Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2020, № 2, стр. 108-112

ВВЕДЕНИЕ

Современные методы исследований в микробиологии и медицине представлены, как правило, оптической микроскопией (ультрафиолетовой, инфракрасной, люминесцентной, фазово-контрастной) и просвечивающей электронной микроскопией, изучающей тонкие срезы образцов различной химической природы. Растровая электронная микроскопия (РЭМ) нашла применение в исследованиях поверхности биопленок, тканей, морфологии и структуры микроорганизмов [1–3]. В последние годы появилось значительное количество публикаций, посвященных кристалломорфологическому методу исследования биологических жидкостей живых организмов. Как известно, такие жидкости являются многокомпонентными растворами, их физические и химические характеристики претерпевают изменения при патологических процессах. Кристаллографические методы исследования биологических субстратов организма человека представляют собой в настоящее время динамичную отрасль медицинских знаний, способную дать значительную информацию как для теоретических наук (физиологии, морфологии, микробиологии и других), так и для клинических дисциплин [4–7]. Учеными Тверского государственного университета разработана серия методов кристалломорфологической диагностики ряда заболеваний. Сущность методов состоит в введении в одну из биологических жидкостей организма диагностического вещества – нингидрина (трикетогидринденгидрата), активно реагирующего на малейшие изменения в биологических жидкостях, а также образующего сложные формы кристаллов: вискеры, дендриты, сферолиты. Исходя из кристаллографических характеристик, получаемых гранных форм и аморфных образований удалось создать систему, позволяющую дополнять и ставить диагнозы заболеваний [8–10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе проведен электронно-микроскопический анализ кристалломорфологических картин основных органических компонентов операционной желчи с добавлением диагностического вещества нингидрина. Микроморфологические исследования желчи проводили с использованием растрового электронного микроскопа JEOL 6610 LV с системой рентгеновского энергодисперсионного микроанализа Oxford INCA Energy 350. РЭМ обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционной световой микроскопией: большая глубина фокуса при высоком разрешении, быстрое формирование изображения, широкий диапазон увеличений, возможность рентгеноспектрального (элементного) анализа. Использование новых методик, таких как лантаноидное контрастирование, позволяет расширить возможности РЭМ в микробиологии и медицине.

Объектом исследования был образцы операционной желчи, к которым добавляли спиртовой раствор нингидрина (кристалообразующее вещество), смесь готовили в чашках Петри при температуре 18–20°C. Картину кристаллизации исследовали с помощью биологического микроскопа Levenhuk 720B и электронного микроскопа JEOL 6610 LV в режиме регистрации вторичных электронов. На рис. 1а представлены изображения кристаллических сферолитов с лучами разного размера (желчь с повышенным количеством желчного пигмента – билирубина), на рис. 1б – сложные кристаллические формы – дендриты (желчь пациента, перенесшего гепатит А), полученные методом светлопольной оптической микроскопии. Строение камней, образующихся в желчи, значительно зависит от их состава. Чисто холестериновые камни имеют круглую или овальную форму, их диаметр от 4–5 до 12–15 мм, локализуются почти всегда в желчном пузыре. Кристаллы холестерина часто обнаруживаются в желчи здоровых людей, но большое количество таких образований указывает на высокий риск образования желчных камней.

Рис. 1.

Оптическое изображение: а – кристаллических сферолитов; б – дендритов.

Кристалломорфологическая картина исследуемой жидкости пациента, не страдающего желчнокаменной болезнью, представлена многочисленными кубическими кристаллами хлористого натрия размером от 1 до 15 мкм (анализ желчи показал повышенное содержание NaCl) и тонкими ромбическими кристаллами моногидрата холестерина в значительном количестве, что с медицинской точки зрения указывает на потерю коллоидальной стабильности желчи. На рис. 2 представлены тонкие пластинчатые кристаллы моногидрата холестерина в окружении кубических кристаллов хлористого натрия. Кристаллы моногидрата холестерина на начальной стадии кристаллизации имеют форму тонких ромбов размером 1–5 мкм, затем образуются агрегаты пластинчатых кристаллов (рис. 3).

Рис. 2.

РЭМ-изображения пластинчатых кристаллов холестерина в окружении монокристаллов хлористого натрия, полученные при разном увеличении.

Рис. 3.

РЭМ-изображения скоплений ромбовидных холестериновых кристаллов, образующих сложный узор, полученные при разном увеличении.

Преимущественно холестериновые камни имеют слоистую структуру или состоят из пигментированной центральной части, окруженной тонким слоем холестерина. Методом РЭМ хорошо выявляется структура холестериновых камней (рис. 4). На срезе видны нерегулярные зубцеватые структуры. Часто слоистость связана с наслоением кальцинатов, что присуще как холестериновым, так и известковым и пигментным камням. Структура мелких пигментных желчных камней визуализируется как однородная и гомогенная в оптическом микроскопе, слоистое строение этих камней часто можно выявить только с помощью электронной микроскопии.

Рис. 4.

РЭМ-изображение: а – слоистой структуры холестериновых кристаллов; б – зубцеватого среза холестериновой пластины.

Практически все образцы желчи с различными патологиями (воспалительные процессы, содержание камней всех видов) склонны к образованию кристаллических скелетных форм – дендритов. На рис. 5а представлены папоротникообразные дендриты солей желчи, которая содержит, как правило, сложные холестерино-пигментно-известковые камни. Тонкие игольчатые кристаллы жирных кислот, иногда сгруппированные в пучки, также свидетельствуют о воспалительных процессах в желчном пузыре (рис. 5б).

Рис. 5.

РЭМ-изображение: а – папоротникообразных дендритов солей желчи; б – игольчатых кристаллов жирных кислот.

На рис. 6 изображены при разных увеличениях сферолитоподобные формы кристаллов карбоната кальция, который может находиться в желчи в различных полиморфных модификациях: арагонита, ватерита и кальцита, что способствует образованию известковых камней. Данные биохимического анализа желчи (содержание холестерина, билирубина, кальцинатов) хорошо дополняются результатами энергодисперсионного анализа, установлены примеси в исследуемой желчи, в одной из проб отмечается повышенное содержание кальция, магния, кремния, калия, железа и алюминия, обусловленное наличием сложных холестерино-пигментно-известковых камней.

Рис. 6.

РЭМ-изображения сферолитоподобных форм кристаллов карбоната кальция, образованных в желчи, полученные при разном увеличении.

Кристалломорфологическая картина желчи со сложными и пигментными камнями часто представлена кристаллическими агрегатами, примеси известковых солей здесь незначительны (рис. 7). Методом энергодисперсионного анализа исследован состав кристаллов желчи, содержащей известковые, холестериновые, пигментные и сложные комбинированные камни. Установлено, что желчь, кристаллизующаяся в форме сферолитов и кристаллических агрегатов, характеризуется повышенным содержанием кальция. Желчь, склонная к образованию холестериновых кристаллических пластин, содержит меньшее количество кальция.

Рис. 7.

РЭМ-изображения кристаллических агрегатов желчи, полученные при разном увеличении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние десятилетия активно развивается междисциплинарная интеграция, сближение научной и практической медицины, естественных наук физико-математического цикла и современных научно-технических методов исследования. Использование оптической и электронной микроскопии при изучении основных особенностей патогенного кристаллообразования в биологических жидкостях человека (слюне, ликворе, плазме, моче, желчи, слезной жидкости) дает хорошие результаты и может служить методом экспресс-анализа в ряде случаев. Электронно-микроскопическое исследование картин кристаллизованной желчи информативно. Оно позволяет выявлять тонкую структуру разнообразных кристаллических форм, предоставляет дополнительные сведения об особенностях кристаллизации в биологических жидкостях, что может быть полезно для понимания природы патологических процессов в живом организме.