Почвоведение, 2019, № 6, стр. 722-733

ВВЕДЕНИЕ

Среди загрязнителей окружающей среды в последние годы выделяют гормоноподобные ксенобиотики, которые могут быть причиной серьезных репродуктивных аномалий у живых организмов, вызывая у них феминизацию, снижение фертильности, гермафродитизм [32]. Свойство гормоноподобных ксенобиотиков вмешиваться в репродуктивный процесс обусловлено их способностью связываться со специфическими рецепторами половых стероидов и маскироваться под естественные половые гормоны (тестостерон, эстрадиол). Последнее обусловлено тем, что подобно стероидным гормонам, в структуре многих гормоноподобных ксенобиотиков присутствует фенольное кольцо.

Одно из ведущих мест среди гормоноподобных загрязнителей окружающей среды занимают нонилфенолы (НФ). НФ используются при производстве поверхностно-активных веществ – оксиэтилированных нонилфенолов, присадок к смазочным маслам, смол и других полимеров, пестицидов и др. Массовое попадание НФ в окружающую среду обусловлено и их образованием в результате разложения неионогенных поверхностно-активных веществ – нонилфенолэтоксилатов, широко используемых в промышленности и быту. Доля НФ в мировом производстве составляет 85% от всех производимых алкилфенолов. В результате сброса бытовых и промышленных стоков НФ загрязнены поверхностные воды как пресноводных, так и морских экосистем. Почвы могут быть загрязнены НФ за счет размещения осадков сточных вод (ОСВ). Загрязнение почвы НФ происходит и при не санкционированных свалках твердых биологических отходов. В Западной Европе и Северной Америке около 30% всех ОСВ используются в сельском хозяйстве. В Великобритании ОСВ используют для удобрения около 1.5% сельскохозяйственных угодий. Для этого на поля вносится около 350 тыс. т ОСВ в пересчете на сухое вещество. В Российской Федерации ежегодно накапливается около 2.6 млн т ОСВ в пересчете на сухое вещество [10]. Из этого количества от 4 до 10% используется в качестве удобрений [5]. В зависимости от количества внесенных органических удобрений (навоза) и осадков сточных вод содержание НФ в почвах варьирует в пределах 0.01–4900 мкг/кг сухой почвы [24, 33]. Сильнозагрязненные почвы могут содержать сотни миллиграмм НФ в 1 кг почвы [14]. НФ оказывают токсическое воздействие на водные и почвенные организмы, такие как водоросли, ракообразные, моллюски, рыбы, ногохвостки, дождевые черви, растения и др. [6, 16, 21, 36, 38]. Благодаря высокой биоаккумуляционной способности НФ могут накапливаться в водных и почвенных организмах, а также в растениях [15]. Продвигаясь по пищевой цепи, НФ попадают и в организм человека, представляя серьезную угрозу для здоровья.

В силу этих причин в ряде стран Европейского Союза введены ограничения на производство и использование НФ, регламентировано содержание НФ в объектах окружающей среды. Использование НФ в странах ЕС ограничено с 2005 г. НФ и его прекурсор – этоксилированный НФ включены в Список приоритетных опасных веществ Водной рамочной директивы ЕС. В соответствии с Нормативами качества окружающей среды (Приложение 1 Директива 2008/105/ЕС) предельно допустимая концентрация НФ в водоемах составляет 2 мкг/дм³. Содержание НФ в окружающей среде строго контролируется в США и Канаде. По нормам Агентства Соединенных Штатов по защите окружающей среды (ЕРА) содержание НФ в пресных и соленых водах не должно превышать 6.6 и 1.7 мкг/л соответственно, а в почве – 2.6 мг/кг. В Канаде допускается более высокое содержание НФ в почве, от 5.7 до 14 мг/кг в зависимости от их назначения, а нормативы содержания НФ в водоемах более строгие по сравнению с США – 1.0 и 0.7 мкг/л для пресноводных и соленых водоемов соответственно. Однако многие страны, включая Россию, Китай, Индию, продолжают производить и использовать НФ в больших количествах, содержание НФ в объектах окружающей среды в этих странах не регламентируется.

При попадании НФ в почву большая часть поллютанта остается в поверхностных слоях (0–20 см), с глубиной количество НФ уменьшается [26]. С течением времени в почве за счет биологических процессов (главным образом микробиологической деструкции) происходит деградация НФ. Время полураспада НФ в почве T₅₀ в лабораторных условиях составляет от одного до 25 дней в зависимости от исходной концентрации НФ и типа почвы. При этом в конце эксперимента (до 120 дней) в почве остается до 30% НФ от исходного содержания [23]. Неполную деградацию НФ в почвах объясняют его прочной сорбцией органическим материалом, главным образом, гуминовыми кислотами [25]. В полевых условиях деградация НФ в почвах происходит значительно медленнее. Так, при исходном содержании НФ в почве 0.887 мг/кг T₅₀ в лабораторных экспериментах и полевых условиях составляет 12 и 257 дней соответственно [23].

Проблема очистки загрязненных НФ почв как на теоретическом, так и на практическом уровне разработана недостаточно. За рубежом из донных отложений, активных илов очистных сооружений, загрязненных почв выделяют культуры бактерий, дрожжей и грибов, способных трансформировать и/или использовать НФ в качестве источника углерода и энергии [17, 28, 39], изучаются процессы фиторемедиации почв [23]. Практически отсутствуют в литературе данные по влиянию НФ на почвенную микробиоту, в том числе на видовое разнообразие микробоценозов. В России исследования по этим проблемам до настоящего времени не проводились.

Цель настоящего исследования – изучение влияния гормоноподобного ксенобиотика НФ на численность, таксономическую структуру микробного сообщества и токсичность дерново-подзолистой суглинистой почвы (Eutric Albic Retisol (Abruptic, Loamic, Aric, Ochric)) Ленинградской области.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали верхние горизонты (0–20 см) дерново-подзолистой суглинистой почвы (Eutric Albic Retisol (Abruptic, Loamic, Aric, Ochric)), отобранной с опытного поля Санкт-Петербургского государственного аграрного университета (г. Пушкин). Агрохимические показатели почвы, просеянной через сито (2 мм), определяли по стандартным методикам [2]. Агрохимическая характеристика почвы представлена в табл. 1.

Технический НФ CAS: 84852-15-3 производства Sigma-Aldrich, США растворяли в 4 мл ацетона и добавляли к 10 г стерильного кварцевого песка. После выпаривания ацетона (в течение 1 ч), обработанный НФ кварцевый песок смешивали с увлажненной почвой (60% от полной влагоемкости), создавая концентрацию НФ 30 и 300 мг/кг сухой почвы. В эксперименте использовали два контрольных варианта почв: 1 – дерново-подзолистую суглинистую с добавлением кварцевого песка (с предварительно выпаренным ацетоном, не содержащим НФ); 2 – дерново-подзолистую суглинистую с добавлением чистого кварцевого песка. Статистически значимых (р ≤ 0.05) различий в численности и структуре микробного сообщества между вариантами 1 и 2 контрольных почв не выявлено (данные не представлены). Для определения абиотической убыли НФ в почвенных образцах постановку эксперимента проводили аналогично вышеописанной схеме с использованием стерильной дерново-подзолистой суглинистой почвы. Стерилизацию образцов почвы (по 100 г сухой почвы) обеспечивали автоклавированием при давлении 1 атм в течение 1 ч 20 мин. Стерильность почвенных образцов контролировали на 1, 30 и 90 сут эксперимента путем высева почвенной суспензии на стандартные питательные среды. Почвенные образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 90 сут и влажности почвы 60% от полной влагоемкости. Увлажнение почвенных образцов проводили один раз в неделю до уровня 60% от полной влагоемкости. Пробы отбирали в 1, 30 и 90 сут эксперимента. Численность и групповой состав почвенной микробиоты определяли общепринятыми в почвенной микробиологии методами высева почвенной суспензии на стандартные питательные среды: мясо-пептонный агар (МПА) – гетеротрофные микроорганизмы, усваивающие органические формы азота; крахмало-аммиачный агар (КАА) – актиномицеты и бактерии, использующие минеральные формы азота; среду Эшби – олигонитрофильные микроорганизмы; Гетчинсона – целлюлозоразрушающие микроорганизмы; МПА (1 : 10) – олиготрофные микроорганизмы. Численность спорообразующих бактерий учитывали на МПА, посев проводили из предварительно пастеризованной в течение 10 мин при температуре 80°С почвенной суспензии. Количество толерантных к НФ бактерий учитывали на среде, следующего состава: (NH₄)₂SO₄ – 0.4%, K₂HPO₄ – 0.15%, KH₂PO₄ – 0.15%, MgSO₄ × 7H₂O – 0.02%, агар-агар – 2% с добавлением 300 мг/л НФ. Десорбцию микроорганизмов с почвенных частиц осуществляли путем обработки водно-почвенной суспензии ультразвуком (частота 40 КГц) в ультразвуковой ванне DA-963 (КНР) в течение 10 мин, а затем встряхиванием на шейкере Certomat BS-1 (180 об./мин) в течение 10 мин. Коэффициент минерализации органических соединений рассчитывали как отношение численности микроорганизмов, усваивающих минеральные формы азота (учтенных на КАА), к численности микроорганизмов, усваивающих органические формы азота (учтенных на МПА); коэффициент олигонитрофильности рассчитывали как отношение численности олигонитрофильных микроорганизмов (учтенных на среде Эшби) к численности гетеротрофов (учтенных на МПА) [3]. Эксперименты проводили в трехкратной повторности.

Таксономический состав микробного сообщества образцов дерново-подзолистой суглинистой почвы изучали с использованием метода пиросеквенирования (Illumina MiSeq). Для молекулярно-генетического анализа отбирали пробы почв массой 0.5–1 г в трехкратной повторности. До выделения ДНК пробы хранили в герметично закрытых стеклянных флаконах при температуре – 20°С. ДНК выделяли из навески почвы 0.5 г, согласно методике, описанной Андроновым с соавт. [1]. Очищенный препарат ДНК использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР с универсальными праймерами к вариабельному участку V4 гена 16S рРНК F515 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA и R806 GGACTACVSGGGTATCTAAT с добавлением олигонуклеотидных идентификаторов для каждой пробы и служебных последовательностей, необходимых для пиросеквенирования. Используемые праймеры сконструированы на основе анализа нуклеотидных последовательностей, как бактерий, так и архей, и позволяют амплифицировать фрагмент гена 16S рРНК длиной примерно 400 п. н. Подготовку проб и секвенирование проводили на приборе Illumina MiSeq согласно рекомендациям производителя. Секвенирование проводили с использованием оборудования ЦКП “Геномные технологии, протеомика и клеточная биология” ФГБНУ ВНИИСХМ. Данные обрабатывали с помощью программы QIIME 1.8.0 [12]. Сиквенсы объединяли в операционные таксономические единицы на основе 97%-ного порога сходства нуклеотидного состава. Общее разнообразие прокариотных сообществ (альфа-разнообразие) почвенных образцов оценивали по количеству выделенных операционных таксономических единиц, индексам Шеннона и Chao1 [11].

Для экстракции НФ из почвенных образцов к 1 г лиофильно высушенного почвенного образца добавляли 5 мл гексана, встряхивали в течение 1 мин, затем трижды по 15 мин обрабатывали ультразвуком (частота 40 КГц) в ультразвуковой ванне DA-963 (КНР). Далее добавляли 5 мл 0.095 М раствора тетрабутиламмоний сульфата в 50 мM NaH₂PO₄, встряхивали и снова обрабатывали ультразвуком дважды по 10 мин. После этого образцы центрифугировали 10 мин при 6000 об./мин и замораживали. Декантированные гексановые экстракты высушивали с безводным сульфатом натрия, а затем испаряли досуха в потоке газообразного азота. Полученные сухие экстракты растворяли в 400 мкл 100% ацетонитрила, центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 1 мин. Для получения пробы для хроматографирования к 200 мкл надосадочной жидкости добавляли 300 мкл дистиллированной воды.

Анализ содержания НФ проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе Hewlett-Packard H 1090 с диодно-матричным детектором при длине волны 278 нм с разрешением 1.2 нм. Условия хроматографирования: колонка Discovery HS C18 (7.5 см × 2.1 мм, 3 мкм) производства Supelco (США), температура колонки – 35°С, скорость потока элюента – 0.4 мл/мин, объем пробы – 200 мкл. В качестве элюента использовали 70%-ный водный раствор ацетонитрила, содержащий 0.1% трифторуксусной кислоты. Степень извлечения НФ из почвенных образцов составляла 98 ± 1%. Коэффициенты скорости деструкции НФ в быстрой фазе (k) и корреляционные коэффициенты (R) рассчитывали согласно [19].

Фитотоксичность почвенных образцов определяли путем сравнения статистически значимых различий по длине корней и проростков пшеницы мягкой (Tríticum aestívum), выросших на загрязненных и контрольных почвах через трое суток [8]. Критерием токсичности является ухудшение показателей развития растений в тестируемых вариантах более чем на 20% относительно контроля.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика содержания НФ в дерново-подзолистой суглинистой почве. В почвенных образцах происходит уменьшение содержания НФ вследствие его биодеградации, главным образом, почвенными микроорганизмами. На биологический характер процесса деструкции НФ указывает отсутствие его убыли в стерильных почвенных образцах (рис. 1).

Рис. 1.

Убыль НФ в дерново-подзолистой суглинистой почве: 1 – 30 мг НФ/кг а.с.п.; 2 – 300 мг НФ/кг; 3 – стерильная почва (30 мг НФ/кг); 4 – стерильная почва (300 мг НФ/кг).

Процесс убыли НФ состоит из двух фаз: быстрой и замедленной. В течение первых 30 сут инкубирования (быстрая фаза) в почвенных образцах деградировано 69 и 59% от внесенного НФ – 30 и 300 мг/кг сухой почвы соответственно. За быстрым периодом следует период замедленной убыли поллютанта, в течение которого биодеградации подверглось еще 10 и 14% НФ соответственно. К концу эксперимента (через 90 сут) в почвенных образцах оставалось 6.3 и 81.0 мг НФ/кг, что соответствует 21 и 27% от внесенных количеств НФ – 30 и 300 мг/ кг.

Скорость деструкции НФ в быстрой фазе может быть выражена уравнением реакции первого порядка, что подтверждается высокими значениями корреляционных коэффициентов R > 0.95 (рис. 2, табл. 2).

Рис. 2.

Удаление НФ из среды как функция времени при исходном содержании 30 (1) и 300 мг/кг (2).

Убыль НФ в почвенных образцах зависит от начальной концентрации поллютанта. С повышением исходной концентрации НФ от 30 до 300 мг/кг скорость его биодеградации снижается в 1.3 раза, время полураспада НФ возрастает в 1.5 раза.

Выявленная двухстадийность убыли НФ и зависимость скорости биодеградации ксенобиотика от его содержания в дерново-подзолистой суглинистой почве согласуются с исследованиями [19], выполненными с использованием других типов почв: кислого глинистого грунта и известковой песчаной почвы.

Влияние НФ на численность основных физиологических групп микроорганизмов дерново-подзолистой суглинистой почвы. Внесение НФ в почву вызывает дозо- и время зависимые изменения численности основных физиологических групп микробного сообщества (табл. 3). Через сутки после загрязнения почвенных образцов 30 мг/кг НФ наблюдается статистически достоверное (р < 0.05) снижение численности актиномицетов и олиготрофных микроорганизмов в 3.4 и 1.8 раз соответственно. Десятикратное увеличение дозы НФ до 300 мг/кг после суточного инкубирования почвенных образцов привело к уменьшению содержания более широкого спектра исследуемых бактериальных групп. Помимо снижения численности актиномицетов и олиготрофных бактерий в 2.7 и 3.9 раз соответственно, наблюдается уменьшение численности гетеротрофных микроорганизмов в 1.8 раза, олигонитрофилов в 2.4 раза и бактерий, усваивающих минеральные формы азота, в 1.6 раза. При этом статистически значимых отличий в количестве спорообразующих и целлюлозоразрушающих бактерий в загрязненных НФ и контрольных (незагрязненных НФ) вариантах в 1 сут эксперимента не выявлено.

Направленность действия НФ на численность отдельных групп микробного сообщества значительно изменяется после 30 и 90 сут воздействия токсиканта. При внесении как низкой дозы НФ (30 мг/кг), так и высокой (300 мг/кг) через 30 сут общая численность гетеротрофных микроорганизмов, в том числе целлюлозоразрушающих бактерий возрастает почти в 2 раза. В почвенных вариантах с низким содержанием НФ (30 мг/кг) наблюдается увеличение количества олигонитрофилов (на 59%), при этом в вариантах с высоким содержанием НФ (300 мг/кг) по сравнению с суточным воздействием токсиканта через 30 сут происходит восстановление численности олигонитрофильных микроорганизмов практически до уровня контрольных вариантов. Высокие дозы НФ также приводят к увеличению числа олиготрофных бактерий почти в 3 раза. Через 30 сут после внесения токсиканта в почвенные образцы в вариантах с низкой дозой НФ в микробном сообществе наблюдается восстановление численности актиномицетов, одной из наиболее чувствительных групп микроорганизмов, до контрольного уровня. Однако в почвенных образцах, загрязненных высокой дозой НФ, содержание актиномицетов и спорообразующих бактерий в 1.8 и 2.3 раза соответственно меньшее по сравнению с контрольной почвой. Содержание бактерий, усваивающих минеральные формы азота, в почвенных образцах, загрязненных низкой дозой НФ, возрастает в 1.4 раза, в то время как десятикратное увеличение содержания НФ приводит к значительному (в 2.7 раза) сокращению численности этой группы микроорганизмов.

Через 90 сут инкубирования сохраняется тенденция к увеличению численности гетеротрофных и олиготрофных микроорганизмов в почвенных образцах, загрязненных НФ, выявленная через 30 сут, причем степень этого увеличения значительно возрастает: количество гетеротрофов увеличивается в 2.3 и 5 раз, олиготрофов – в 1.5 и 4 раза при исходном содержании НФ 30 и 300 мг/кг соответственно. Особо следует выделить группу целлюлозоразрушающих бактерий: увеличение вдвое их численности при высокой дозе НФ (300 мг/кг), наблюдавшееся через 30 сут инкубирования, по истечении 90 сут сменилось на значительное (на 57%) уменьшение их количества. Выявленный эффект, возможно, связан с высокой чувствительностью данной группы микроорганизмов к образовавшимся продуктам деструкции НФ. Противоположный эффект наблюдался при определении количества бактерий, усваивающих минеральные формы азота: после 90 сут инкубирования их численность в почвенных вариантах, загрязненных НФ в концентрации 300 мг/кг, возросла по сравнению с контрольными в 1.4 раза. Наиболее чувствительными к воздействию НФ при концентрации 300 мг/кг являются актиномицеты, спорообразующие и целлюлозоразрушающие бактерии. При инкубировании почвенных образцов в течение 90 сут наблюдается статистически достоверное (р ≤ 0.05) уменьшение их содержания в почве по сравнению с контрольным вариантом.

Учитывая важную роль актиномицетов в процессе почвообразования и разложении недоступных для бактерий трудногидролизуемых соединений, выявленное снижение численности актиномицетов по мере возрастания уровня нагрузки, и на фоне увеличения общей численности гетеротрофных бактерий может привести к изменению интенсивности и направленности элементарных почвенных процессов. Снижение численности актиномицетов характерно для многих антропогенно-нарушенных почв [4, 9].

Дозозависимое увеличение микробной биомассы в первые 7 сут инкубирования ранее отмечено в образцах кислого глинистого грунта и известковой песчаной почвы, загрязненных НФ в концентрации от 80 до 240 мг/кг, о чем свидетельствует рост количества микробного углерода и азота. Однако в отличие от наших результатов при дальнейшем инкубировании почв (до 120 сут) различия между обработанными НФ и контрольными вариантами были незначительными [19]. Увеличение общего числа бактериальных клеток, в том числе метаболитически активных, зафиксировано в донных осадках, загрязненных НФ [20].

Увеличение численности отдельных групп микроорганизмов при загрязнении почвы НФ, скорее всего, связано с использованием его микроорганизмами как дополнительного питательного субстрата. При этом количество чувствительных к НФ микроорганизмов снижается, а устойчивые формы активно развиваются, о чем свидетельствуют полученные данные по численности толерантных к НФ бактерий (рис. 3). Количество толерантных к НФ микроорганизмов через 30 и 90 сут культивирования в 4 и 1.5 раза соответственно, превышает численность толерантных микроорганизмов в контрольной почве, не содержащей НФ.

Рис. 3.

Численность микроорганизмов, толерантных к НФ: 1 – контроль, 2 – 300 мг НФ /кг.

В пользу предположения об использовании микроорганизмами НФ как источника углерода свидетельствуют многочисленные данные об участии микроорганизмов различных таксономических групп в процессах биодеградации НФ [22, 27, 29]. Рост общей численности бактерий, в том числе за счет увеличения популяции бактерий-деструкторов, наблюдался при загрязнении почвы другими ксенобиотиками: нафталином, нефтью, дизельным топливом, диоктилфталатом и др. [9].

Снижение коэффициентов минерализации и олигонитрофильности через 30 и 90 сут инкубирования почвенных образцов свидетельствует о замедлении интенсивности процессов микробиологической минерализации органических веществ и процессов иммобилизации азота в загрязненных НФ почвах.

Влияние НФ на таксономический состав микробного сообщества дерново-подзолистой суглинистой почвы. При загрязнении НФ дерново-подзолистой суглинистой почвы происходит изменение не только численности, но и таксономического состава микробного сообщества (рис. 4).

Рис. 4.

Таксономическая структура (на уровне филумов) прокариотных сообществ дерново-подзолистой суглинистой почвы в условиях действия НФ в течение 1 (А) и 90 (Б) суток. 1 – Crenarchaeota, 2 – Acidobacteria, 3 – Actinobacteria, 4 – Bacteroidetes, 5 – Chloroflexi, 6 – Firmicutes, 7 – Proteobacteria, 8 – Cyanobacteria, 9 – Gemmatimonadetes, 10 – Planctomycetes, 11 – Verrucomicrobia, 12 – другие.

Анализ структуры почвенных микробных сообществ, при помощи высокопроизводительного секвенирования гена 16S рРНК показал, что абсолютное большинство в контрольных (незагрязненных НФ) образцах дерново-подзолистой почвы на уровне доменов, составляют бактерии (94.1%), доля архей 4.7%. Структура прокариотных сообществ исследуемой почвы сформирована преимущественно филумами Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Chloroflexi, Bacteroidetes, Acidobacteria, Planctomycetes, Gemmatimonadetes, составляющими обычно ядро почвенных бактериальных сообществ [18], и археем филума Crenarchaeota, являющимся устойчивым и универсальным компонентом почвенного микробного сообщества. Наибольшие доли в микробиоме почвы имеют группы Actinobacteria (48%) и Proteobacteria (20.5%), часто занимающие доминантное положение в почвенных микробных сообществах. Помимо актинобактерий и протеобактерий, значительную долю в незагрязненной НФ почве составляют представители групп Firmicutes (9.0%), Chloroflexi (5.4%), Bacteroidetes (3.7%), Acidobacteria (3.2%), Planctomycetes (1.2%), Gemmatimonadetes (1.1%), Cyanobacteria (1%). Небольшой вклад менее 1% в общий состав микробного сообщества вносят филумы Verrucomicrobia и Nitrospirae. Доля неидентифицированных доменов составила 0.8%.

При сравнительном анализе таксономической структуры микробного сообщества через сутки после внесения 30 мг НФ/кг абсолютно сухой почвы выявлено, что по сравнению с контрольными образцами почвы соотношение доминирующих бактериальных филумов практически не изменилось, однако доля минорных филумов Cyanobacteria и Nitrospirae возросла в 1.7 и 2 раза соответственно. Число архей группы Crenarchaeota, представленных родом Candidatus nitrososphaera, увеличилось на 40%. На уровне родов отмечается сокращение доли прокариот Cellulomonas, Rhodococcus, Flavisolibacter, Anaerolinea.

При десятикратном (до 300 мг/кг) увеличении внесенной в почву дозы НФ выявлены значительные изменения таксономического состава микробного сообщества. На уровне доменов происходит снижение относительной доли практически всех выявленных групп бактерий и архей, за исключением доминирующего филума Actinobacteria, доля которого возросла до 80% от общего микробного сообщества, а на уровне семейства Micrococcaceae, преобладающего в этом филуме, до 70%. При этом содержание бактерий рода Cellulomonas, относящегося к филуму Actinobacteria, сократилось более чем в 2 раза. Количество протеобактерий, представленных в основном бактериями из семейств Comamonadaceae и Xanthomonadaceae родов Ramlibacter и Lysobacter, соответственно, снизилось с 20.5 до 6.8%. Относительная доля филумов Acidobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Cyanobacteria, Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Verrucomicrobia сократилась от 3 до 5 раз. На уровне родов наблюдается значительное уменьшение доли архей рода Candidatus nitrososphaera и бактерий родов Cellulomonas, Mycobacterium, Rhodococcus, Flavisolibacter, Anaerolinea, Bacillus, Clostridium, Kaistobacter, Polaromonas, Ramlibacter, Anaeromyxobacter, Lysobacter.

Через 90 сут инкубирования содержание идентифицированных архей в опытных образцах почв не отличалось от контрольных образцов и составило 0.9%.

Значительные изменения в опытных образцах почв произошли в таксономической структуре на уровне бактериальных сообществ. В варианте с внесенным в почву НФ в дозе 300 мг/кг через 90 сут доля доминирующего филума Actinobacteria снизилась до 8.1%, как по сравнению с суточным воздействием НФ (80.4%), так и по сравнению с содержанием филума в контрольной почве (46.9%). Следует отметить, что внесение более низкой дозы НФ – 30 мг/кг по истечении 90 сут не привело к значимому изменению доли Actinobacteria как по сравнению с контрольной почвой, так и суточным воздействием НФ. Однако при этом наблюдается сокращение доли филумов Acidobacteria и Gemmatimonadetes и увеличение доли Chloroflexi.

При внесении в почву 300 мг НФ/кг через 90 сут сохраняется тенденция к дальнейшему сокращению относительной доли филумов Acidobacteria, Gemmatimonadetes, Bacteroidetes и Chloroflexi. Однако на фоне снижения вышеперечисленных групп бактерий доля филумов Proteobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes, Cyanobacteria, напротив, возрастает. При этом доминирующим филумом в таксономической структуре микробного сообщества становится Proteobacteria, доля которого превышает 78%. Увеличение доли Proteobacteria на уровне родов происходит в основном за счет Acinetobacter, Lysobacter, Ramlibacter, а также родов Pseudomonas, Thermomonas и Geobacter, среди представителей которых выявлены деструкторы алкилфенолов [30, 31, 37]. Следует отметить, что доминирование протеобактерий является характерной чертой для нарушенных почвенных местообитаний, в том числе загрязненных токсичными ксенобиотиками [9]. Протеобактерии, включая Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria и Gammaproteobacteria, были доминирующей группой в процессах биодеструкции НФ в грунтовых водах, загрязненных сточными водами [26]. Ванг с соавт. [35] также указывали на доминирование Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria, наряду с Bacteroidetes в речных донных осадках, загрязненных НФ.

Загрязнение почвы НФ в концентрации 300 мг/кг обедняет видовой состав микробоценоза, на что указывает снижение индексов Шеннона, Chao1 и количества операционных таксономических единиц. В присутствии низких доз НФ (30 мг/кг) видовое разнообразие прокариотного сообщества дерново-подзолистой суглинистой почвы практически не отличается от контрольных вариантов (табл. 4).

Уменьшение видового разнообразия бактериоценозов раннее отмечалось в почвах, характерных для вадозных зон русла рек северного Китая, загрязненных эндокринными деструкторами [26], а также в донных осадках, содержащих НФ в концентрации 125–150 мг/кг, как в аэробных [35], так и анаэробных условиях [13]. Однако имеются и противоположные результаты. Китайские исследователи экспериментально установили увеличение видового разнообразия бактериального сообщества речных осадков в анаэробных условиях под воздействием НФ в концентрации 100 мг/кг [34].

Обработанные НФ почвы (300 мг/кг) обладают фитотоксичностью (пшеница Tríticum aestívum) на протяжении месячного инкубирования (рис. 5).

Рис. 5.

Влияние загрязнения почвы НФ (30 (а) и 300 мг/кг (б)) на фитотоксичность в отношении пшеницы мягкой Tríticum aestívum: 1 – 1, 2 – 30, 3 – 90 сут.

По истечении трехмесячного периода наблюдений фитотоксичность загрязненных образцов почв в отношении данных тест-объектов не выявлена, что может быть связано со значительной (до 78%) деструкцией НФ почвенными микроорганизмами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В образцах дерново-подзолистой суглинистой почвы, загрязненных НФ, происходит снижение содержания гормоноподобного ксенобиотика в основном за счет его биодеструкции почвенными микроорганизмами. После 90 сут инкубирования в почве было деградировано более 70% поллютанта при исходном его содержании 30 и 300 мг/кг. С увеличением исходного содержания НФ в почве возрастает время его полураспада и снижается скорость деструкции.

Нонилфенолы оказывают дозо- и время зависимое влияние на численность основных групп почвенных микроорганизмов. Выявлена различная чувствительность микроорганизмов основных физиологических групп к ксенобиотику. В присутствии НФ происходит значительное увеличение количества гетеротрофных и олиготрофных микроорганизмов, а также бактерий, толерантных к НФ. Наиболее чувствительными к НФ являются актиномицеты и спорообразующие бактерии. По истечении длительного 90-суточного срока инкубирования при значительном (до 73%) уменьшении содержания НФ в почве количество этих микроорганизмов не восстанавливается, их численность не превышает 50% от содержания в контрольной, не загрязненной НФ почве.

При загрязнении НФ дерново-подзолистой суглинистой почвы выявлены значительные сдвиги в таксономическом составе микробного сообщества. Существенные изменения отмечены в соотношении филумов, занимающих наибольшие доли в микробиоме: Actinobacteria и Proteobacteria. Через 90 сут доля Actinobacteria сократилась до 8%, при этом доминирующим филумом в таксономической структуре микробного сообщества становится Proteobacteria, доля которого превысила 78%. Увеличение доли Proteobacteria на уровне родов происходит в основном за счет Acinetobacter, Lysobacter, Ramlibacter, а также Pseudomonas, Thermomonas и Geobacter, среди представителей которых выявлены деструкторы алкилфенолов. В загрязненных НФ почвах формируется новое микробное сообщество. Согласно количеству обнаруженных операционных таксономических единиц на основе 97%-ного порога сходства нуклеотидного состава, индексов Шеннона и Chao1, характерной чертой микробоценоза дерново-подзолистой почвы, загрязненной НФ, становится более низкий уровень видового разнообразия.

Оценка коэффициентов эколого-трофической структуры микробного сообщества исследуемой почвы показала, что в дерново-подзолистой почве, загрязненной НФ, происходит снижение интенсивности процессов микробиологической минерализации азотсодержащих органических веществ, а также замедление процессов иммобилизации азота.

Выявлена фитотоксичность образцов почвы, загрязненной высокой дозой НФ 300 мг/кг в течение месячного инкубирования.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке научно-обоснованной методологии биоремедиации почв, загрязненных гормоноподобными токсикантами. Изменения филогенетической структуры почвенных микробоценозов могут выступать в качестве чувствительного биоиндикатора экологического состояния почв.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013–2020 гг. в ходе реализации темы “Воздействие антропогенных гормоноподобных загрязнителей на почвенные и водные микробоценозы Северо-Запада РФ” г.р. № 01201360068.