Приборы и техника эксперимента, 2021, № 3, стр. 119-122

1. ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время лазерное излучение, благодаря своим уникальным свойствам, широко используется в различных областях науки и техники. Так, лазерная печать, основанная на переносе микроскопического количества вещества под действием лазерно-индуцированного импульсного давления, используется в тканевой инженерии при создании искусственных биотканей и органов [1]. Этот же механизм переноса лежит в основе лазерной инженерии микробных систем – перспективного метода, позволяющего выделять некультивируемые стандартными способами бактерии [2] и разделять “неразделимые” симбионты [3]. Технология лазерной инженерии микробных систем востребована при синтезе новых антибиотиков, производстве биологически активных веществ, создании своеобразного всемирного банка – “Ноева ковчега” микроорганизмов [4].

В практических исследованиях для проведения процесса лазерной печати необходимо иметь возможность настраивать в широких диапазонах параметры лазерного воздействия. Основными параметрами являются диаметр лазерного пятна и энергия в импульсе, а также, в отдельных случаях, распределение интенсивности лазерного излучения в пятне. Такими возможностями обладает предлагаемая установка для лазерной биопечати.

2. КОНСТРУКЦИЯ СИСТЕМЫ

Фотографии установки для лазерной биопечати и ее основных частей представлены на рис. 1. Установка состоит из импульсного лазерного источника (1) Tech-1053 Express (ООО “Лазер-экспорт”, Россия); расширителя лазерного пучка 2; системы зеркал 3 и 6 для юстировки положения хода лазерного пятна; моторизированной телескопической системы (4) MEX13 (Optogama UAB, Литва); оптического элемента “Пи-шейпер” (5) Focal-piShaper 9_1064_HP (AdlOptica Optical Systems GmbH, Германия); компактного однозеркального гальваносканера (7) LscanXY (Атеко-ТМ, Россия) в сочетании с F-theta-объективом SL-100-45-80 (Ronar-Smith, Сингапур).

Рис. 1.

Фотографии установки для лазерной биопечати (а) и ее отдельных частей: узла с донорной и акцепторной подложками (б), а также узла держателя с донорной подложкой (в). 1 – лазер; 2 – расширитель лазерного пучка; 3 и 6 – система зеркал; 4 – моторизированная телескопическая система; 5 – объектив “Пи-шейпер”; 7 – гальваносканер с F-theta-объективом; 8 – оптическая оправка; 9 – кварцевая пластина с поглощающим металлическим слоем; 10 – ограничительная шайба; 11 – слой гидрогеля; 12, 13 – моторизированные подвижки соответственно для донорной и акцепторной подложек. Сплошной желтой линией показан ход лазерного луча.

Моторизированная телескопическая система 4 позволяет корректировать диаметр лазерного пятна и расходимость пучка, задавая его размер, а оптический элемент “Пи-шейпер” 5 – настраивать распределение интенсивности в лазерном пятне.

С помощью оптической схемы лазерное излучение с необходимыми параметрами, задаваемыми компьютерной системой управления, фокусировалось в заданную область на донорной подложке (см. рис. 1в), закрепленной в оптической оправке 8. Донорная подложка состоит из круглой кварцевой пластины 9 диаметром 25 мм, на которую методом магнетронного напыления нанесен тонкий (50–100 нм) поглощающий металлический слой (обычно золото или титан). Поверх подложки размещена ограничительная стеклянная шайба 10, вырезанная методом LIBWE [5] из покровного стекла, необходимой толщины (обычно 110, 160, 200 мкм и более), которая задает толщину слоя гидрогеля. Во внутреннюю часть шайбы помещен необходимый объем гидрогеля 11, в который предварительно замешаны пробы целевых культур микроорганизмов либо частицы субстрата с локализованными на них целевыми культурами.

Оправка, в которой зафиксирована донорная подложка, закреплена на моторизированной двухкоординатной подвижке 12. Последняя состоит из набора микрорельсовых направляющих MGNR07H и опорных модулей MGN7CH (Hiwin, Тайвань), шаговых моторов форм-фактора NEMA8 с резьбовым валом с трапецеидальной резьбой 4.76 × 0.635 мм и комплекта пластиковых деталей, изготовленных с помощью трехмерного принтера. Двухкоординатная моторизированная подвижка 12 установлена на металлической пластине, снизу которой расположена двухкоординатная моторизированная подвижка 13. Она используется для перемещения акцепторной подложки, в качестве которой могут выступать чашки Петри, культуральные планшеты и другие произвольные подложки.

Моторизированные подвижки 12 и 13 управляются с помощью платы управления Bigtreetech SKR PRO v1.1 (Bigtreetech, Китай) с установленной прошивкой Marlin 2.0 (https://marlinfw.org/), что позволяет настроить необходимую комбинацию перемещений донорной и акцепторной подложек синхронно с гальваносканером 7 и импульсным лазерным источником 1. Вся установка собрана на сотовой оптической плите.

Часть установки – узел перемещения донорной и акцепторной подложек – при необходимости изолируется с помощью перчаточного бокса, выполненного из оргстекла, что позволяет поддерживать чистоту проведения экспериментов, контролировать температуру и влажность либо организовывать специфическую среду (например, бескислородную).

Управление процессом лазерной печати осуществляется с помощью компьютера, к которому подключены отдельные элементы лазерной системы (лазер 1, гальваносканер 7, моторизированный телескоп 4, плата управления шаговыми моторами 14), управляемые синхронно.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

Эксперименты по лазерной печати проводились с суспензией 2%-ного или 4%-ного водного раствора гиалуроновой кислоты с микрочастицами почвы. Предварительно на донорную подложку наносился слой суспензии гидрогеля толщиной от 110 до 300 мкм. Лазерное излучение фокусировалось на донорной подложке в пятно диаметром 30 мкм с гладким (близким к гауссову) поперечным распределением интенсивности.

Наблюдение, выполненное с помощью оптического 3D микроскопа HRM-300 (Huvitz, Korea), показало, что микрочастицы почвы в слое геля на донорной подложке распределяются крайне неравномерно: наиболее крупные частицы (носители микроорганизмов) располагаются внизу, на максимальном удалении от металлического поглощающего покрытия (рис. 2). Таким образом, воздействие различных негативных факторов (скачки температуры, ударные волны, прошедшее импульсное излучение) [6] на живые системы, находящиеся на относительно тяжелых и крупных носителях, можно минимизировать, используя достаточно толстый слой геля.

Рис. 2.

Распределение частиц почвы в слое геля толщиной 270 мкм на донорной подложке. Стрелками показано положение наиболее крупных частиц. g – направление ускорения свободного падения.

Эксперименты показали, что размеры полученных на акцепторной подложке микрокапель практически линейно зависят от энергии лазерного излучения (рис. 3). При этом с увеличением вязкости и толщины слоя геля их размер увеличивается. Таким образом, варьируя эти параметры [2], легко получить микрокапли заданного размера.

Рис. 3.

Зависимость размера гелевых микрокапель с частичками почвы на акцепторной подложке от энергии лазерного излучения для различных толщин слоя геля на донорной подложке и процентного содержания в нем гиалуроновой кислоты. Диаметр лазерного пятна 30 мкм, длительность лазерного импульса 8 нс. На вставке показан пример изображения микрокапли, полученного сканирующим электронным микроскопом.

На рис. 4а представлены кадры скоростной съемки, иллюстрирующие образование струи геля с частичками почвы в процессе лазерной печати. При использованной энергии лазерного импульса скорость струи достигала ~10 м/с. Биологическое тестирование показало, что лазерная печать не оказывала существенного негативного воздействия на переносимые микроорганизмы, которые активно прорастали на питательных средах акцепторной подложки (рис. 4б).

Рис. 4.

а – последовательные кадры образования струи геля с частичками почвы в процессе лазерной печати; б – фотографии колоний микроорганизмов, выросших на питательной среде акцепторной подложки в местах с перенесенными микрокаплями. Длительность лазерного импульса 8 нс, энергия 25 мкДж. Съемка проводилась скоростной камерой Fastcam SA3 (Photron, USA) на скорости 4000 кадров/с.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная установка для лазерной биопечати может эффективно использоваться в практической работе и научных исследованиях. Благодаря использованию оптической схемы, содержащей импульсный наносекундный лазерный источник, моторизированную телескопическую систему и объектив “Пи-шейпер”, можно легко варьировать в широких диапазонах параметры лазерного воздействия на донорную подложку. Это позволяет существенно расширить сферы применения технологии лазерной инженерии микробных систем по сравнению с известными аналогами [7, 8]. Предложенная установка позволяет реализовать стабильные режимы печати, исключающие перенос образующихся при разрушении поглощающей металлической пленки наночастиц [9]. С ее помощью можно проводить лазерную печать различными по размерам и физическим свойствам микроорганизмами, клетками и их агломератами, а также использовать разнообразные по вязкости гели.