Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 3, стр. 282-285
Биосинтез диалкиловых эфиров орто-фталевой кислоты в растениях и в культурах клеток
А. Г. Еникеев 1, А. А. Семенов 1, *, А. В. Пермяков 1, Н. А. Соколова 1, К. З. Гамбург 1, Л. В. Дударева 1
1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033 Иркутск, Россия
* E-mail: laps1936@mail.ru
Поступила в редакцию 05.04.2018
После доработки 21.09.2018
Принята к публикации 18.12.2018
Аннотация
Исследовано наличие сложных эфиров орто-фталевой кислоты в интактных растениях, в растениях in vitro, и культурах клеток. Выявлено, что все исследованные растительные объекты продуцируют фталевые эфиры в значительных количествах. Таким образом, биосинтез этих веществ является общим свойством растительного мира. Попадая в окружающую среду, они создают природный фон, независимо от возможных техногенных загрязнений.
Сложные эфиры орто-фталевой кислоты производятся химической промышленностью и широко используются во всем мире как пластификаторы пластических масс и ингредиенты косметических средств [1]. В то же время – это природные вещества, о нахождении которых в живых объектах сообщалось многими исследователями. Первое, известное авторам, сообщение об обнаружении фталатов в растениях датируется 1892 г., т.е. задолго до начала их промышленного производства [2]. К началу 70 гг. прошлого века эти соединения были обнаружены в винограде, маке, землянике, табаке, оливковом, кукурузном и эвкалиптовом маслах, грибах, рыбе, сердце и гипофизе быка [3]. Оптически активный ди-2R-этилгексилфталат присутствует в неочищенном тростниковом сахаре [4]. В последующие годы фталаты как вещества природного происхождения были неоднократно выделены из различных биологических объектов [5–7]. Орто-фталаты обладают широким спектром биологической активности [8–10], на их основе разработан ряд новых высокоэффективных лекарственных средств [11, 12]. Несмотря на наличие большого объема данных, подтверждающих биогенное происхождение фталатов, в современной экологической литературе доминирует мнение рассматривающее присутствие этих соединений в живых объектах исключительно как результат техногенного загрязнения [13–15].
Цель работы – анализ присутствия сложных эфиров орто-фталевой кислоты в растительных объектах различного происхождения и уровня организации (растения in situ, растения in vitro, культуры клеток) с целью подтверждения возможности биогенного происхождения данных соединений.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Для исследования растительный материал заготавливался в летние месяцы в Иркутской обл. и на Южном побережье Крыма (Россия) вдали от возможных техногенных загрязнений. Использовали хвою и листья древесных растений, произвольно выбранные травянистые растения различных таксономических групп, а также растения in vitro и культуры клеток из коллекции ЦКП “Биоресурсный центр” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск, Россия).
Подготовка и очистка химических реактивов. Все используемые органические растворители и материалы проверялись на присутствие в них фталатов. В случае наличия таковых в растворителях производилась очистка путем обработки щелочью с последующей промывкой водой, высушиванием и перегонкой. Для материалов, не подлежащих такой обработке, проводились холостые опыты. Использовали только стеклянную химическую посуду. Исключался контакт с пластическими массами.
Количественный анализ содержания фталатов. В качестве вспомогательного материала для количественного определения фталатов (освобождение от хлорофилла) использовали “окислитель”, приготовляемый встряхиванием хроматографического оксида алюминия (40–50 мкм) с 1%-ным ацетоновым раствором перманганата калия в соотношении 1 : 10 до исчезновения окраски надосадочной жидкости. После фильтрования светло-коричневый порошок промывали хлороформом и высушивали на воздухе.
Точные навески воздушно-сухих образцов измельчали до размеров частиц <0.5 мм и исчерпывающе экстрагировали легким петролейным эфиром. Экстракт медленно пропускали без отсасывания через ~1–1.5 см слой окислителя, промывали хлороформом и объединенные элюаты упаривали досуха. Остаток от перегонки переносили с помощью стандартного раствора в градуированный пикнометр и доводили до метки. В качестве внутреннего стандарта использовали гексановый раствор динонилфталата точно известной концентрации.
Растения in vitro и освобожденные от среды фильтрованием культуры клеток высушивали лиофильно на установке “Иней 3-2” (Россия). Точные навески полученных таким способом образцов исчерпывающе экстрагировали легким петролейным эфиром и обрабатывали как указано выше.
Анализ образцов проводили методом газо-жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором с использованием хромато-масс-спектрометра 7000QQQ/7890A (“Agilent Technologies”, США). Объем вводимой пробы 0.2 мкл. Температура испарителя 250°С, источника ионов 230°С, температура детектора 150°С, температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром, 280°С. Диапазон сканирования 50–800 а. е. м. Для разделения использовали капиллярную колонку HP-5MS (30 м × 0.250 мм × 0.50 мкм), с фазой 5%‑ного фенил-метил-полисилоксана, градиент температуры: от 70 до 280°С со скоростью 5°С/мин, затем выдерживание при 280°С в течение 10 мин. Газ-носитель – гелий, скорость потока газа 1 мл/мин. Разделение потоков 5 : 1. Масс-спектрометр – тройной квадруполь, способ ионизации – электронный удар (энергия ионизации 70 эВ). Анализ проводили в режиме поиска отдельных ионов. Для идентификации целевых соединений использовали сравнение их времен удерживания с временами удерживания стандартов, а также с библиотекой масс-спектров NIST08 и WILEY7. Количество фталевых эфиров определяли сравнением площадей хроматографических пиков с площадью пика внутреннего стандарта.
Опыты проводили трижды. В таблицах приведены средние значения по трем опытам и средняя квадратичная ошибка.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Во всех собранных в природных условиях растительных образцах обнаружены дибутил-орто-фталат (ДБФ) и ди-орто-2-этилгексифталат (ДЭГФ) в разных количествах и соотношениях (табл. 1). Аналогичные результаты ранее неоднократно были получены другими авторами [16]. О биогенном происхождении орто-фталатов в растениях свидетельствуют значительные вариации соотношений ДБФ и ДЭГФ у разных видов. Как поллютанты фталаты попадают в растения путем диффузии, следовательно, у растений разных видов, собранных в пределах одного узкого ареала, относительное содержание различных фталатов должно быть одинаковым.
Таблица 1.
Вид | ДБФ | ДЭГФ |
---|---|---|
Pleurozium schreberi Willd. Ex Brid | 98 ± 3 | 19 ± 1 |
Marchantia polymorpha L. | 11 ± 7 | 67 ± 3 |
Equisetum sylvaticum L. (весенний побег) | 11 ± 1 | 27 ± 2 |
Equisetum sylvaticum L. (летний побег) | 14 ± 2 | 19 ± 1 |
Licopodium clavatum L. | 8 ± 1 | 37 ± 1 |
Athyrium filix-femia Roth et Mert | 19 ± 1 | 9 ± 1 |
Gymnocarpium dryopteris (L.) Newman | 12 ± 2 | 13 ± 2 |
Abies sibirica Lodeb. | 33 ± 1 | 45 ± 3 |
Juniperus communis L. | 32 ± 2 | 39 ± 1 |
Larix sibirica Lodeb. | 11 ± 2 | 27 ± 2 |
Picea obovata Lodeb. | 9 ± 1 | 44 ± 3 |
Pinus sibirica Du Tour | 14 ± 1 | 43 ± 2 |
Pinus sylvestris L. | 16 ± 2 | 23 ± 2 |
Pinus nigra subsp. pallasiana (Lamb.) Holmboe* | 60 ± 1 | 66 ± 3 |
Pinus brutia var. stankewiczii (Sukaczev) Frankis* | 32 ± 2 | 39 ± 1 |
Alnus alnobetula subsp. fruticose (Rupr.) Raus. | 23 ± 1 | 55 ± 3 |
Betula platyphylla Sukaczev | 8 ± 1 | 14 ± 2 |
Fagus sylvatica L. * | 23 ± 2 | 32 ± 3 |
Magnolia grandiflora L. * | 118 ± 5 | 14 ± 2 |
Pistacia atlantica subsp. Mutica (Fisch&C.A.Mey.) Rech.F.* | 173 ± 4 | 43 ± 2 |
Populus tremula L. (листья) | 21 ± 3 | 23 ± 2 |
Populus tremula L. (кора) | 8 ± 1 | 12 ± 1 |
Quercus pubescens Willd* | 74 ± 3 | 23 ± 3 |
Vibumum rhytidophyllum Hemsl* | 23 ± 2 | 25 ± 3 |
Elodea canadensis Michx | 22 ± 1 | 120 ± 2 |
Linaria vulgaris Mill., | 13 ± 1 | 89 ± 5 |
Myriophyllum sibiricum Kom | 38 ± 2 | 158 ± 5 |
Allium victorialis L. | 13 ± 3 | 5 ± 1 |
Paris quadrifolia L. | 765 ± 5 | 360 ± 6 |
Triticum aestivum L. (этиолир.проростки) | 42 ± 2 | 36 ± 3 |
Veratrum lobelianum Bernh | 219 ± 9 | 56 ± 3 |
Для полного исключения возможности загрязнения растительных тканей фталатами извне в качестве объектов исследования использовали закрытые модельные системы – растения in vitro и культуры клеток. Все компоненты сред предварительно проверяли на наличие фталатов. Примеси фталатов обнаружены во всех проверенных образцах сахарозы, включая реактивы высшей степени очистки (“ХЧ” и “for cell culture”). Ранее наличие значительных количеств оптически активного ДЭГФ было обнаружено в “желтом” сахаре [4]. Вероятно, данное соединение является плохо отделяемой природной примесью, что обуславливает его наличие в сахарозе. Для исключения загрязнения пробирочные растения и культуры клеток до начала экспериментов не менее трех пассажей выращивали на средах с глюкозой, не содержавшей фталатов. Остальные компоненты сред фталатов не содержали.
Во всех исследованных пробирочных растениях и в культурах клеток обнаружены орто-фталаты, при этом их качественный состав идентичен растениям in situ (табл. 2). Единственным источником этих соединений в закрытых системах может быть только их биосинтез. Показано, что ДЭГФ из культуры клеток борца байкальского оптически активен [17]. Таким образом, можно утверждать, что бытующее мнение о фталатах исключительно как о техногенных поллютантах нуждается в коррекции. Эти вещества в изобилии поступают в окружающую среду из царства растений.
Таблица 2.
Вид | ДБФ | ДЭГФ |
---|---|---|
Растения in vitro | ||
Nicotiana tabacum L. | 47 ± 7 | 100 ± 11 |
Oxytropis triphylla (Pallas) Pers. | 9 ± 6 | 18 ± 1 |
Solanum tuberosum L. (сорт Луговской) | 50 ± 1 | 63 ± 2 |
Культуры клеток | ||
Aconitum baicalense Turcz. ex Rapaics | 24 ± 2 | 332 ± 20 |
Aconitum barbatum Patr. ex Pers. | 10 ± 2 | 246 ± 3 |
Nicotiana tabacum L. | 15 ± 2 | 76 ± 4 |
Saussurea controversa DS | 9 ± 1 | 124 ± 11 |
Scorzonera hispanica L. | 85 ± 3 | 82 ± 2 |
Solanum tuberosum L. (сорт Луговской) | 13 ± 2 | 43 ± 2 |
Физиологические функции орто-фталатов неизвестны. Имеются лишь несколько сообщений описывающих некоторые физиологические эффекты действия этих соединений. ДБФ из корневых экссудатов бобовых участвует в отрицательном аллопатическом взаимодействии с клубеньковыми бактериями [18]. При опрыскивании растений пшеницы 1% раствором ДБФ наблюдали ингибирование дыхательной цепи митохондрий и индукцию апоптоза [19]. Однако в этих экспериментах использовали очень высокую, выходящую за рамки физиологических значений, концентрацию фталата, что могло вызвать неспецифический ответ.
Изучение физиологической роли орто-фталатов в растениях позволит расширить знания о биохимических механизмах регуляции растительного метаболизма и взаимодействии растений с другими организмами.
Работа выполнена на оборудовании ЦКП “Биоаналитика” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).
Список литературы
Мазитова А.К., Аминова Г.К., Маскова А.Р., Буйлова Е.А. // Нефтегазовое дело. 2015. Т. 13. № 3. С. 83–86.
Parry E.J. Monographs on Essential Oils, London: Scott, Greenwood and Inc. (Londres), 1892. V. 1. P. 212–230.
Graham P.R. // Environmental Health Perspectives. 1973. V. 3. P. 3–11.
Черных Е.А, Семенов А.А. // Химия природных соединений. 1980. № 2. С. 247–248.
Babu B., Wu J.T. // Sciense of the Total Environment. 2010. V. 408. № 21 P. 4969–4975.
Husein A.I., Ali-Shtayeh M.S., Jamous R.M., Jondi W.J., Zatar N.A.A. // International J. Current Research and Academic Review. 2014. V. 2. № 9. P. 195–203.
Tian C., Ni J., Chang F., Liu S., Xu N., Sun W., Xie Y., Guo Y., Ma Y., Yang Z., Dang C., Huang Y., Tian Z., Wang Y. // Scientific Repots. 2016. V. 6. 19791. doi 10.1038/srep19791
Lee K.H., Kim J.H., Lim D.S., Kim, C.H. // J. Pharmacy and Pharmacology. 2000. V. 52. № 5. P. 593–598.
El-Sayed M.H. // World Applied Sciences J. 2012. V. 20. P. 1202–1212.
Rameshthangam P., Ramasamy P. // Virus Research. 2007. V. 126. № 1. P. 38–44.
Николаева И.Г., Хобракова В.Б., Баторова С.М., Николаева Г.Г., Николаев, С.М., Горшков А.Г., Верещагин А.Л., Парьева К.В., Монголов Х.П. // Химико-фармацевтический журн. 2005. Т. 39. № 8. С. 37–40.
Семенов А.А, Громова А.С., Луцкий В.И., Неретина О.В., Плотникова Ю.К., Малов И.В., Лязин А.Б. 2008. Патент РФ. № 2322975.
Азарова И.Н., Парфенова В.В., Барам Г.И., Теркина И.А., Павлова О.Н., Суслова М.Ю. // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 6. С. 665–669.
Крылов В.А., Волкова В.В. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2014. № 1–2. С. 210–213.
Niu L., Xu Y., Xu C., Yun L., Liu W. // Environmental Pollution. 2014. V. 195. P. 16–23.
Rajamanikyam M., Vadlapudi V., Parvathaneni S.P., Koude D., Sripadi P., Misra S., Amanchy R., Upadhyayula S.M. // EXCLI J. 2017. V. 16. P. 375–387.
Семенов А.А., Еникеев А.Г., Снеткова Л.В., Пермяков А.В., Соколова Н.А., Дударева Л.В. // Докл. РАН. 2016. Т. 471. № 3. С. 366–367.
Макарова Л.Е., Дударева Л.В., Петрова И.Г., Васильева Г.Г. // Прикл. биохимия микробиология. 2016 Т. 53. № 2. С. 217–222.
Воробьев А.Л., Смирнова Е.Г., Бакеева Л.Е., Ягужинский Л.С. // Докл. РАН. 2005. 405. № 3. 412–415.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Прикладная биохимия и микробиология