть полезным в качестве новых классов терапевтических агентов для лечения широкого спектра офтальмологических заболеваний.

Помимо таргетной терапии при ПВР, намечены маркерные белки, экспрессия которых изменяется при развитии ПВР и ВМД. В частности, экспрессия компонента Janus kinase (JAK)/Signal transducer and activator of transcription (STAT) сигнального пути, транскрипционного фактора STAT3, и ключевого активатора различных цитокинов и факторов роста, увеличивается в РПЭ при образовании CNV (Fasler-Kan et al., 2005). При влажной форме ВМД отмечается снижение или даже отсутствие белка BMP4 в хориваскулярных мембранах (Zhu et al., 2009a), что связано с ингибирующим влиянием TNFα (Xu et al., 2011).

Кроме сказанного, идентификация и анализ паттерна экспрессии miRNAs во внутриглазной жидкости или стекловидном теле пациентов с различной патологией (диабетической ретинопатией, глаукомой) в настоящее время является предметом многих офтальмологических исследований (Jayaram et al., 2017; Martinez, Peplow, 2019; Chen et al., 2019). Помимо этого, дальнейшие исследования по дифференциально экспрессируемым miRNAs в сетчатке и РПЭ необходимо продолжить, поскольку это поможет как в идентификации биомаркеров пролиферативных и дегенеративных заболеваний сетчатки, так и в установлении потенциальных мишеней для терапии препаратами на основе miRNAs.

Канонический Wnt/β катенин сигнальный путь

Канонический Wnt/β катенин сигнальный путь является эволюционно консервативным, он играет центральную роль во время различных стадий развития сетчатки и в гомеостазе во взрослой сетчатки (Lad et al., 2009).

Канонический Wnt лиганд на клеточной поверхности связывается с рецепторным комплексом, состоящим из рецептора Frizzled (Fzd)-1 или -4 (кодируются генами FZD1 и FZD4 соответственно) и ко-рецептором low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP)5 или LRP6 (de Jaime-Soguero et al., 2018). В этом комплексе трансмембранная часть Fzd-рецептора взаимодействует с цитоплазматическим белком Dishevelled (Dvl), тогда как внутриклеточный домен LRP5/6 – с белком аксином, что приводит к разборке комплекса деструкции APC–аксин–СК1α и ингибированию внутриклеточной серинтреониновой киназы GSK3β. В результате этого ингибируется фосфорилирование β-катенина, что в свою очередь приводит к его накоплению в цитозоле (Xu, Kimelman, 2007). Далее накопленный β-катенин транслоцируется в ядро, где образует множественные белковые комплексы с ингибиторами или ко-активаторами транскрипции Wnt пути и вступает во взаимодействие с ДНК-связывающими белками семейства TCF/LEF (Xu, Kimelman, 2007; de Jaime-Soguero et al., 2018). Вместе они включают транскрипцию “канонических” (β-катенин-зависимых) генов Wnt ответа: C-MYC, CCND1, AXIN-2, VIMENTIN, SNAIL, MMP2, MMP7, MMP9. Таким образом, β‑катенин инициирует процесс ЭМП (Evans et al., 2010).

В эпителиальных клетках β-катенин локализуется в примембранной области, где входит в комплекс Е-кадгерин–p120-катенин–β-катенин–α-катенин, образующий адгезионные контакты (Katoh, Katoh, 2006). Связь β-катенина с Е-кадгерином свидетельствует о стабильной межклеточной адгезии. GSK3β является ключевым компонентом регуляции канонического Wnt сигнального пути (Katoh, Katoh, 2006; Ding et al., 2010). Подавление экспрессии GSK3β и активирование PI3K/AKT и канонического Wnt сигнальных путей показано на экспериментальной модели травматической ПВР, вызванной у кроликов с помощью интравитреальных инъекций клеток ARPE-19 (Zhang et al., 2018).

В отсутствии Wnt сигнализации GSK3β в комплексе с белками APC–аксин–СК1α связывает и фосфорилирует цитоплазматический β-катенин, что приводит впоследствии к его утилизации при помощи убиквитин-протеасом (Staal, 2016; Nusse, Clevers, 2017). Благодаря этому механизму в отсутствии Wnt стимуляции цитоплазматическая концентрация β-катенина поддерживается на низком уровне (Staal, 2016). Интересным фактом является то, что пул β-катенина адгезионных соединений очень стабилен, тогда как период полураспада сигнального пула β-катенина составляет порядка нескольких минут (Nusse, Clevers, 2017).

При разрушении адгезионных контактов могут активироваться два сигнальных пути: через β-катенин и p120-катенин. Последний может запускать путь p120/Kaiso, в котором транслоцированный в ядро p120-катенин ослабляет репрессорную активность Kaiso (кодируется геном ZBTB33), члена семейства транскрипционных факторов BTB (Broad-Complex, Tramtrack and Bric a brac)/POZ (poxvirus and zinc finger). Известно, что p120-катенин регулирует кадгерин-опосредованные адгезионные контакты, транспортирует кадгерины на мембрану и стабилизирует их на мембране, регулируя динамическую регуляцию актинового цитоскелета, взаимодействует и стабилизирует микротрубочки, а также ингибирует RhoA и другие Rho ГТФазы, тогда как активация передачи сигналов RhoA/ ROCK коррелирует с дестабилизацией микротрубочек, ядерной транслокацией p120 и мечением BrdU (Chen et al., 2012b).

Неконтролируемая передача сигналов Wnt может вызывать заболевания сетчатки, такие как семейная экссудативная витреоретинопатия, пигментный ретинит и болезнь Норри (Lad et al., 2009). Например, причиной семейной экссудативной витреоретинопатии, характеризующейся различными офтальмологическими проявлениями, в том числе развитием рубцов и как следствием отслойкой сетчатки и слепотой, могут быть мутации в генах FZD4 и LRP5 (Xu et al., 2004; Lad et al., 2009). Причиной болезни Норри, при которой наблюдаются такие офтальмологические расстройства, как ретролентальная фиброваскулярная мембрана, тракция и отслоение сетчатки, является мутация в гене NDP. Ген NDP кодирует небольшой секреторный белок норрин (англ. Norrin) (15 кДа), который экспрессируется в сетчатке, головном мозге и обонятельных луковицах и предположительно участвует в нейрогенезе и межклеточном взаимодействии (Rajendran et al., 2021). Norrin взаимодействует с Fzd4, LRP5 и тетраспанином 12 (англ. tetraspanin 12) и может активировать Wnt путь (Xu et al., 2004; Nusse, Clevers, 2017; Rajendran et al., 2021).

Поскольку канонический Wnt путь активируется в глиальных клетках во время повреждения фоторецепторов, возникло предположение об его участии в дегенерации сетчатки (Hackam, 2005). В частности, предполагается, что Wnt сигнальный путь играет роль в поражении сетчатки при ВМД (Tuo et al., 2015). В срезах сетчатки пациентов с ВМД обнаружены более высокие уровни фосфорилирования белка LRP6 и транскриптов генов, нацеленных на Wnt путь, а также более высокий уровень белка β-катенина в макуле ВМД по сравнению с контрольной группой. В сетчатке мышей с моделью ВМД-подобной дегенерации сетчатки также было выше фосфорилированного LRP6 и нефосфорилированного β-катенина, чем у мышей дикого типа. Интравитреальное введение антител против LRP6 замедляло прогрессирование поражений сетчатки у мышей, что может быть полезным для дезактивации канонического пути Wnt у людей (Tuo et al., 2015).

В то же время, в ряде работ, выполненных на взрослых животных, показано, что активация сигнального каскада Wnt путем экзогенного добавления Wnt белков стимулирует заживление различных травм, включая повреждения сетчатки (Whyte et al., 2012). Так, после повреждения или дегенерации сетчатки у мышей активация сигнального пути Wnt способствовала пролиферации клеток Мюллера и регенерации нервной ткани (Osakada et al., 2007). Воздействие Wnt3a на сетчатку с поврежденными фоторецепторами в 20 раз увеличивало пролиферацию дедифференцированных клеток Мюллера (Osakada et al., 2007).

В клетках РПЭ постнатального организма Wnt/β-катенин сигнальный каскад участвует в регуляции экспрессии генов, задействованных в предохранении от окислительного стресса (Burke, 2009; Fragoso et al., 2012). Так, защитная роль Wnt3а-лиганда была продемонстрирована на клеточной линии ARPE-19. Клетки обрабатывали Wnt3а в присутствии и без цитотоксических агентов, таких как перекись водорода и паракват. В результате показана повышенная выживаемость клеток РПЭ, которая опосредовалась еще и активацией STAT3 (Fragoso et al., 2012).

In vitro каноническая передача сигналов Wnt определяет фенотипическую пластичность клеток РПЭ. Как недавно было показано, передача сигналов Wnt регулируется аннексином A8 (ANXA8) (Lueck et al., 2020). Аннексины (англ. Annexins, ANXA1–ANXA11, ANXA13) принадлежат к надсемейству кальций-зависимых белков, связывающих фосфолипиды. Они участвуют в организации и структуре фосфолипидной мембраны и белков цитоскелета и играют важную роль в жизненном цикле клеток, экзоцитозе и апоптозе. В частности, ANXA8 локализуется в мембранных участках, богатых фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфатом, где накапливается F-актин. ANXA8 влияет на пролиферацию и миграцию клеток, а также может играть роль в клеточной дифференцировке (Pimiento et al., 2015). Обработка фенретинидом подавляла экспрессию гена ANXA8 и РПЭ-специфических генов (OTX2 и MITF), а также на начальных этапах снижала экспрессию нескольких ключевых генов, участвующих в передаче сигналов Wnt (CTNNB1, FZD1, FZD4, WNT2B и WNT3A), тогда как в последующем их экспрессия повышалась (Lueck et al., 2020). Снижение экспрессии генов Wnt пути сопровождалось повышением экспрессии GSK3β и нейрональных/ретинальных маркеров (кальбиндина и кальретинина) (Lueck et al., 2017, 2020).

Активация передачи сигналов Wnt дополнительно контролируется различными антагонистами, включая фактор ингибирования Wnt1 (англ. WNT inhibitory factor 1, WIF1), Cerberus, Sclerostin, а также членов семейств Dickkopf и secreted Frizzled-related protein (sFRP). Белки Sclerostin и Dickkopf влияют на активность Wnt и противодействуют канонической передаче сигналов, связываясь с LRP5 или LRP6, тогда как WIF1, Cerberus и sFRP могут напрямую взаимодействовать с белками Wnt (Bovolenta et al., 2008).

Семейство sFRP является самым большим семейством ингибиторов Wnt белков, которые не просто связывают Wnt, но и могут противодействовать активности друг друга, а также связываться с Fzd-рецепторами, предотвращая взаимодействие Wnt с этими рецепторами. Более того, sFRP белки могут взаимодействовать с другими рецепторами или молекулами ВКМ (например, фибронектином), действовать в качестве ингибиторов BMP1 (Bovolenta et al., 2008) или влиять на направление аксонов ганглиозных клеток сетчатки (Rodriguez et al., 2005).

У человека семейство sFRP включает пять членов богатых цистеином секретируемых гликопротеинов (около 36 кДа), которые по своей структуре подразделяются на две подгруппы: первая включает sFRP1, sFRP2 и sFRP5, а вторая – sFRP3 и sFRP4 (Esteve et al., 2003; Garcia-Hoyos et al., 2004; Bovolenta et al., 2008). Анализ экспрессии у цыплят, мышей и людей показал, что все члены первой группы экспрессируются как в развивающемся, так и во взрослом глазу. В частности, мРНК sFRP5 локализована в РПЭ человека, тогда как sFRP1 и sFRP2 экспрессируются в недифференцированном нейроэпителии сетчатки цыплят и мышей (Esteve et al., 2003; Garcia-Hoyos et al., 2004; Bovolenta et al., 2008). По мере развития экспрессия sFRP1 специфически поддерживается во внутреннем ядерном и фоторецепторном слоях, по крайней мере, у мыши (Garcia-Hoyos et al., 2004). На основании этого паттерна экспрессии было предположено, что sFRP1 и sFRP5 могут участвовать в определении полярности фоторецепторных клеток. Кроме того, анализ нескольких случаев пигментного ретинита, при котором фоторецепторы дегенерируют путем апоптоза, выявил связь дегенерации фоторецепторов с повышенной регуляцией sFRP1, sFRP2 и sFRP5 (Jones et al., 2000; Garcia-Hoyos et al., 2004). В отличие от этих наблюдений, в исследовании Стива и соавт., проведенном на цыплятах in vitro и in vivo, показано, что sFRP1 модулирует клеточную дифференцировку сетчатки, способствуя образованию ганглиозных и фоторецепторных клеток (колбочек) и, в то же время, уменьшая количество амакриновых клеток (Esteve et al., 2003).

Активация канонического Wnt сигнального пути возможна и при воздействии различных факторов роста, в том числе негативно регулирующих GSK3β. Известно, что TGF-β1 индуцирует протеолитическое отщепление Е-кадгерина, что вызывает ядерную транслокацию β-катенина, индукцию транскрипции Slug и репрессию транскрипции Е-кадгерина в различных типах клеток (Zheng et al., 2009). При воздействии TGF-β1 на клетки ARPE-19 уменьшалась связь между ANXA8 и β-катенином (Lueck et al., 2020).

Механизмы Wnt/β-катенин сигнального пути способны объяснить многие патологические процессы, происходящие при изменении структуры и функции клеток РПЭ. Исследования в этих направлениях активно ведутся, поскольку помогут понять и регулировать не только механизмы ЭМП клеток РПЭ in vivo, но и патологические процессы, происходящих в РПЭ при старении.

Неканонический Wnt сигнальный путь

Интересно, что трансмембранные рецепторные тирозинкиназы ROR2 и RYK, а также Fzd-рецепторы, которые действуют независимо от LRP5 или LRP6, функционируют в качестве рецепторов для Wnt и активируют независимые от β-катенина пути. Это приводит к изменениям в движении и полярности клеток, а также к антагонизму пути β-катенина (Angers, Moon, 2009).

Неканонический Wnt/Ca²⁺ сигнальный путь активируется лигандами Wnt5a и Wnt11. Связывание Wnt5a с Fzd-2 рецептором активирует G-белки, фосфодиэстеразы и изменяет уровень внутриклеточного кальция, что приводит к активации Ca²⁺/кальмодулинзависимых киназ (Hackam, 2005). Существуют также доказательства того, что путь Wnt/Ca²⁺ может противодействовать каноническому пути, повышая интригующие возможности коммуникации и регуляции обратной связи между путями.

Метод “кальциевого выключения” на культуре клеток РПЭ взрослого человека выявил связь между кальций-зависимой адгезией, морфогенезом и пигментацией. Обратимый, зависящий от уровня кальция в ростовой среде, характер изменений в морфологии клеток, заключался в переходе от эпителиального фенотипа с пигментацией к веретенообразным клеткам без пигмента и наоборот (Rak et al., 2006).

Известно, что неканонический Wnt/РСР сигнальный путь стимулируется под действием лигандов Wnt5a, -5b, -7a, -11. В зависимости от клеточного контекста Wnt/РСР путь может активироваться и лигандами Wnt, которые обычно активируют β-катенин-зависимый путь (Daulat, Borg, 2017). Этот путь контролирует активность малых ГТФ-аз семейства Rho (Rac1 и RhoA). Rac-зависимый сигнальный каскад связан с индукцией киназной активности JNK, а Rho-зависимая ветвь сигнального каскада – с активацией ROCK. ROCK вовлечена в регуляцию процесса модификации структур актинового цитоскелета, благодаря чему оказывает значительное влияние на поляризацию и подвижность клеток (Daulat, Borg, 2017).

Однако о влиянии вышеперечисленных Wnt лигандов на клетки РПЭ в настоящее время известно мало. Например, показано, что Wnt5a подавлял каноническую передачу сигналов Wnt в клетках ARPE-19 путем фосфорилирования и деградации β-катенина. Кроме того, Wnt5a снижал уровни VEGF, TNF-α и NF-κB, активированные с помощью Wnt3a. Более того, Wnt5a увеличивал экспрессию E-кадгерина и снижал миграцию клеток за счет подавления экспрессии Snail, тем самым отменяя Wnt3a-индуцированный ЭМП в клетках РПЭ человека (Kim et al., 2015).

Недавно нами на клетках РПЭ взрослого человека ранних пассажей и линии ARPE-19 показано, что среди изученных белков Wnt сигнального пути (Wnt1, Wnt7a и sFRP1) только Wnt7a оказывал видимые биологические эффекты (неопубликованные данные) (рис. 3). Wnt7a ингибировал пролиферативную активность клеток РПЭ по данным МТТ-анализа, способствовал появлению клеток большего размера по данным морфометрического исследования и увеличивал экспрессию мРНК KLF4 (Kuznetsova et al., 2015, 2016) (рис. 4), что вместе свидетельствует в пользу негативной регуляции клеточного цикла после воздействия Wnt7a. Из данных литературы известно, что KLF4 участвует в контроле пролиферации, дифференцировки, миграции и апоптоза клеток (Chen et al., 2003; Tien et al., 2015). Однако сведения об его участии в регуляции пролиферативного ответа клеток противоречивы. По всей видимости, в зависимости от контекста KLF4 может регулировать клеточный цикл либо негативно (Chen et al., 2003; Li et al., 2012), либо позитивно (Tien et al., 2015). Авторы негативной теории предполагают, что конститутивный уровень KLF4 ингибирует пролиферацию, миграцию и адгезию клеток, а потеря KLF4, наоборот, способствует пролиферации (Chen et al., 2003; Li et al., 2012).

Рис. 3.

Неиммортализованные клетки РПЭ взрослого человека 4 пассажа через 24 ч после воздействия 0.4 мкг/мл sFRP1, 2 нг/мл Wnt1 или 60 нг/мл Wnt7a по сравнению с контролем (без добавления факторов). Фазовый контраст, ×100.

Рис. 4.

кПЦР. Уровень экспрессии мРНК ряда генов в клетках ARPE-19 (красные столбики) и неиммортализованных клетках РПЭ взрослого человека 4 пассажа (синие столбики) через 24 ч после воздействия 60 нг/мл Wnt7a относительно соответствующего контроля (в отсутствии Wnt7a), принятого за единицу (штриховая линия). Вертикальные отрезки – стандартное отклонение.

В нашем исследовании, Wnt7a инициировал процесс распластывания клеток РПЭ на пластике, активировал процессы редифференцировки, о чем свидетельствует усиление экспрессии РПЭ-специфичных генов (RPE65, MITF и OTX2) (рис. 4). При этом было отмечено отсутствие окрашивания на MAP1B и βIII-тубулин при одновременном увеличении интенсивности свечения антител к синапсину I и NF 68 и 200 кДа, белкам-маркерам зрелых нейронов, и увеличение экспрессии мРНК PAX6, маркера нейронов сетчатки, что вместе указывает на продвижение нейрональной/ретинальной дифференцировки или понижения уровня дифференцировке клеток (Kuznetsova et al., 2015; Kuznetsova et al., 2016). Отсутствие βIII-тубулина на белковом уровне и сохранение его на транскрипционном уровне согласуется с результатами Хорн и соавт. (Horn et al., 2007). Исследователи на эмбрионах трансгенных мышей показали, что гиперэкспрессия Wnt7a отсрочивает экспрессию белка βIII-тубулина и это способствует контролированию созревания нейрональных прогениторов (Horn et al., 2007). В дополнение к этому, в нашем исследовании, отдельные группки клеток РПЭ окрашивались на нестин, что совместно с увеличением уровней экспрессии мРНК NES, гена-плюрипотентности OCT4 и лиганда Notch сигнального пути JAG1 говорит о поддержании пула нейральных/ретинальных стволовых клеток (Kuznetsova et al., 2016). Повышение BMP1 на транскрипционном уровне в клетках РПЭ под воздействием Wnt7a (рис. 4) не сопровождалось повышением его на уровне белка, что говорит об отсутствии развертывания ЭМП и свидетельствует в пользу данных о редифференцировке клеток РПЭ. Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что in vitro клетки РПЭ оказываются на разных стадиях дедифференцировки и, следовательно, реагируют на воздействие Wnt7a различно: в одних клетках запускается процесс редифференцировки/эпителиальной дифференцировки, тогда как в других – нейральной/ретинальной дифференцировки или дедифференцировки.

Кроме того, под воздействием Wnt7a было отмечено перераспределение синапсина I с перинуклеарного точечного на цитоплазматическое (Kuznetsova et al., 2016) и изменение локализации и снижение интенсивности свечения антител к фокальной адгезивной киназе (англ. focal adhesion kinase, FAK) (неопубликованные данные). Известно, что синапсин I и FAK участвуют в связывании микротрубочек (Valtorta et al., 1992; Schaller, 2010). В исследовании Бустос и соавт. показано, что синапсин I присутствует в эпителиальных клетках ненейронного происхождения, он концентрируется в везикулярном компартменте, прилегающем к транс-элементам комплекса Гольджи, который также обогащен миозином II (Bustos et al., 2001). In vitro синапсин I взаимодействует с различными компонентами цитоматрикса (F-актином, микротрубочками, нейрофиламентами и спектрином), опосредуя прикрепление везикул к цитоскелету и регулируя их движение внутри клетки (Valtorta et al., 1992). Нерецепторная тирозинкиназа FAK играет важную роль в регуляции актинового цитоскелета, клеточной адгезии, миграции, пролиферации и выживания клеток, а также подтверждена роль FAK в контроле микротрубочек и в выполнении важных функций в ядре (Schaller, 2010). Таким образом, отсутствие окрашивания на MAP1B и βIII-тубулин при изменении характера окрашивания на синапсин I и FAK под воздействием Wnt7a в исследовании (Kuznetsova et al., 2016) согласуется с утверждением о деполимеризации микротрубочек при этом.

Как уже было сказано выше, неканонический Wnt/РСР сигнальный путь контролирует RhoA/ ROCK сигнальный каскад, активация которого коррелирует с дестабилизацией микротрубочек (Chen et al., 2012b). Кроме того, как показано в работе Лу и соавт. на клетках HaCaT, деполимеризация микротрубочек способствует увеличению размера ядра (Lu et al., 2012). В нашем исследовании мы также наблюдали увеличение размера ядер клеток РПЭ при воздействии Wnt7a (неопубликованные данные).

Следует отметить, что трансформированные клетки линии ARPE-19 оказались менее чувствительны к воздействию Wnt7a, чем неиммортализованные (собственные наблюдения) (рис. 4). Хотя морфологические и молекулярные изменения в клетках РПЭ взрослого человека, вызванные Wnt7a, носят краткосрочный характер, поскольку белок функционирует как сигнал ближнего действия между соседними клетками, а также из-за отсутствия подходящего микроокружения, Wnt7a можно рассматривать в качестве потенциального терапевтического агента.

Дальнейшее изучение Wnt сигнального пути и механизмов его регулирования даст возможность понять процессы, происходящие с клетками РПЭ при патологии, и использовать эти знания для разработки лекарственных средств нового поколения.

Вышеперечисленные Wnt сигнальные пути являются Fzd-зависимыми, в последнее время стали появляться данные о существовании Fzd-независимых путей.