Почвоведение, 2020, № 6, стр. 726-737

ВВЕДЕНИЕ

Глифосат (N-(фосфометил)-глицин) был веден в практику сельского хозяйства в 1974 г. в качестве неселективного гербицида под торговым названием раундап. Патент на исключительное производство раундапа за пределами США истек в 1991 г., а в США – в 2000 г. Это привело к резкому снижению цен на гербицид и росту количества производителей. Только в первый год после отмены патента цена на глифосат снизилась на 40%, и сейчас его производство существует в США, Европе, Австралии, Китае [54]. В России глифосат производит Кирово-Чепецкая химическая компания. Кроме того, компаниями “Группа Оргсинтез” запланировано к 2020 г. строительство завода по производству глифосата объемом выпуска до 30 тыс. т в год.

Глифосат обладает уникальным механизмом действия: он ингибирует 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу – фермент, участвующий в синтезе ароматических аминокислот и присутствующий в растениях, бактериях и грибах, но отсутствующий у животных [24]. Это позволило долгое время позиционировать глифосат как безопасный пестицид [33], и его применение увеличивалось с каждым годом: только в США с 1974 г. по 1995 г. оно возросло с 0.36 до 12.5 тыс. т, т.е. почти в 35 раз [15]. Дополнительным стимулом стало введение в 1996 г. в сельскохозяйственную практику устойчивых к глифосату генно-модифицированных (ГМ) культур, и в настоящее время глифосат стал самым широко используемым гербицидом [24] с ежегодным потреблением (по данным на 2014 г.) около 826 тыс. т [15]. В России гербициды на основе глифосата разрешены для применения не только в сельском хозяйстве, но и в личных хозяйствах, что повышает риски его неправильного использования. Всего в 2019 г. в нашей стране рекомендовано к употреблению 86 гербицидов на основе глифосата (https://www. agroxxi.ru/goshandbook). Применение глифосата подразумевает опрыскивание вегетирующих растений, однако при такой обработке 70–95% пестицида поступает в почву [7]. Кроме того, глифосат попадает в почву вместе с растительными остатками. Это приводит к накоплению в почвах остаточных количеств глифосата, содержание которых может достигать величин более 1.5 мг/кг почвы [12, 52].

В почве глифосат быстро инактивируется вследствие сорбции и минерализации [7, 16]. Существует два основных пути биологической деградации глифосата: с разрывом связи C–N и образованием аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) и глиоксилата или с разрывом связи C–P с образованием саркозина (N-метилглицин) и неорганического фосфата ${\text{PO}}_{4}^{{3--}}$ [9, 22]. В дальнейшем глиоксилат служит источником углерода, а фосфаты – фосфора. Деградация глифосата с образованием АМФК более распространена среди бактерий. Ее способны осуществлять бактерии, выделенные как из загрязненных глифосатом сред, так и из прежде не обрабатываемых гербицидом местообитаний. Разрушение связи C–N происходит с помощью фермента глифосат-оксидоредуктазы. Этот метаболический путь был обнаружен у бактерий филумов Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes и Proteobacteria [27, 60]. Разложение глифосата с разрывом C–P связи осуществляется с помощью C–P-лиаз. Такое разложение глифосата было выявлено у представителей родов филума протеобактерий, таких как α-протеобактерии Ochrobacterium anthropi, Rhizobium sp. [25], β‑протеобактерии Achromobacter sp. [26], Alcaligenes sp. и Comamonas sp. [61] и γ-протеобактерии Pseudomonas sp. [9] и Enterobacter sp. [38], реже у актинобактерий [46]. Установлено, что среди микроорганизмов, способных разлагать глифосат (бактерии, грибы, микромицеты и актиномицеты), ключевая роль принадлежит бактериям [61]. При этом из 26 описанных штаммов глифосат деградирующих бактерий 19 относятся к типу протеобактерий [61]. Поэтому поступление глифосата в почву часто приводит к увеличению относительного содержания протеобактерий [40], в частности, α-протеобактерий [19] и γ-протеобактерий [43].

C–P-лиазы участвуют в катаболизме фосфонатов; обычно в геноме бактерий присутствует один оперон (phn), кодирующий данный метаболический путь. В случае наличия данной ферментной системы, глифосат может служить единственным источником фосфора для бактерий при его дефиците, что редко встречается в естественных местообитаниях [9]. Многие бактерии не способны использовать глифосат как единственный источник фосфора, но в условиях низкой концентрации доступных фосфатов они осуществляют разрушение связи C–P глифосата [22]. Поэтому микробиологическая деградация глифосата в почвах напрямую зависит от присутствия легкодоступных источников фосфора – неорганических фосфатов.

Наряду с разложением, к инактивации глифосата в почве приводит его сорбция на почвенных частицах, так как он является сильным хелатирующим агентом благодаря наличию в молекуле карбоксильной, фосфонатной и аминогрупп, позволяющих глифосату связываться с глинистыми частицами и железом и алюминием в составе оксидов и гидроксидов [16, 44]. Несмотря на активную сорбцию глифосата почвами, этот процесс является обратимым. В частности, одной из нерешенных проблем остается оценка влияния на поведение глифосата удобрений, прежде всего, фосфорных. Это обусловлено тем, что фосфаты часто играют роль антагонистов гербицида с точки зрения сорбции, так как конкурируют с ним за места связывания [16, 41]. Для ряда почв установлено, что внесение фосфорных удобрений может приводить к высвобождению глифосата или его основного метаболита АМФК, также обладающей фитотоксичностью [17, 34]. Кроме того, показано, что высокое содержание фосфатов в почве может ингибировать разложение глифосата до саркозина – нефитотоксичного продукта деградации глифосата [39]. Вследствие растущего применения фосфорных удобрений в мире, с-оставляющего на 2016 г. около 48.6 млн т (http://www.fao.org/faostat/), в настоящее время большое количество исследований сосредоточено на взаимодействии фосфатов и глифосата в почве [16, 17, 21, 31, 32, 34, 37, 41]. Установлено, что в большинстве случаев фосфаты конкурируют с глифосатом за места связывания, однако в некоторых почвах этого не происходит [16, 31]. Поэтому часто данные о влиянии фосфорных удобрений на взаимодействие глифосата с почвой противоречивы, что обусловливает необходимость оценки этого взаимодействия в условиях конкретной почвы [16, 31]. Для почв России такие исследования отсутствуют. Процессы сорбции–десорбции глифосата, в свою очередь, влияют на скорость его микробиологической деградации: установлено, что сорбированный гербицид минерализуется почвенной микрофлорой в меньшей степени, чем гербицид в свободной форме [16].

Таким образом, в почвах инактивация глифосата определяется комплексом условий, среди которых ведущее место занимают адсорбционная способность почв по отношению к гербициду и особенности структуры микробного сообщества. Оба этих фактора в значительной степени зависят от присутствия легкодоступных фосфатов. Настоящее исследование было направлено на оценку возможности мобилизации глифосата в дерново-подзолистой, серой лесной почве и черноземе под действием фосфатов и влияние этого процесса на обилие функциональных генов бактерий, отвечающих за деградацию глифосата с разрывом связи C–P.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Отбор и характеристика почвенных образцов. Отбор образцов почв проводили из гумусовых горизонтов почв с глубины 0–5 см. Из пяти индивидуальных образцов, отобранных методом конверта на площадке площадью около 1 м², составляли объединенную пробу, из которой получали средний образец. Список исследованных почв приведен в табл. 1. Всего отобрали три почвенных образца из разных почвенно-географических зон: дерново-подзолистых почв (Albic Retisol) (Московская область, Солнечногорский район), серых лесных почв (Haplic Phaeozem) (Тульская область, Щекинский район) и выщелоченных черноземов (Luvic Chernic Phaeozem) (Липецкая область, Данковский район).

Основные агрохимические характеристики. Актуальную кислотность почв определяли согласно [10]. Измерения проводили на приборе Hanna Microprocessor pH Meter pH 211, электрод HI 1230 (Hanna Instruments Inc., США). Содержание органического углерода (C) и азота (N) в почве определяли каталитическим сжиганием при 960°С [35] в токе кислорода на элементном анализаторе Vario Macro Cube (Elementar Analysen Systeme GmbH, Германия). Содержание подвижных форм фосфора в дерново-подзолистой (ДП) и серой лесной почве (СЛ) оценивали методом Кирсанова в модификации ЦИНАО [3], в черноземе выщелоченном (ЧВ) – методом Чирикова в модификации ЦИНАО [2]. При определении фосфора измерения оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре PortLab512 (Portlab, Великобритания) при длине волны 710 нм. Содержание минерального азота рассчитывали как сумму свободных ионов ${\text{NH}}_{4}^{ + }$ и ${\text{NO}}_{3}^{--},$ определяемых, согласно [8], с помощью ион-селективных электродов ЭКОМ-NH₄ и ЭКОМ-NO₃ соответственно (НПП “Эконикс”, РФ). Основные агрохимические характеристики исследованных почв приведены в табл. 1.

Проведение модельных лабораторных экспериментов. Для оценки влияния моноаммонийфосфата (МАФ) на иммобилизацию глифосата поставили опыт, включающий четыре варианта: 1 – контроль (внесение дистиллированной воды); 2 – МАФ; 3 – глифосат; 4 – глифосат + МАФ. Повторность трехкратная. Инкубацию осуществляли в два этапа: на первом этапе проводили уравновешивание гербицида в почве, на втором – внесение МАФ и оценку высвобождения глифосата под его действием. Продолжительность этапов составила 7 и 14 сут соответственно.

К навескам воздушно-сухой почвы вариантов глифосат и глифосат + МАФ, предварительно пропущенной через сито с диаметром ячеек 2 мм, вносили растворы глифосата (Раундап ВР 360 г/л, АО “Август”, РФ) для создания содержания гербицида в почве 8 мг/кг. Согласно существующим представлениям, гербицид преимущественно задерживается верхним слоем почвы 0–5 см, поэтому при внесении глифосата в рекомендованных дозах 2–8 л/га в почве его концентрация составляет 2.4–9.6 мг/кг почвы [17]. Таким образом, использованная в работе концентрация глифосата соответствует дозе его внесения 6.7 л/га, рекомендованной при борьбе со злостными многолетними сорняками: вьюнком полевым, свинороем, бодяком полевым и др. (6–8 л/га). Для равномерности распределения гербицида в навеске почвы подбирали объем вносимого раствора таким образом, чтобы увлажнить почву до 70% полной влагоемкости. Масса воздушно-сухой почвы в стаканах была 100 г, объем стаканов 100 мл. В сосуды вариантов контроль и МАФ вносили аналогичное количество дистиллированной воды. На первом этапе инкубирования стаканы оставляли в вегетационной камере (день/ночь 12 ч/12 ч, температура 24°С, без полива) на 7 сут для уравновешивания гербицида в почве с последующим отбором проб на содержание глифосата, АМФК и микробиологические анализы. Повторность в данном случае была шестикратной, так как до внесения удобрения по обработке почвы не отличались в вариантах контроль и МАФ (внесение дистиллированной воды) и в вариантах глифосат и глифосат + + МАФ (внесение раствора гербицида).

На втором этапе инкубирования в стаканы вариантов МАФ и глифосат + МАФ вносили раствор МАФ (марка А, N : P 12 : 61, АО “Lifosa”, Литва) – водорастворимое азотно-фосфорное удобрение, рекомендуемое для применения на ранних стадиях развития растений, в период формирования корневой системы. Содержание МАФ в почве составляло 0.34 г P₂O₅/кг почвы, что приблизительно соответствует дозе внесения 120 кг/га по P₂O₅. Объем вносимого раствора подбирали таким образом, чтобы увлажнить почву до 70% полной влагоемкости. В сосуды вариантов контроль и глифосат вносили аналогичное количество дистиллированной воды.

Так как существуют данные, указывающие на почвенную фитоксичность глифосата при внесении фосфатов [17], нами была проведена оценка влияния гербицида на рост растений в этих условиях. Для этого проводили посадку наклюнувшихся семян пшеницы мягкой Triticum aestivum L. сорта Л-1, 5 шт./сосуд. Сосуды помещали в вегетационную камеру (день/ночь 12 ч/12 ч, температура 24°С) для выращивания растений пшеницы; полив проводили по мере необходимости. Через 14 сут выращивания второй этап инкубирования завершали, проводили учет длины и биомассы растений, отбирали почвенные пробы на определение глифосата, АМФК, микробиологические анализы и определение содержания подвижных форм фосфора и минерального азота в трехкратной повторности.

Определение содержания глифосата и АМФК в почве. Водную экстракцию гербицида и его основного метаболита проводили согласно [23], хроматографическое разделение и масс-спектрометрическое определение – согласно [57]. Навески почвы массой 1 г помещали в пластиковые пробирки и приливали 4 мл деионизованной воды, интенсивно встряхивали и оставляли на встряхивателе для экстракции на 30 мин. Далее проводили отделение экстракта от осадка путем центрифугирования в течение 10 мин при 17 000 g. Содержание глифосата и АМФК определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). Система ВЭЖХ-МС/МС состояла из жидкостного хроматографа Ultimate 3000 (Dionex, США) с диодно-матричным детектором и гибридного тандемного тройного квадрупольного масс-спектрометра Qtrap 3200 (ABSciex, Канада), оснащенного источником ионизации электрораспылением. Хроматографическое разделение глифосата и АМФК проводили на колонке Shodex NH2P-50 2D (150 × 2.1 мм, 3 мкм) с предколонкой. Подвижная фаза А: водный раствор 5 мМ ацетата аммония, рН 11. Подвижная фаза В: ацетонитрил : вода 20 : 80. Разделение проводили в градиентном режиме при следующих соотношениях подвижных фаз A : B: 0–3 мин 0 : 100, 3–8 мин 50 : 50, 8–28 мин 0 : 100. Скорость потока 0.25 мл/мин, температура термостата колонки 35°С. Ионизацию осуществляли в отрицательном режиме. Детектирование проводили в режиме мониторинга выбранных реакций (МВР). Для глифосата в качестве основного перехода использовали m/z 168 → m/z 63, для АМФК – m/z 110 → → m/z 63. Дополнительными переходами для гербицида и его метаболита были m/z 168 → m/z 149.9 и m/z 110 → m/z 79 соответственно. МВР-переходов и параметров детектирования проводили в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения, поставляемого вместе с оборудованием (Analyst 1.5.1).

Для учета влияния матричного эффекта (т.е. влияния матрицы образца на эффективность ионизации, степень и эффективность извлечения определяемого вещества) каждую пробу анализировали в двух параллельных измерениях, в ходе одного из них вносили в почву смесь глифосата и АМФК. Поправочный коэффициент k вычисляли, как отношение разницы площадей пиков анализируемого компонента после введения добавки в навеску и экстракта образца без добавки к площади пика анализируемого компонента в стандартном растворе с концентрацией, равной концентрации в экстракте с добавкой. В дальнейшем концентрацию глифосата и АМФК рассчитывали с учетом поправочного коэффициента. Пределы обнаружения глифосата в исследованных почвах с учетом матричного эффекта для ДП, СЛ и ЧВ составили: 0.60, 0.44 и 0.69 мг/кг. Для АМФК аналогичные величины были 25, 15 и 7 мг/кг. Без учета матричного эффекта пределы обнаружения глифосата и АМФК составили 0.08 и 0.14 мг/кг соответственно.

Молекулярно-биологические анализы были направлены на определение количества копий генов 16S рРНК бактерий, отражающих общее обилие бактерий в почве, генов phnJ α- и γ-протеобактерий, кодирующих C–P-лиазы, и генов phoC и phoD, кодирующих кислую и щелочную фосфатазу, соответственно (табл. 2). Выделение ДНК проводили с помощью набора SileksMagNA для почв согласно рекомендациям производителя с модификацией на этапе гомогенизации образца: использовали гомогенизатор Precellys 24 (Bertin Technologies, Франция), программа 5. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в амплификаторе C1000 Thermal Cycler с CFX96 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories, USA). Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе, представлены в табл. 2. Для определения количества копий рибосомальных генов бактерий в образцах использовали методику, описанную в [4]. Протокол для количественной ПЦР на остальные гены брали из публикаций, представленных в табл. 2. Объем реакционной смеси для ПЦР составлял 20 мкл, включая 10 мкл BioMaster HS-qPCRSYBR Blue (Biolabmix, Россия), 1 мкл препарата почвенной ДНК и праймеры в концентрации 0.5–0.8 мкМ. Для оценки специфичности реакции анализировали кривые плавления. Количество копий генов оценивали в программе CFX Manager (Bio-Rad, CIF). Использовали стандарты в концентрациях от 10³ до 10⁹ копий гена/мкл. Стандарты для всех генов, кроме бактериального 16S рРНК, получали путем очистки продуктов ПЦР и количественного определения концентрации с помощью флуориметра Qubit3 (Thermo Fisher Scientific, США).

Статистическая обработка данных включала расчет среднего и стандартного отклонения. Оценку значимости различий между средними оценивали методом двухфакторного дисперсионного анализа с расчетом наименьшей существенной разницы (НСР). Выбранный уровень доверительной вероятности р = 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные эксперименты показали, что в течение первых 7 сут инкубирования наиболее активно глифосат инактивировался в ЧВ: в почве обнаруживалось 1.3% гербицида от внесенного. Для ДП почвы этот показатель составил 4.4%, для СЛ – 4.9%. Наблюдаемая инактивация обусловлена как процессом сорбции гербицида, так и его деградации. При повышении рН в диапазоне 4–8 отрицательный заряд глифосата увеличивается вследствие диссоциации карбоксильной группы (pKa 5.44) и, следовательно, возрастание рН сопровождается снижением сорбционной способности почвы по отношению к гербициду [16]. С другой стороны, уменьшение связывания глифосата почвами наблюдается также при увеличении содержания в почве подвижного фосфора [21]. Поэтому можно предположить, что в данном случае высокая степень инактивации на ЧВ, характеризующемся максимальным рН и содержанием подвижного фосфора в ряду исследованных почв, обусловлена деградацией глифосата. На эту возможность указывает наибольшее обилие бактерий, о чем свидетельствует количество копий генов 16S рРНК (табл. 3).

АМФК – основной метаболит глифосата – не обнаружен ни в одном варианте. Это может быть связано с высокой связывающей способностью почв по отношению к этому соединению, в большинстве случае превышающую таковую по отношению к глифосату [51]. При исследовании сорбции глифосата и АМФК на 17 почвах установлено, что среднее значение константы Фрейндлиха для глифосата составляет 144, а для АМФК 164 мг/кг (л/мг)^–nf и при этом в 11 случаях константа Фрейндлиха для АМФК была в 1.2–2.3 раза выше, чем для глифосата. С другой стороны, предел обнаружения АМФК в почве, обусловленным мешающим влиянием почвенной матрицы, также был значительно выше, чем для глифосата, превышая его в 10–40 раз. Наконец, отсутствие АМФК может объясняться преобладанием саркозинового пути деградации гербицида в выбранных условиях.

Внесение глифосата приводило к разнонаправленным изменениям количества копий функциональных генов в выбранных условиях. На ДП почве с наименьшим показателем рН и наиболее низким содержанием подвижного фосфора (табл. 1) обработка гербицидом не повлияла на количество исследуемых генов (табл. 3). В то же время на СЛ почве и ЧВ, характеризующихся более высокими значениями показателя актуальной кислотности и содержания подвижного фосфора, было отмечено снижение количества некоторых из исследованных целевых генов. Наиболее ярко влияние глифосата проявилось на СЛ почве, где в присутствии гербицида наблюдали снижение содержания всех исследованных целевых генов за исключением phoC, для которого изменение количества копий с 2.0 × 10⁵ до 1.5 × 10⁵ оказалось статистически незначимым. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, отмечавших снижение содержания бактерий после однократного применения глифосата в почве с высоким содержанием подвижного фосфора и отсутствие аналогичного эффекта на почве с низким значением этого показателя [14]. Интересно отметить, что как на СЛ почве, так и на ЧВ в вариантах с глифосатом было снижено количество копий гена, кодирующего C–P-лиазу у γ-протеобактерий. Можно предположить, что обилие γ-протеобактерий в варианте с глифосатом было снижено относительно контрольного варианта за счет менее активного развития прокариотного сообщества. В ЧВ в вариантах с глифосатом было выявлено увеличение содержания гена phnJ α-протеобактерий, кодирующего C–P-лиазу, отвечающую за деградацию глифосата по саркозиновому пути. Это наблюдение хорошо согласуется с ранее обнаруженной наибольшей деградации глифосата на ЧВ.

Сопоставление содержания 16S рРНК с остаточной концентрацией глифосата в почвах через первую неделю инкубирования показало, что между этими показателями существует значимая обратная корреляционная взаимосвязь (r = –0.97). По-видимому, это указывает на возможность частичного угнетения бактерий глифосатом в выбранных условиях или сниженную скорость разложения глифосата при низком обилии бактерий. Несмотря на то, что в большинстве исследований отмечается отсутствие выраженного негативного действия глифосата на микробное сообщество [60], рядом исследователей показано небольшое снижение количества бактерий [13, 50] в его присутствии или рост отношения углерода грибной биомассы к бактериальной [47]. В связи с тем, что деградация глифосата в почве в большинстве случаев является ко-метаболическим процессом [16], наблюдаемые разногласия свидетельствуют о необходимости проведения исследования сукцессионных изменений в почве под действием этого гербицида, а не однократных оценок.

Внесение МАФ привело к мобилизации глифосата во всех исследованных почвах: в конце инкубирования содержание гербицида в варианте глифосат + МАФ превышало не только значения варианта глифосат, но и содержание гербицида до начала второго этапа инкубирования (рис. 1). Это указывает на то, что в первую неделю инкубирования исчезновение глифосата из почв было обусловлено не только его деградацией, но и обратимой сорбцией, вызванной внесением фосфатов. Наиболее ярко этот эффект проявился в СЛ почве: концентрация глифосата в присутствии МАФ была в 3.6 раза выше, чем при его отсутствии. Для ПД почвы и ЧВ это отношение составило 1.5 и 2.8 соответственно.

Рис. 1.

Влияние МАФ на содержание глифосата в исследованных почвах. Планками показано стандартное отклонение (n = 3). Для каждой почвы одинаковые буквы указывают на принадлежность к одной группе по данным дисперсионного анализа.

Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, отмечавших возможность высвобождения глифосата из почвы при внесении фосфорных удобрений [41, 45]. Как глифосат, так и фосфаты могут связываться на минеральных поверхностях с переменным зарядом, таких как глинистые минералы, оксиды и гидроксиды Al и Fe, с образованием связей Al–O–P или Fe–O–P [16]. Поэтому среди основных факторов, влияющих на сорбционно-десорбционное поведение глифосата в почвах, принято выделять содержание фосфатов, которые могут конкурировать за места связывания глифосата.

В ДП и СЛ почвах при отсутствии МАФ наблюдали уменьшение содержания глифосата по сравнению с его содержанием в почве после первого этапа инкубирования, что объясняется деградацией гербицида. В отличие от ДП и СЛ почв в ЧВ изменения концентрации гербицида в этих условиях не отмечено, это указывает, что в ЧВ полная инактивация глифосата, обусловленная его связыванием и деградацией, происходит в течение недели. Это хорошо согласуется с ранее установленным фактом, что в исследованном черноземе наблюдали самую высокую степень исчезновения гербицида. Об этом свидетельствует отсутствие возрастания обилия бактерий, оцениваемого на основании количества копий генов 16S рРНК, при дальнейшей инкубации как в присутствии, так и при отсутствии МАФ (табл. 4). В ДП и СЛ почвах, где продолжение инкубирования сопровождалось деградацией глифосата, наблюдали значимое увеличение обилия бактерий. Полученные результаты совпадают с данными исследователей, отмечавших возможность кратковременного возрастания количества бактерий в почве под действием глифосата [43, 60]. Принимая во внимание, что через первые 7 сут инкубирования после внесения глифосата для СЛ почвы отмечали снижение количества копий генов 16S рРНК, рост этого показателя при дальнейшем инкубировании может свидетельствовать о развитии бактерий при уменьшении концентрации глифосата и снижении его угнетающего воздействия.

В ДП почве внесение глифосата как при добавлении МАФ, так и при его отсутствии, способствовало увеличению содержания копий гена phoC (табл. 4), кодирующего кислую фосфатазу, несмотря на отмеченный рост содержания подвижного фосфора во всех вариантах с внесением МАФ в 2.4–4.2 раза (табл. 5). Это не соответствует ранее полученным данным о снижении активности фосфатаз при внесении глифосата [55]. Количество копий генов фосфатаз в почве зависит от pH и увеличивается в случае недостатка доступного фосфора и при внесении органических удобрений [18]. Внесение минеральных фосфорных удобрений может как уменьшать, так и увеличивать обилие генов phoC и phoD [48]. Наблюдаемое в эксперименте увеличение обилия гена phoC в присутствии глифосата может быть обусловлено неспецифичной активностью phoC с использованием глифосата или продуктов его разложения в качестве субстрата. Не было выявлено изменений обилия генов phnJ α- и γ-протеобактерий на втором этапе эксперимента после внесения МАФ. Для ДП и СЛ почв с низким содержанием подвижного фосфора следует отметить возросшее обилие бактерий во всех микрокосмах по сравнению с контрольным, что может свидетельствовать о более активном развитии сообщества в присутствии фосфорсодержащего субстрата. Это согласуется с ранее полученными данными об увеличении дыхательной активности микробного сообщества при внесении глифосата в некоторых почвах [5, 42].

Наряду с увеличением содержания доступного фосфора, МАФ является источником минерального азота в аммонийной форме – фактора, который также мог оказать влияние на почвенную микрофлору. Поэтому после окончания второго этапа инкубирования в почвенных образцах определяли содержание минерального азота. Было установлено, что на ДП и СЛ почвах внесение МАФ привело к увеличению содержания аммонийного азота, в то время как на ЧВ изменения были статистически незначимы. По-видимому, это указывает на низкую нитрифицирующую способность в выбранных условиях ДП и СЛ почв и высокую – ЧВ. Высказанное предположение подтверждается тем, что для вариантов МАФ и глифосат + МАФ на ЧВ наблюдали рост количества нитратного азота (табл. 5).

Корреляционный анализ показал наличие прямой взаимосвязи (r = 0.83) между количеством копий 16S рРНК и содержанием минерального азота в аммонийной форме, что может указывать на вклад нитрификаторов в общее обилие бактерий в выбранных условиях и объясняться внесением доступного азота в аммонийной форме.

Оценка содержания минерального азота показала, что на ДП почве внесение глифосата привело к уменьшению количества доступного азота в аммонийной форме. Ранее аналогичный эффект при обработке почвы гербицидом отмечен рядом исследователей [20, 49, 53]. Глифосат в дозе внесения выше 4 кг/га приводил к значимому снижению азотфиксирующей способности Azotobacter chroococcum и A. vinelandii, а дозы 20–28 кг/га – практически к полному ингибированию этого процесса [49]. Кроме того, наблюдаемое уменьшение содержания аммонийного азота может быть связано с усилением процесса нитрификации, ранее отмеченное в ряде работ [11, 53]. Установлено, что внесение глифосата может инициировать увеличение доли аммонийокисляющих бактерий при однократном внесении гербицида [11].

Несмотря на значимое возрастание содержания глифосата в почвах после внесения МАФ, гербицид не оказал негативного влияния на длину и биомассу растений (рис. 2), что хорошо согласуется с общеизвестным фактом, что глифосат не является гербицидом почвенного действия.

Рис. 2.

Влияние МАФ и глифосата на длину (А) и сухую биомассу (Б) растений. Планками показано стандартное отклонение (n = 3). Для каждой почвы одинаковые буквы указывают на принадлежность к одной группе по данным дисперсионного анализа.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой скорости инактивации глифосата в выбранных условиях. Для ЧВ, кроме того, отмечено положительное влияние МАФ, наблюдавшееся как при отсутствии гербицида, так и в его присутствии: внесение удобрения способствовало увеличению длины (на 10–15%) и массы (16–28%) побегов пшеницы. Отмеченное положительное влияние МАФ на рост растений на исследованном черноземе объясняется, по-видимому, низким содержанием минерального азота в этой почве. При значении этого показателя менее 15 мг/кг (для ЧВ 5.3 ± 0.2 мг/кг) почвы относятся к группе с очень низкой обеспеченностью растений азотом и очень высокой потребностью в удобрениях [1].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В условиях лабораторного эксперимента при внесении в рекомендуемых дозах глифосат инактивируется в дерново-подзолистой, серой лесной почвах и черноземе на 95–99% в течение недели. Максимальная инактивация наблюдается на черноземе. При содержании подвижного фосфора в почве больше 6 мг/кг и актуальной кислотности больше 5 наблюдается временное уменьшение обилия бактерий, оцениваемого на основании содержания количества копий генов 16S рРНК. Показано наличие значимой обратной корреляционной взаимосвязи (r = –0.97) между остаточной концентрацией глифосата и содержанием 16S рРНК.

Внесение МАФ приводит к мобилизации глифосата во всех исследованных почвах. Наиболее ярко этот эффект проявляется на серой лесной почве, где концентрация глифосата в присутствии МАФ была в 3.6 раза выше, чем при его отсутствии. Для дерново-подзолистой почвы и чернозема выщелоченного это отношение составило 1.5 и 2.8 соответственно. Несмотря на увеличение количества доступного фосфора при внесении МАФ в 2.4–4.2 раза, статистически значимого изменения количества копий генов phnJ, кодирующих C–P-лиазу α- и γ-протеобактерий, обнаружено не было. Для дерново-подзолистой почвы в присутствии глифосата было показано снижение количества азота в аммонийной и увеличение – в нитратной форме, что может свидетельствовать об усилении процесса нитрификации. Высвобождение глифосата не сопровождалось негативным влиянием на длину и биомассу растений пшеницы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что внесение фосфорных удобрений в почвы, загрязненные глифосатом, может сопровождаться увеличением риска миграции гербицида в сопредельные среды.