Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2023, № 1, стр. 3-8

ВВЕДЕНИЕ

Одним из активно развиваемых в последние годы способов повышения эффективности существующих лекарств является разработка для них систем транспорта (доставки) с применением современных нанотехнологий. В настоящее время готовые лекарственные формы, разработанные на основе различных систем транспорта, уже внедрены в медицинскую практику. Эти препараты отличаются высокой эффективностью и широко востребованы на рынке лекарственных средств.

Наиболее перспективными с этой точки зрения представляются системы транспорта лекарств на основе фосфолипидов [1]. Однослойные везикулы (полые наноразмерные частицы, содержимое которых ограничено одним бислоем) фосфолипидов размерами 20–200 нм позволяют транспортировать как водорастворимые, так и водонерастворимые молекулы лекарств [2] и, соответственно, относятся к нанолекарствам. Как установлено в последние годы, уменьшение размеров и площади поверхности частиц, используемых для транспорта лекарств, существенно продлевает время циркуляции лекарств в кровотоке и тем самым увеличивает терапевтическую эффективность воздействия лекарственной субстанции на человеческий организм [3].

Гидрофильные (растворимые в воде) молекулы действующего вещества лекарственной формы могут встраиваться во внутреннюю область везикулы, заполненную водой, а гидрофобные (нерастворимые в воде) молекулы лекарства могут встраиваться в фосфолипидный бислой везикулы. Для эффективного практического использования везикул в качестве системы доставки лекарств, а также для улучшения технологии их производства необходима точная информация об их структуре.

Известным и широко используемым экспериментальным методом исследования структуры везикулярных систем является малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН) и рентгеновских лучей (МУРР) [4–7]. Развитый в работах [8, 9] метод разделенных формфакторов (РФФ) представляет собой эффективный инструмент анализа спектров малоуглового рассеяния на полидисперсных везикулах фосфолипидов в избытке жидкости для получения информации о структуре и свойствах таких систем. Так, метод РФФ был успешно применен для анализа структуры однослойных везикул димиристоилфосфатидилхолина [9] при различных фазовых состояниях липидного бислоя. В [10] исследовали влияние диметилсульфоксида на структуру липидного бислоя везикул из дипальмитоилфосфатидилхолина. В работах [11–13] с помощью подхода РФФ исследованы многокомпонентные везикулярные системы на основе церамида 6, моделирующие верхний слой кожи млекопитающих (Stratum Corneum). В работах [14, 15] метод РФФ адаптирован для анализа данных МУРР.

В институте биомедицинской химии на основе растительных (соевых) фосфолипидов разработана технология получения транспортных наночастиц предельно малого размера (150–250 Å) в виде лиофильно высушенного порошка, стабильного при хранении [16]. Показано, что встраивание некоторых лекарственных субстанций в эти наночастицы существенно увеличивает их биодоступность и терапевтическую эффективность [17]. В [18] путем сравнительного анализа спектров МУРР на образцах вышеупомянутой фосфолипидной транспортной наносистемы (ФТНС) и “классической” везикулярной системы димиристоилфосфатидилхолина показано, что наночастицы ФТНС имеют морфологию однослойных везикул.

В настоящей работе представлены результаты РФФ-анализа спектров МУРН, полученных на малоугловом спектрометре “ЮМО” (ОИЯИ, Дубна) на полидисперсной популяции однослойных везикул ФТНС в зависимости от концентрации мальтозы в растворе тяжелой воды. Аналогичные расчеты сделаны для везикулярной системы лекарства “Индолип”, полученного путем встраивания молекул индометацина в липидный биcлой везикулы ФТНС. Индометацин (C₁₉H₁₆C_lNO₄) – известный лекарственный препарат, оказывающий противовоспалительное и жаропонижающее действие.

Отметим, что лиофилизированная ФТНС состоит из соевых фосфолипидов и мальтозы с массовым соотношением компонент 1 : 4. Однослойные везикулы образуются при растворении лиофилизированного порошка ФТНС в воде. Для увеличения контраста между липидным бислоем и водой в нейтронных экспериментах используют тяжелую воду (D₂O). Увеличение концентрации ФТНС в тяжелой воде ведет к увеличению концентрации недейтерированной мальтозы и, соответственно, увеличению фона (в нашем случае – некогерентного). Это ограничивает возможности измерения кривой МУРН в области больших значений вектора рассеяния и, следовательно, определения структуры липидного бислоя везикулы. Тем самым, применение МУРН представляется оправданным при относительно низких концентрациях ФТНС в тяжелой воде.

Целью настоящего исследования является изучение на примере систем ФТНС и “Индолипа” возможности получения информации о везикулярной структуре нанолекарств на основе анализа спектров МУРН в рамках метода РФФ при концентрациях мальтозы в D₂O 20% и ниже.

ЭКСПЕРИМЕНТ

Спектры МУРН регистрировали с помощью нейтронного спектрометра “ЮМО” в двухдетекторной геометрии [19] на импульсном реакторе “ИБР-2” (Лаборатория нейтронной физики им. Франка, ОИЯИ, Дубна, Россия). Расстояние от образца до детекторов составляло 4.5 и 13 м, что позволило проводить измерения в диапазоне переданных импульсов от 0.007 до 0.5 Å^–1. Первичную обработку спектров выполняли с помощью программы SAS [20]. Образцы полидисперсных популяций однослойных везикул ФТНС и “Индолипа” готовили методом растворения лиофилизированного порошка в тяжелой воде в концентрациях 5, 10 и 25%. Концентрация мальтозы после растворения препарата в D₂O составляла 4, 8 и 20% соответственно. Измерения проводили при комнатной температуре.

МОДЕЛЬ И МЕТОД РАСЧЕТА

Для анализа структуры везикулярной системы использовали метод РФФ, основанный на факторизации выражения для амплитуды рассеяния. Метод подробно описан в ряде работ [8–10]. Ниже приведены основные формулы, определяющие данный подход.

Макроскопическое сечение малоуглового рассеяния для полидисперсной популяции однослойных везикул может быть выражено:

Здесь q – значение вектора рассеяния; Δ – второй момент функции разрешения спектрометра; I_B – интенсивность некогерентного фона. Формула для dΣ(q)/dΩ имеет вид: где $\left\langle R \right\rangle $ – средний радиус везикулы; пределы интегрирования R_min и R_max выбирают в зависимости от предполагаемого размера везикул в исследуемом образце; dΣ(q)/dΩ_mon – макроскопическое сечение монодисперсной популяции везикул, определяемое как: где n – число везикул на единицу объема; S(q, R) – структурный фактор в форме Дебая [21]; F_s и F_b – формфакторы бесконечно тонкой сферической оболочки радиуса R и липидного бислоя толщиной d соответственно: Здесь Δρ(x) = ρ(x) – ${{\rho }_{{{{{\text{D}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}}}}$ – разность плотности длины рассеяния нейтрона между липидным бислоем ρ(x) и тяжелой водой ${{\rho }_{{{{{\text{D}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}}}}$ (контраст). Для учета полидисперсности радиуса везикул используют распределение Шульца: где m – коэффициент полидисперсности; среднеквадратичное отклонение радиуса везикул (полидисперсность) от среднего радиуса $\left\langle R \right\rangle $ рассчитывают по формуле σ = (1 + m)^–1/2.

В проведенных расчетах функцию ρ(x) плотности длины рассеяния нейтрона липидного бислоя аппроксимировали на основе двух моделей, представленных на рис. 1. Это, во-первых, двухступенчатая модель, позволяющая учитывать различие в плотности длины рассеяния нейтронов в областях полярных “голов” и углеводородных цепочек (${{\rho }_{{{\text{C}}{{{\text{H}}}_{2}}}}}$ и ${{\rho }_{{{\text{C}}{{{\text{H}}}_{3}}}}}$) бислоя. Данная модель использована в рамках подхода РФФ для анализа спектров МУРР на везикулах димиристоилфосфатидилхолина и ФТНС [14, 15]. Второй вариант – гидрофобно-гидрофильная модель плотности, в которой распределение воды в бислое задано линейно и учтено различие плотности длины рассеяния на внешней гидрофильной и внутренней гидрофобной областях бислоя. Данная модель успешно была использована для анализа структуры различных везикулярных систем по данным МУРН [9, 11–13].

Параметрами подгонки в обоих случаях являются: средний радиус везикулы $\left\langle R \right\rangle $, коэффициент полидисперсности m, число везикул на единицу объема n, величина некогерентного фона I_B, толщина бислоя d. Для двухступенчатой модели, кроме того, уточняемыми были значения параметра ρ_PH – плотности длины рассеяния нейтронов в гидрофильной области полярных “голов” и 2L – толщина центральной области бислоя. Толщина области полярных “голов” h может быть вычислена как h = (d – D)/2. Толщина области CH₂ может быть вычислена как S = D/2 – L.

Плотность длины рассеяния углеводородных цепочек в гидрофобно-гидрофильной модели фиксировали ρ_CH = −0.36 × 10¹⁰ см^–2. В двухступенчатой модели полагали ${{\rho }_{{{\text{C}}{{{\text{H}}}_{2}}}}}$ = −0.292 × 10¹⁰ см^–2 и ${{\rho }_{{{\text{C}}{{{\text{H}}}_{3}}}}}$ = −0.848 × 10¹⁰ см^–2. Значения ρ₀, характеризующие плотность длины рассеяния от раствора, составляют для концентраций мальтозы в D₂O, равных 4, 8 и 20% соответственно, 6.253 × 10¹⁰, 5.119 × 10¹⁰ и 5.685 × 10¹⁰ cм^–2.

Расчеты проводили на основе двух независимых подходов, обеспечивающих согласующиеся результаты. В первом использовали программу DFUMIL из библиотеки JINRLIB компьютерных программ ОИЯИ [22] для локальной минимизации функционала, определяющего отклонение расчетных сечений от экспериментальных данных в рамках обобщенного метода наименьших квадратов [23]. Во втором применяли глобальную минимизацию на основе метода асинхронной дифференциальной эволюции [24, 25]. Отметим, что для реализации первого подхода создан онлайн-интерфейс, описанный в [26]. В настоящее время на базе платформы HybriLIT Многофункционального информационно-вычислительного центра Лаборатории информационных технологий ОИЯИ ведут работы по созданию единой информационной системы для высокопроизводительных расчетов параметров везикулярных систем на основе анализа малоугловых спектров рассеяния методом РФФ с возможностью выбора метода минимизации и визуализации получаемых результатов.

Значения χ², приведенные в таблицах, рассчитывали по формуле

где δ(q_i) – ошибка экспериментальных данных; N – число экспериментальных точек; k – количество уточняемых параметров.

РЕЗУЛЬТАТЫ, ОБСУЖДЕНИЕ, ВЫВОДЫ

Основные результаты расчетов параметров полидисперсных популяций однослойных везикул ФТНС и “Индолипа” в зависимости от концентрации мальтозы, полученные с использованием двухступенчатой модели бислоя, представлены в табл. 1 и на рис. 2. Из табл. 1 видно, что структурные параметры, определяющие геометрию везикул ФТНС и “Индолипа”, в целом близки между собой, при этом размер везикул “Индолипа” оказывается на 10–15% больше по сравнению с ФТНС.

Отметим, что в большинстве расчетов по этой модели обнаружены нулевые или близкие к нулю значения толщины одной из областей, соответствующих углеводородным цепочкам CH₂ или CH₃. Так, например, для популяции “Индолипа” с концентрацией мальтозы 4% подгонка экспериментальных данных дает L = 0 (область CH₃), а для популяции ФТНС при той же концентрации получено нулевое значение S = D/2 – L, соответствующее области углеводородных цепочек CH₂. Это означает, что при уточнении двухступенчатая модель бислоя становится одноступенчатой. Наблюдаемая тенденция свидетельствует о том, что МУРН, по сравнению с МУРР, менее чувствителен к границам между областями внутри бислоя. Из-за этого осцилляции в правой части кривой МУРН, соответствующей рассеянию на бислое, выражены гораздо слабее, чем в случае экспериментов МУРР [15]. В связи с этим оправданным представляется использование для анализа данных МУРН более простых моделей бислоя, в том числе гидрофобно-гидрофильной модели, хорошо зарекомендовавшей себя, как уже было сказано выше, при анализе данных МУРН на везикулярных системах различного химического состава. Результаты расчетов по этой модели представлены в табл. 2 и на рис. 3. Видно, что расчеты по двум указанным моделям дают сопоставимые значения среднего радиуса, полидисперсности, толщины бислоя и размера гидрофобной области для везикул ФТНС и “Индолипа”. Рассчитанный средний радиус везикул ФТНС при концентрации мальтозы 20% оказался более чем на 20% ниже значения, полученного в [15] на основе анализа данных МУРР на ФТНС при той же концентрации мальтозы. Следует отметить, что полученные значения $\left\langle R \right\rangle $ = 143 (двухступенчатая модель) и 156 Å (гидрофобно-гидрофильная модель) в целом согласуются с приближенными оценками, сделанными в [17] и [18]: $\left\langle R \right\rangle $ = 136 и 160 Å соответственно.

Таким образом, на основе проведенных расчетов можно констатировать, что МУРН применим для исследования базовых структурных параметров полидисперсных везикулярных систем нанолекарств, характеризующихся достаточно малыми размерами везикул при условии их относительно низкой концентрации в растворе тяжелой воды. Подтверждена возможность использования метода РФФ для анализа спектров МУРН, при использовании моделей без учета различий между рассеянием на углеводородных цепочках разного типа внутри бислоя. Следует использовать менее сложные, чем при анализе данных МУРР, модели бислоя.

Отметим в заключение, что модель РФФ, определяемая формулами (1)–(5), построена в пренебрежении возможной несимметричностью бислоя. При малых размерах везикул роль несимметричности бислоя может возрастать и оказывать влияние на получаемые расчетные результаты. Учет этого фактора требует дальнейших исследований.