Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2022, № 1, стр. 10-17

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время важной проблемой медицины и биотехнологии является разработка и создание систем инкапсуляции и целевой доставки различных веществ в необходимые места организма с последующим контролируемым и/или постепенным высвобождением инкапсулированного вещества. Среди большого количества разнообразных систем доставки (липосомы [1], мицеллы [2] везикулы [3]) интерес вызывают полиэлектролитные микрокапсулы, предложенные в 1998 г. Е. Донат, Г.Б. Сухоруковым [4]. Такие капсулы активно исследуют и применяют для капсулирования и доставки ряда биологически активных веществ in vitro и in vivo [5, 6], в частности, полиэлектролитные капсулы перспективны для доставки вакцин [7–9].

Высвобождение веществ из полиэлектролитных микрокапсул происходит за счет диффузии, скорость которой зависит от характеристик инкапсулированных молекул (например, от размера молекулы), свойств полимерного комплекса, из которого сформирована микрокапсула, толщины оболочки и ряда других параметров [10]. Контролируемое высвобождение веществ подразумевает использование триггеров, запускающих этот процесс в композитных микрокапсулах, оболочки которых функционализированы подходящими молекулами и/или наночастицами. В качестве триггера можно использовать воздействие ферментов [11], ультразвукового поля [12, 13], микроволнового поля [14], лазерного излучения [15, 16]. Переменное магнитное поле также может влиять на высвобождение содержимого композитных капсул и их целостность [17, 18].

При помещении магнитных наночастиц в переменное магнитное поле первоначально хаотически ориентированные магнитные моменты будут стремиться повернуться в одну сторону. В зависимости от характеристик наночастиц и параметров магнитного поля выделяют два типа релаксации магнитного момента. В первом случае вращается магнитный момент, сама наночастица остается неподвижной – это так называемая неелевская релаксация, приводящая к разогреву окружающей среды. На неелевской релаксации основано явление магнитной гипертермии [18, 19]. Однако увеличение температуры может негативно влиять как на термочувствительные биологически активные вещества, так и на окружающие ткани.

Особое внимание заслуживает применение негреющего низкочастотного магнитного поля (частота 1–1000 Гц), которое обладает большей проникающей способностью относительно тканей, легкостью дозирования и контроля, большей локальностью и безопасностью по сравнению с греющим магнитным полем [20]. При приложении низкочастотного магнитного поля магнитный момент остается неподвижным относительно наночастицы, сама наночастица вращается в магнитном поле – это броуновская релаксация. Данный процесс не приводит к существенному выделению тепла, и основной канал диссипации энергии деформационно-механический (магнитомеханическая активация) [17, 21, 22]. На сегодняшний день существует лишь несколько работ, посвященных влиянию низкочастотного переменного магнитного поля на полиэлектролитные микрокапсулы [17, 22].

Целью работы был синтез композитных микрокапсул на основе не биоразлагаемых полиэлектролитов и наночастиц оксидов железа Fe₃O₄ и исследование процесса высвобождения инкапсулированных молекул высокомолекулярного декстрана под воздействием низкочастотного переменного магнитного поля за счет магнитомеханической активации наночастиц в полимерной оболочке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения размеров, синтезированных наночастиц были использованы просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) Technai Osiris (FEI, США) и анализатор Malvern Zetasizer ZS. ПЭМ-изображение синтезированных наночастиц Fe₃O₄ представлено на рис. 1а. Наночастицы имеют форму, близкую к сферической, их средний размер, рассчитанный по ПЭМ-изображению с помощью программы ImageJ, составил 13 ± 1 нм. Методом динамического светорассеяния получено распределение наночастиц по размерам (рис. 1б), из которого следует, что кроме отдельных наночастиц в суспензии присутствует незначительное количество их агрегатов. Гидродинамический диаметр наночастиц Fe₃O₄ составляет 85 ± 16 нм. Это значение в несколько раз превышает размер, полученный методом электронной микроскопии, что говорит о формировании адсорбционного слоя из молекул и ионов, присутствующих в среде, на поверхности наночастиц.

Рис. 1.

Магнитные частицы Fe₃O₄: а – ПЭМ-изображение; б – гистограмма распределения по размерам d; в – порошковая дифрактограмма; г – зависимость величины дзета-потенциала от рН.

Порошковая рентгеновская дифрактограмма наночастиц (рис. 1в) получена на лабораторном порошковом дифрактометре Rigaku Miniflex 600 (λ = 1.5406 Å). Наблюдаются рефлексы 220 при 2θ = 30.0°, 311 при 35.2°, 400 при 42.9°, 511 при 56.9° и 440 при 62.5°, что согласно стандартной базе данных JCPDS (№ 89-4319) соответствует кубической кристаллической структуре шпинели, характерной для магнетита Fe₃O₄ (пространственная группа $Fd\bar {3}m$). Средний размер области когерентного рассеяния, оцененный по формуле Шерерра в приближении сферической формы наночастиц с постоянной K = 0.9, составил 15 нм, что согласуется с данными ПЭМ. Фазовый состав наночастиц также исследован методом мессбауэровской спектроскопии в геометрии пропускания с использованием источника гамма-излучения ⁵⁷Co(Rh) и спектрометра MS-1104Em. Анализ мессбауэровских спектров показал присутствие в образце также магнитной фазы маггемита γ-Fe₂O₃. Изменение дзета-потенциала наночастиц Fe₃O₄ в зависимости от кислотности дисперсной фазы (рис. 1г) демонстрирует увеличение модуля дзета-потенциала при увеличении рН от 2 до 7. Так как дальнейшее повышение рН не приводит к увеличению модуля электрокинетического потенциала, адсорбцию наночастиц на полимерные оболочки проводили на слой поликатиона из суспензии наночастиц при нейтральном рН.

Магнитные свойства наночастиц Fe₃O₄ определяли по кривой гистерезиса (рис. 2). Для получения кривой использовали вибромагнитометр EG&G PARC (модель 155). Коэрцитивная сила составила 1.06 ± 0.01 кА/м, удельная намагниченность насыщения 38.7 А · м²/кг, магнитный момент (2.4 ± 0.3) × 10^–19 А · м². Наблюдаемая при комнатной температуре кривая гистерезиса свидетельствует о том, что наночастицы Fe₃O₄ имеют ферромагнитную природу. Согласно существующим представлениям синтезированные наночастицы являются однодоменными и могут релаксировать по броуновскому механизму в низкочастотном переменном магнитном поле, их можно использовать в качестве медиаторов локальной деформации благодаря магнитомеханической активации [20]. Для ее реализации важны параметры наночастицы (диаметр, материал) и магнитного поля (амплитудно-частотные и пространственно-временны́е характеристики). Эффективная реализация магнитомеханической активации требует применения низкочастотных переменных магнитных полей (менее 0.1–1 кГц) и магнитных наночастиц диаметром от 15 до 100 нм, поскольку, с одной стороны, наночастицы должны оставаться однодоменными (переход в многодоменное состояние у магнетита происходит при диаметре около 100 нм), а с другой стороны, увеличение размера наночастиц повышает максимальную генерируемую силу в переменном магнитном поле за счет роста магнитного момента [24]. Таким образом, используемые в исследовании поля и частицы подходят для реализации магнитомеханической активации. Для нее характерна сложная связь величины эффекта (деформации) с частотой поля, которая зависит от окружения наночастиц. Связанные с наночастицами макромолекулы могут иметь обратные времена релаксации, лежащие в области низких частот переменных магнитных полей, что приводит к псевдорезонансным эффектам увеличения отклика [24, 25].

Рис. 2.

Кривая намагниченности синтезированных наночастиц.

ТРИТЦ-декстран успешно включается в частицы CaCO₃ в процессе соосаждения, как видно из изображения микрокапсул, полученного с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа (рис. 3а). Средний гидродинамический диаметр синтезированных микрокапсул, определенный методом динамического рассеяния света, составил 3.7 ± 0.5 мкм. Для изучения влияния низкочастотного переменного магнитного поля на морфологию оболочки на микрокапсулы воздействовали полем с амплитудой 100 мТл и частотами 30, 50, 77, 110 Гц. Растровый электронный микроскоп (РЭМ) JSM-7401F (Jeol, Япония) использовали для изучения нарушения целостности оболочки полиэлектролитной микрокапсулы. О нарушении судили по РЭМ-изображениям (рис. 3б–3е).

Рис. 3.

Изображения микрокапсул, полученные с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии (а) и РЭМ (б–е), до (а, б) и после (в–е) воздействия в течение 60 мин переменного магнитного поля амплитудой 100 мТл с частотой: в – 30; г – 50; д – 77; е – 110 Гц.

В отсутствие поля структура оболочки не нарушена, микрокапсулы остаются целыми (рис. 3б). Из сравнения изображений видно, что наибольшая деформация наблюдается при воздействии переменного магнитного поля с частотой 77 Гц (рис. 3г). При частотах 30, 50 и 110 Гц (рис. 3в, 3д, 3е) какие-либо заметные деформации отсутствуют. Основной причиной наблюдаемого разрушения микрокапсул может быть наступление псевдорезонанса в системе “оболочка–наночастицы” при совпадении обратного времени релаксации многослойной полиэлектролитной оболочки и частоты магнитного поля. При броуновской релаксации под действием низкочастотного переменного магнитного поля магнитные наночастицы начинают совершать колебательные движения. Их механическая энергия передается оболочке в форме деформаций сжатия и растяжения макромолекул, из которых состоят композитные микрокапсулы, причем на частоте 77 Гц эти деформации многократно увеличиваются, т.е. носят резонансный характер. Соответственно, при таком эффекте происходит высвобождение инкапсулированного ТРИТЦ-декстрана из микрокапсул.

Интенсивности флуоресценции ТРИТЦ-декстрана в супернатанте после воздействия на микрокапсулы переменного магнитного поля различной частоты приведены в табл. 1. Каждое измерение проводили через 2 ч после воздействия. Видно, что ТРИТЦ-декстран высвобождается во всех случаях. В случае контрольного образца (без воздействия) высвобождение связано с диффузией ТРИТЦ-декстрана из микрокапсулы в супернатант, и в сравнении с остальными образцами оно минимально. Оболочки микрокапсул практически непроницаемы для соединений с молекулярной массой больше 5 кДа [26]. Поэтому можно считать, что изменение флуоресценции из-за естественной диффузии в данном временном интервале не является статистически значимым. Максимальное значение интенсивности флуоресценции супернатанта наблюдается при воздействии поля с частотой 77 Гц, что согласуется с результатом РЭМ.

Одним из параметров воздействия является время экспозиции микрокапсул в низкочастотном переменном магнитном поле. С помощью конфокальной микроскопии были получены данные об интенсивности флуоресценции ТРИТЦ-декстрана в микрокапсулах в зависимости от времени воздействия магнитного поля (рис. 4). При длительности воздействия больше 10 мин интенсивность флуоресценции ТРИТЦ-декстрана практически не изменяется, что говорит об установлении равновесной концентрации в оболочке и дисперсной среде и об окончании процесса высвобождения. Таким образом, оптимальным временем воздействия поля является 10 мин, в течение которого устанавливается равновесная концентрация ТРИТЦ-декстрана в оболочке и среде, в которой находятся микрокапсулы.

Рис. 4.

Зависимость интенсивности флуоресценции ТРИТЦ-декстрана в оболочке микрокапсул от времени экспозиции в магнитном поле с амплитудой 100 мТл и частотой 50 Гц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе продемонстрировано успешное применение низкочастотного переменного магнитного поля для контролируемого высвобождения ТРИТЦ-декстрана из композитных микрокапсул. Анализ полученных результатов позволяет заключить, что у системы многослойной полиэлектролитной оболочки, в которой находятся наночастицы магнетита, есть определенное обратное время релаксации, близкое к 77 Гц. При помещении композитных капсул со структурой ПAГ/ПСН/ПAГ/МНЧ/ПСН/ПAГ/ПСН в переменное магнитное поле частотой 77 Гц благодаря магнитомеханической активации наночастиц возникает псевдорезонанс, вызывающий появление дефектов в оболочке и стимулирующий высвобождение инкапсулированного вещества. Оптимальное время воздействия магнитного поля составляет 10 мин.

Магнитомеханическая активация является основой новой концепции локального воздействия на молекулярном уровне и перспективна для управления проницаемостью оболочек микрокапсул при доставке биологически активных веществ.