Почвоведение, 2019, № 6, стр. 734-742

ВВЕДЕНИЕ

Почвенные актиномицеты традиционно считались мезофильными организмами, которые с трудом адаптируются к низким температурам. Однако в последнее десятилетие в литературе появляется все больше работ, посвященных выделению психротолерантных мицелиальных актинобактерий из холодных мест обитания, в том числе из полярных и тундровых почв и холодных фьордов, антарктических лишайников [9, 14]. Эндофитные психротолерантные комплексы актиномицетов обнаружены при исследовании арктоальпийских видов растений тундры Финляндии, а также выделены из арктических почв и водных экосистем Лапландии [10–12].

Актиномицеты играют важную роль в круговороте органического вещества в природе, препятствуют росту некоторых патогенов ризосферы растений и разлагают сложные полимерные соединения благодаря своим внутриклеточным ферментам. Почвенные актинобактерии вносят основной вклад в сохранение буферной способности почв и являются агентами биоконтроля почвенной среды, так как участвуют в фиксации азота и разложении высокомолекулярных соединений, таких как углеводороды, в загрязненных почвах [6].

Психротолерантные актиномицеты в холодных условиях окружающей среды обладают значительным потенциалом продукции биологически активных веществ, что имеет важное значение для биотехнологии [8, 13].

Исследования актиномицетов, адаптированных к низким температурам, позволяют расширить пределы наших представлений об экологических нишах, занимаемых мицелиальными актинобактериями. В настоящее время актуальной задачей является выявление среди холодостойких видов актиномицетов продуцентов новых биологически активных веществ. Адаптированные к холоду биологически активные вещества обладают многими преимуществами: активностью при низких температурах, возможностью вызывать реакции с достаточно высокой скоростью, энергосбережением, термической защитой продуктов и лучшим их качеством [7].

Тем не менее, сведений о распространении психротолерантных актиномицетов в растительных субстратах и почвах наземных экосистем в литературе немного, они изучены недостаточно. Своевременной является проблема определения функциональной активности и экофизиологических свойств мицелиальных актинобактерий в условиях низких температур, поскольку они составляют значительную часть гидролитического комплекса почв и растительных субстратов северных регионов.

Цель работы – характеристика таксономических и функциональных особенностей метаболически активных психротолерантных представителей филума Actinobacteria тундровых и таежных растительных субстратов и почв.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Образцы для исследования отобрали в северных регионах России и Финляндии в различных климатических зонах (табл. 1). Исследовали тундровые цветковые растения на полуострове Таймыр, мхи и очес на поверхности криоземов в Центральном Ямале и мохово-лишайниковой тундре в районе г. Воркуты, таежные мхи и лишайники на подзоле иллювиально-железистом в районе оз. Пяйянне, о‑ва Пайатсало в Финляндии, очес сфагновых мхов торфяной олиготрофной почвы Тверской области, торфяной окультуренной почвы Московской области, мхи и лишайники на дерново-подзолистой почве Калужской области в России.

Ниже приводятся описания исследуемых почв. Образцы почв отбирали из верхнего горизонта с глубины 0–5 см.

Тундровые почвы. Торфяно-криозем типичный (Histic Cryosol). Образцы отобрали в мохово-кустарничково-травяной тундре на территории Центрального Ямала на водоразделе. Профиль почвы: мох–О–Т1–ВСg. Значения рН находятся в диапазоне от 4 до 7, возрастая вниз по профилю.

Криозем грубогумусный глееватый (Haplic Cryosol) на территории мохово-лишайниково-кустарничковой тундры, окруженной болотными западинами, в районе г. Воркуты. Растительность представлена лишайником, голубикой, ерником, ивой и осоками. рН в исследуемом горизонте достигает 4.5.

Таежные почвы. Подзол иллювиально-железистый (Albic Podzol). Образцы отобрали на территории сосняка-черничника-зеленомошника вблизи оз. Пяйянне на о-ве Пайатсало южной части Финляндии. Почва кислая, значения pH водной вытяжки варьируют от 3.4 до 4.2. С_орг 0.5–1%. Почвенный профиль: O–E–BHF–C. Характеризуется относительно светлой окраской иллювиального горизонта, содержащего не более 2% гумуса. Содержание гумуса в подзолистом горизонте около 0.5–1%, состав фульватный.

Торфяная олиготрофная почва (Fibric Histosol). Образцы отобрали из верхового грядово-мочажинного полого-выпуклого болотного массива около д. Петрилово Западнодвинского района Тверской области. Образцы торфа отобрали из наиболее увлажненного участка, где концентрируется сток со значительной площади болотного массива, занятого шейхцериво-сфагновым микроландшафтом. Залежь сложена бедными верховыми торфами с низкой зольностью. В моховом ярусе присутствуют Sphagnum fuscum (Schimp) Kling и Sph. Magellanucum Brid.

Торфоземы, развитые на мощной древесной торфяной залежи (Fibric Histosols), расположены на мощных древесных торфах, подстилаемых залежью травяного и осокового торфа Яхромской поймы. Морфологический профиль следующий: гор. А пах характеризуется землистым темно-коричневым или коричневым цветом; верхний горизонт имеет мощность около 20 см с постепенным переходом от окультуренного горизонта к малоизмененному древесному или древесно-травяному торфу. Степень разложения окультуренного торфа обычно высока и достигает около 40%.

Метод посева на твердые питательные среды использовали для выделения и дифференцированного учета актиномицетов из растительных суспензий. Растертую надземную или подземную части растения массой 1 г после десорбирования растиранием в ступке (3 мин) помещали в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды, далее готовили разведение 1 : 300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1 [1]. В питательную среду Гаузе 1 добавляли нистатин (50 мкг/мл среды) для ограничения роста микромицетов.

Посевы инкубировали при температурах 5, 20 и 28°С до появления видимых колоний. Дифференцированный учет различных морфотипов колоний выполняли при микроскопировании на чашках с последующим выделением в чистую культуру на среду Гаузе 1. Выделенные культуры актиномицетов идентифицировали согласно определителю актиномицетов Гаузе с соавт. [1] с использованием культуральных, морфологических и физиологических признаков.

Температурные границы роста психротолерантных и мезофильных актиномицетов, принятые в работе, следующие: для мезофильных актиномицетов – диапазон роста от 20 до 42°С, оптимум роста при 28°С. Для психротолерантных актиномицетов – диапазон роста от 0 до 37°С с оптимумом от 5 до 20°С.

Длину мицелия актиномицетов определяли люминесцентно-микроскопическим методом [4]. Почвенную суспензию (разведение 1 : 100), предварительно обработанную на ультразвуковой установке УЗДН-19 (сила тока 0.40 A, частота 15 кГц) в течение 3 мин, наносили на тщательно обезжиренные предметные стекла и равномерно распределяли петлей на площади 4 см². Препараты высушивали на воздухе и фиксировали легким нагреванием над пламенем газовой горелки, после чего окрашивали раствором акридина оранжевого (1 : 10 000, 2–4 мин). Окрашенные препараты высушивали при комнатной температуре. При микроскопировании на препарат наносили каплю воды и покрывали обезжиренным покровным стеклом. Препараты просматривали на люминесцентном микроскопе Mikroskop Axioskop 2 Plus Carl Zeizz (Германия) со светофильтром “set 09”.

Измеряли длину мицелия актиномицета в 100 полях зрения для каждого варианта опыта и рассчитывали по формуле:

где М – длина мицелия в 1 г образца, мкм; а – средняя длина мицелия в поле зрения люминесцентного микроскопа, мкм; n – разведение наносимой суспензии, р – площадь поля зрения микроскопа.

При расчете биомассы учитывали, что 1 м сухого мицелия актиномицетов диаметром 0.5 мкм имеет массу 3.9 × 10^–8 г [4].

Флуоресцентный метод in situ гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH – fluorescent in situ hybridization) использовали для оценки разнообразия и численности метаболически активных представителей филогенетической группы Actinobacteria почвенных и растительных субстратов. Использование метода FISH позволило учесть живые, метаболически активные клетки представителей филогенетической группы Actinobacteria в исследуемых образцах. Окраска препаратов красителем акридиновым оранжевым дала возможность оценить общую численность клеток микроорганизмов в образцах, включая покоящиеся формы.

Опыт проводили по следующей методике [2]:

1. Почвенную суспензию (1 : 10) обрабатывали ультразвуком (2 мин, сила тока 0.40 А, частота 22 кГц). Клетки микроорганизмов отделяли от крупных частичек почвы трехкратным центрифугированием при 1 тыс. оборотов в течение 10 мин. Суспензию, полученную за три цикла обработки, центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 10 мин. Полученный осадок заливали стерильной дистиллированной водой до объема 2 мл.

2. Фиксацию образцов осуществляли с использованием формальдегида в качестве фиксирующего агента. 2 мл суспензии центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 5 мин, полученный осадок ресуспензировали в 0.5 мл фосфатного буфера (NaCl – 8.0 г, КС1 – 0.2 г, Na₂HPО₄ – 1.44 г, NaH₂PО₄ – 0.2 г, Н₂О – 1 л, рН 7.0), добавляли 1.5 мл 4%-ного раствора формальдегида в фосфатном буфере и инкубировали при комнатной температуре на качалке в течение 1.5 ч. Фиксированный материал собирали центрифугированием (8000 об./мин в течение 2 мин), промывали два раза фосфатным буфером, ресуспензировали в смеси этанола и фосфатного буфера (1 : 1) и до анализа хранили при –20°С.

3. Суспензию фиксированного образца в объеме 1 мкл наносили на предметные стекла для гибридизации с окошками, разделенными тефлоновым покрытием. Нанесенные на стекла фиксированные препараты клеток обрабатывали раствором лизоцима (10 мг в 1 мл 0.05 М EDTA и 0.1 М TRIS HC1, 1 : 1, рН 8.0) для увеличения проницаемости клеточных стенок бактерий. Полученные препараты выдерживали в течение 12–24 ч при комнатной температуре или в течение 1 ч при 37°С, затем обрабатывали последовательно в серии растворов этанола (50, 80 и 100%). Для гибридизации использовали набор рРНК-специфичных для группы Actinobacteria олигонуклеотидных зондов, с последовательностью нуклеотидов HGC69a-1CY3 TAT AGT TAC CAC CGC СGT, HGC69a-2 TAT AGT TAC GGC CGC CGT.

Синтез зондов, меченных флуоресцентным красителем СуЗ, осуществлялся компанией Синтол (Москва, Россия). Гибридизацию препаратов с флуоресцентно-мечеными зондами проводили в соответствии с методикой Amann (1995) при температуре 46°С [5].

По завершении процедуры гибридизации препараты докрашивали водным раствором акридина оранжевого (разведение 1 : 10 000, 2–4 мин). Избыток флуорохрома удаляли в процессе промывки, для чего стекла погружали на 10 мин в кюветы с дистиллированной водой. Препараты анализировали с использованием люминесцентного микроскопа ZEIZZ Mikroskop Axioskop 2 plus (Германия) со светофильтрами Filter set 15 для зондов и Filter set 09 для окраски акридиновым оранжевым. Численность микроорганизмов в образцах определяли путем учета количества гибридизованных с зондами клеток в 32 полях зрения микроскопа на одной ячейке.

Филогенетическое положение выделенных культур определяли на основании секвенирования гена 16S рРНК. Выделение ДНК из актиномицетной биомассы проводили с использованием набора реактивов Wizard Genomic DNA Purification Kit, технологии Promega, США, согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями [3]. Получение полноразмерной копии гена проводили на приборе Mastercycler personal (Eppendorf 11F, Германия) с использованием праймеров: 11F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', где M = C или A, Y = C или Т.

Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1×-буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH₄)₂SO₄, 67 мМ трис-HCl, pH 8.8, 2 мМ MgCl₂), 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы, 5 пмоль соответствующих праймеров (11F и 1492R), 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).

Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл – 94°С × 9 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин, последующие 30 циклов – 94°С × × 1 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин, завершающий цикл – 72°С × 7 мин.

Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рНК изучаемого штамма был проведен с помощью программы BLAST. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых актиномицетов производили с помощью методов, реализованных в пакете программ MEGA.

Численность метаболически активных представителей филогенетической группы Actinobacteria определяли по формуле:

где M – численность метаболически активных клеток в 1 г растительного субстрата, a – среднее количество метаболически активных клеток в поле зрения люминесцентного микроскопа, P – площадь поля зрения микроскопа, равная 39 740 мкм²_.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0. Все пробы анализировали в 5-кратной повторности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении процедур учета численности и выделения актиномицетов из тундровых и таежных растительных субстратов полагали, что при инкубировании посевов при 5 и 20°С выделяются психротолерантные актиномицеты, при 28°С – мезофильные актиномицеты.

Численность психротолерантных актиномицетов, выделенных из цветковых растений тундры на полуострове Таймыр, колебалась в пределах от десятков до сотен тысяч КОЕ/г растительного материала и превышала численность почвенных актиномицетов, которые составили в тундровой глеевой почве России тысячи и десятки тысяч КОЕ/г почвы. При этом в моховых разрастаниях и очесе на поверхности криоземов в тундре на полуострове Ямал и мохово-лишайниковой тундре в районе г. Воркуты (Россия) не выявлено психротолерантных актиномицетов при инкубировании посевов при 5°C в отличие от таежных мхов Финляндии, где они обнаруживались при аналогичных условиях инкубирования посевов. При 20°С из образцов тундровых мхов и очеса, отобранных в России, выделялись психротолерантные актиномицеты в сопоставимом числе с мезофильными формами (рис. 1).

В актиномицетном комплексе таежных мхов Финляндии численность психротолерантных актиномицетов превышала численность мезофильных форм и достигала десятков тысяч КОЕ/г растительного материала.

Сравнивая численность актиномицетов, выделенных из растительных субстратов тундры и тайги при разных температурах (рис. 2), можно увидеть, что психротолерантные актиномицеты выделялись активнее всего из образцов мха, взятых вблизи оз. Пяйянне на о-ве Пайатсало в Финляндии. Больше всего психротолерантных актиномицетов выделялось из образца мха 1 – Hylocomium splendens (Гилокомий блестящий).

Культуры, выделенные из образцов таежных мхов Финляндии, по фенотипическим признакам принадлежали к родам Streptomyces и Micromonospora (табл. 2). Наибольшее видовое разнообразие выделяемых актиномицетов наблюдалось в поверхностном слое (0–5 см) подзола иллювиально-железистого под мхами при инкубировании посевов при температуре 20 и 28°С. Помимо стрептомицетов из почвы Финляндии были выделены пигментированные оранжево-красные (шт. ФП.20.7) и бордово-розовые (шт. ФП.20.1, ФП.20.2, ФП.20.3) микромоноспоры. Пигментированные актиномицеты р. Micromonospora доминировали в почве Финляндии при всех температурах инкубирования посевов. При 20°С в почве появлялись актиномицеты секции и серии Helvolo-Flavus Helvolus.

Из некоторых образцов таежных мхов (3 Dicranum scoparium и 5 Sanionia uncinata) при инкубировании посевов при 5°С были выделены редкие психротолерантные актиномицеты секции Imperfectus, не образующие воздушного мицелия на минеральной среде Гаузе 1. Согласно своим морфологическим и культуральным свойствам, выделенные психротолерантные актиномицеты были определены как S. capuensis и S. tumemacerans. При инкубировании посевов при 20 и 28°С в большом количестве выделялись актиномицеты, принадлежащие к роду Streptomyces, таксономическим секциям и сериям Cinereus Achromogenes и Albus Albus.

После многократных пересевов культур морфологические и культуральные свойств выделенных актиномицетов сохранялись.

Во всех образцах таежных мхов Финляндии (кроме образца 2 Pleurozium shreberi) при инкубировании посевов при 5°С доминируют психротолерантные актиномицеты рода Micromonospora, составляя более 60% от всех выделенных актиномицетов.

Из почвы под мхами актиномицеты рода Micromonospora выделяются в меньшем количестве, чем из образцов мхов Финляндии, что, вероятно, может быть обусловлено наличием во мхах по сравнению с почвой большего количества веществ, являющихся источниками питания для микромоноспор.

В биотопе дриадника на полуострове Таймыр наиболее распространенными актиномицетами являются Cinereus Achromogenes и Helvolo-Flavus Helvolus, а в актиномицетном комплексе растений луга – Helvolo-Flavus Helvolus и Albus Albus. Из растения луга Papaver pulvinatum были выделены редкие фиолетовые актиномицеты секции и серии Cinereus Violaceus, а также розовые актиномицеты Roseus Lavendulae-roseus.

Применение дисперсионного анализа показало, что температура инкубирования посевов достоверно влияет на разнообразие выделяемых из растений актиномицетов. Величина разнообразия определяется температурой инкубирования культур. Вклад температуры в общую дисперсию составляет 30%. Отмечено снижение видового разнообразия при инкубировании посевов в температурном ряду 28 > 20 > 5°С.

Наблюдение за динамикой развития мицелия психротолерантных актиномицетов производили в микрокосмах с таежным мхом Pleurozium shreberi, отобранным вблизи оз. Пяйянне на о-ве Пайатсало в Финляндии (рис. 3). Инкубировали микрокосмы с таежным мхом при температурах 5 и 20°С. Микробную сукцессию инициировали увлажнением (60% полной влагоемкости). Исследования показали, что мицелий психротолерантных актиномицетов растет и развивается в микрокосмах с таежным мхом Pleurozium shreberi как при 5, так и при 20°С. Длина мицелия в таежном мхе Pleurozium shreberi составляла 120 м/г на четвертые сутки инкубирования при 20°С, увеличиваясь до 160 м/г на седьмые сутки опыта. На 14-е сут инкубирования при 5°С мицелий достигал 110 м/г, увеличиваясь до 120 м/г к 21-м сут, и сохранялся на этом уровне до конца эксперимента. К 21-м сут инкубирования при 20°С длина мицелия достигала 180 м/г.

Доля психротолерантных актиномицетов в бактериальном комплексе, выделенном из почвы и таежных мхов Финляндии (Dicranum scoparium и Polytrichum juniperinum) при инкубировании посевов при 5°С, составила 70–80%. В остальных случаях при инкубировании посевов из таежных мхов при 5, 20 и 28°С наблюдалось доминирование бактерий (более 70% от всех выделенных микроорганизмов).

Исследование прокариотного микробного сообщества растительных субстратов тундры и тайги методом FISH показало, что биомасса метаболически активных психротолерантных представителей филогенетической группы Actinobacteria составляет 34% от биомассы всех бактерий в прокариотном микробном сообществе таежных мхов при инкубировании субстрата при 5°С, а при 20°С эта доля увеличивается до 56% (рис. 4).

Психротолерантные метаболически активные мицелиальные актинобактерии по биомассе превышали одноклеточные, составляя больше половины актиномицетного комплекса таежных мхов Финляндии, как при 5°С (55%), так и при 20°С (59%) (рис. 5). При инкубировании тундровых цветковых растений полуострова Таймыр при 5°С одноклеточные представители филума Actinobacteria доминировали над мицелиальными и их доля составила 74%, но при повышении температуры до 20°С наблюдалось существенное увеличение доли мицелиальных актинобактерий до 77%.

Из растительных субстратов и торфяной почвы были выделены культуры актиномицетов, которые идентифицированы по фенотипическим и/или молекулярно-генетическим признакам.

Таким образом, составлена коллекция культур психротолерантных актиномицетов, выделенных из наземных экосистем тундры и тайги. Выделенные культуры психротолерантных актиномицетов отнесены к родам Streptomyces и Micromonospora.

Температурный диапазон роста выделенных и исследованных культур стрептомицетов лежит в области 5–37°C с оптимумом роста в области 20°C, что свидетельствует об их психротолерантности.

Доля психротолерантных метаболически активных представителей филума Actinobacteria в моховых разрастаниях Финляндии составляет 34% от биомассы метаболически активных представителей домена Bacteria в прокариотном микробном сообществе при инкубировании субстрата при 5, 20°С доля метаболически активных представителей филума Actinobacteria от биомассы бактерий увеличивается до 56%.

В моховых разрастаниях Финляндии метаболически активные психротолерантные мицелиальные и одноклеточные актинобактерии в филуме Actinobacteria прокариотного микробного сообщества составляют примерно равные доли по биомассе как при инкубировании субстрата при 5°С, так и при инкубировании субстрата при 20°С.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Численность психротолерантных актиномицетов в исследуемых субстратах наземных экосистем тундры и тайги варьирует от десятков тысяч до миллионов КОЕ/г субстрата и убывает в ряду: торфяная почва > растения > моховые разрастания > очес.

Психротолерантный актиномицетный комплекс растительных субстратов тундровых и таежных наземных экосистем представлен родами Streptomyces и Micromonospora.

Выявлены следующие экофизиологические особенности, свойственные актиномицетам в условиях низких температур: стабильность морфологических и культуральных свойств выделенных актиномицетов после многократных пересевов культур, появление более яркой окраски воздушного и субстратного мицелия и образование темных растворимых пигментов при повышении температуры инкубирования с 5 до 20°С. При низкой температуре инкубирования посевов (5°C) отмечено доминирование неокрашенных форм актиномицетов секций и серий Albus Albus и Cinereus Chromogenes. При 5°С в образцах мхов Dicranum scoparium и Sanionia uncinata выявлены актиномицеты S. capuensis и S. tumemacerans, секции Imperfectus, не образующие воздушный мицелий.

Образование темно-бурых и буровато-красных растворимых пигментов отмечено у большинства психротолерантных штаммов, выделенных из таежных мхов Финляндии, при повышении температуры инкубирования с 5 до 20°С.

Из образцов торфяной окультуренной почвы Яхромской поймы (Дмитровский район, Московская область) при температуре 20°С в большом количестве были выделены синие пигментированные стрептомицеты S. violaceoruber шт. N4.20.1.A и N4.20.1.B, интенсивно окрашивающие всю минеральную среду на чашках Петри в синий цвет.

Экспериментально доказано, что выделенные из исследованных растительных и почвенных субстратов тундровых и таежных наземных экосистем стрептомицеты по температурным предпочтениям являются психротолерантными.