Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 5, стр. 460-464
Влияние способа синтеза нанокомплексов на протеолитическую активность химотрипсина, иммобилизованного на наночастицах серебра
А. В. Плющенко 1, 2, Л. Н. Боровикова 1, О. А. Писарев 1, 2, *
1 Институт высокомолекулярных соединений РАН
199004 Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
19251 Санкт-Петербург, Россия
* E-mail: chrom79@yandex.ru
Поступила в редакцию 16.01.2019
После доработки 20.03.2019
Принята к публикации 22.04.2019
Аннотация
На основе реакции восстановления азотнокислого серебра боргидридом натрия разработаны два способа синтеза гибридных органо-неорганических нанокомплексов, включающих химотрипсин и наночастицы серебра. Согласно первому способу синтеза фермент добавляли в реакционную среду одновременно с другими реагентами, а второму – его добавляли в реакционную среду через определенные промежутки времени после начала реакции восстановления. Химотрипсин, иммобилизованный в составе нанокомплексов, стабилизировал наночастицы серебра. Полученный обоими способами иммобилизованный фермент обладал повышенной по сравнению с нативным ферментом протеолитической активностью и в кислой и в сильно щелочной среде. При этом химотрипсин, иммобилизованный на наночастицах серебра вторым способом синтеза, обладал наибольшей активностью.
Физико-химические условия, в которых используются ферменты в медицине и различных биотехнологических процессах, нередко оказываются неоптимальными для их функционирования, что приводит к значительному снижению их ферментативной активности. В связи с этим разработка новых методов иммобилизации ферментов, способствующих сохранению их активности при неоптимальных условиях среды, относится к одной из важнейших задач современной биотехнологии.
В настоящее время большое внимание уделяется исследованиям, связанным с разработкой методов иммобилизации ферментов на неорганических наночастицах. Это обусловлено двумя обстоятельствами. Во-первых, такой подход приводит к реализации многоточечного взаимодействия фермента с наночастицами, что повышает его температурную и рН стабильность и длительность хранения. Во-вторых, вследствие отсутствия стерических препятствий диффузионный транспорт субстрата к активному центру иммобилизованного фермента существенно “облегчается” (в отличие от иммобилизации ферментов на полимерах), что во многих случаях приводит к увеличению его ферментативной активности [1–3]. Использование в качестве носителей наночастиц, обладающих также биологической активностью, позволяет создавать полифункциональные органо-неорганические нанокомплексы, в которых каждая составляющая обеспечивает различную биологическую активность [4, 5].
Наночастицы серебра (Ag) обладают антибактериальными, а также уникальными физическими и электрическими свойствами [6, 7]. Нанокомплексы на основе химотрипсина (ХТ) и наночастиц Ag, сочетающие протеолитические и бактерицидные свойства, способны стать основой полифункциональных лекарственных препаратов для лечения ран, ожогов и других воспалительных процессов [5].
Цель работы – синтез и изучение размерных свойств нанокомплексов, включающих ХТ и наночастицы Ag, а также изучение протеолитической активности иммобилизованного ХТ.
МЕТОДИКА
В работе использовали α-химотрипсин (КФ 3.4.21.1, “AppliChem”, Германия), казеинат натрия (“ООО Бригантина”, Россия), нитрат серебра, боргидрид натрия, трихлоруксусную кислоту, гидроксид натрия, уксусную, ортофосфорную и борную кислоты и тирозин (“Вектон”, Россия).
Иммобилизация ХТ на наночастицах Ag осуществлялась путем введения фермента в реакцию восстановления (1) азотнокислого серебра (AgNO3) боргидридом натрия (NaBH4) с образованием коллоидного Ag.
(1)
$\begin{gathered} {\text{AgN}}{{{\text{О }}}_{3}} + {\text{NaB}}{{{\text{H}}}_{4}} + {{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}} = \\ = {\text{Ag}} + {\text{NaN}}{{{\text{O}}}_{3}} + {\text{B}}{{\left( {{\text{OH}}} \right)}_{3}} + {{{\text{H}}}_{2}}. \\ \end{gathered} $Эта реакция осуществлялась в водной среде при атмосферном давлении, 4°С и 24-кратном (относительно эквимолярного) избытке NaBH4. Величины концентраций Ag (СAg) и ХТ (CХТ) составляли 0.1 и 2 мг/мл соответственно.
В качестве восстановителя был выбран NaBH4, поскольку при его значительном избытке можно получить наночастицы размером меньше 50 нм вследствие большой разницы редокс-потенциалов восстановителя (–1.24 В, в щелочной среде) и Ag (0.8 В). Такого размера стабилизированные наночастицы Ag нетоксичны и обладают высокой бактерицидной активностью [8], а иммобилизованный ХТ одновременно выполнял функцию стабилизатора наночастиц Ag в растворе.
Были изучены два способа образования нанокомплексов (рис. 1):
а) ХТ добавляли в реакционную среду одновременно с другими реагентами (метод иммобилизации I, Ag-ХТ-I);
б) ХТ добавляли в реакционную среду через определенные промежутки времени после начала реакции синтеза (метод иммобилизации II, Ag-ХТ-II).
Значения рН растворов измеряли на рН-метре рН-673М (“Измерительная техника”, Россия), а их оптическую плотность определяли в кварцевых кюветах (1 × 1 см) в диапазоне от 220 до 800 нм на спектрофотометре Specord M-40 (“Carl Zeiss”, Германия).
Эффективные гидродинамические радиусы (Rh) наноструктур определяли методом динамического рассеяния света (ДРС) [9]. Корреляционную функцию интенсивности рассеянного света получали с помощью коррелятора Photocor-FC с числом каналов 288 (“ООО Фотокор”, Россия). Анализ корреляционной функции осуществляли с помощью программы обработки данных DLS Dynals (“Гелиос”, Россия).
Протеолитическую активность ХТ определяли согласно ГОСТ 20264.2-88. Гидролиз казеината натрия, который использовался в качестве белкового субстрата, осуществляли при 37°С. Раствор казеината натрия готовили путем его растворения в универсальном буфере с заданным значением рН. Для приготовления универсального буферного раствора использовали 0.1 н. уксусную, ортофосфорную и борную кислоты, которые смешивали в равных объемных соотношениях. Значение рН раствора изменялось добавлением различного количества 1 н. NaOH. Для осуществления гидролиза в 68 мл раствора субстрата (С = 10 мг/мл) вносили 3.4 мл раствора нативного ХТ (СХТ = = 2 мг/мл), либо нанокомплекса (СХТ = 2 мг/мл). Через определенные промежутки времени из реакционной смеси отбирали по 2 мл, добавляли 3 мл 0.5 н трихлоруксусной кислоты для остановки гидролиза. В качестве контроля использовали 2 мл раствора казеината натрия. Затем выпавший осадок отфильтровывали и измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости при 280 нм. Концентрацию прогидролизованного белка определяли, используя калибровочную кривую, полученную для тирозина.
За единицу активности (ед.) принимали количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоль тирозина в мин в условиях эксперимента. Активность фермента рассчитывалась по формуле:
где A – активность фермента, мкмоль мин–1, P – концентрация продукта реакции, мкмоль л–1, t – время реакции, мин.Удельную активность рассчитывали как число единиц активности на 1 мг фермента:
где Aудел – удельная активность фермента, ед. мг–1, m – масса фермента, мг.РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что оптимальные условия для действия нативного ХТ рН ~8.0, фермент быстро теряет свою активность при рН ниже 7.0 и выше 9.0 [10]. В связи с этим было проведено изучение протеолитической активности нанокомплексов ХТ с наночастицами Ag при значениях рН, равных 6.0, 8.0 и 11.0.
Размеры нанокомплексов Ag-ХТ-I (рис. 1а), определенные методом просвечивающей электронной микроскопии, находились в диапазоне от 2 до 5 нм [11]. Для получения более крупных стабилизированных наночастиц ХТ добавляли в реакционную среду через определенные промежутки времени после начала реакции синтеза (Ag-ХТ-II, рис. 1б).
На рис. 2 представлена зависимость среднего гидродинамического радиуса нанокомплексов Ag-ХТ-II от времени введения ХТ в реакционную смесь после начала реакции синтеза наночастиц Ag. При добавлении ХТ в реакционную смесь после небольшого промежутка времени (10–25 мин) наблюдался постепенный рост размеров нанокомплексов Ag-ХТ-II. Можно предположить, что введение ХТ в реакционную смесь на ранних этапах синтеза, когда окислительно-восстановительная реакция не завершена, способствовало стабилизации не полностью сформировавшихся наночастиц Ag. Вместе с тем, при дальнейшем увеличении продолжительности реакции синтеза наночастиц Ag до добавления ХТ (более 1 ч) не наблюдалось значительного изменения размеров образующихся нанокомплексов. По-видимому, в этом случае введение ХТ в реакцию восстановления приводило к предотвращению возможной агрегации наночастиц.
В связи с этим, была изучена протеолитическая активность нанокомплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II, которые были получены путем введения ХТ в реакцию синтеза через 1 ч после начала реакции.
В табл. 1 представлены значения удельных протеолитических активностей нативного ХТ и нанокомплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II при рН 6.0, 8.0 и 11.0. Видно, что при рН 8.0 наибольшую активность проявлял нативный ХТ (3.45 ед. мг–1), превышая удельную активность нанокомплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II на ~17 и ~21% соответственно. Однако при рН 6.0 и 11.0 наибольшей активностью обладал нанокомплекс Ag-ХТ-II. Так, его удельная активность превышала как активность ХТ, так и нанокомплекса Ag-ХТ-I, при рН 6.0 на ~17 и ~25% соответственно, а при рН 11.0 – на ~33 и ~41% соответственно.
Таблица 1.
Образец | Аудел, ед. мг–1 | ||
---|---|---|---|
рН 6.0 | рН 8.0 | рН 11.0 | |
ХТ | 2.40 | 3.45 | 1.62 |
Ag-ХТ-I | 2.22 | 2.87 | 1.43 |
Ag-ХТ-II | 2.87 | 2.73 | 2.42 |
Однако, значения удельной активности фермента, определяемые на начальном этапе реакции в условиях избытка субстрата, не описывали полностью картину изучаемых процессов. В связи с этим была изучена кинетика накопления продукта ферментативной реакции для нативного и иммобилизованных ферментов (рис. 3а, 3б, 3в). На диаграмме (рис. 4) представлены суммарные данные по влиянию рН на максимальное количество продуктов реакций гидролиза.
При рН 8.0 конечное содержание продукта реакции гидролиза субстрата при использовании нативного фермента превышало эту величину для нанокомплексов на ~13% вне зависимости от метода синтеза. Следовательно, иммобилизация ХТ на наночастицах Ag значительно не снижала его ферментативной активности при рН 8.0. При этом максимальное количество продукта реакции наблюдалось после ~30 мин гидролиза нанокомплексом Ag-ХТ-I, и после ~70 мин – нанокомплексом Ag-ХТ-II. Таким образом, при рН 8.0 реакция гидролиза ферментом, иммобилизованным на наночастицах Ag меньшего размера (Ag-ХТ-I), протекала быстрее, чем при его иммобилизации на более крупных наночастицах (Ag-ХТ-II).
При рН 6.0 и 11.0 наблюдалось повышение конечного содержания продукта реакции гидролиза при использовании нанокомплексов по сравнению с нативным ХТ (рис. 4). При этом наивысшую протеолитическую активность проявлял нанокомплекс Ag-ХТ-II. Так, конечное содержание продукта реакции, катализируемой этим нанокомплексом, повышалось при рН 6.0 по сравнению с нативным ХТ на ~15%, а нанокомплексом Ag-ХТ-I – на ~10%, а при рН 11.0 – по сравнению с нативным ХТ – на ~23%, а нанокомплексом Ag-ХТ-I – на ~17%.
В щелочной среде эффект повышения по сравнению с нативным ХТ протеолитической активности фермента, иммобилизованного на наночастицах, наблюдался и при его иммобилизации на наночастицах селена [3]. Отметим также, что протеолитическая активность нанокомплекса Ag-ХТ-II при рН 6.0 и 11.0 увеличивалась и по сравнению с нанокомплексом Ag-ХТ-I.
Таким образом, иммобилизация ХТ на наночастицах Ag повышала его протеолитическую активность в кислой и сильно щелочной среде, то есть в неоптимальных условиях функционирования нативного фермента.
Список литературы
Arsalan A., Younus H. // Int. J. Biol. Macromol. 2018. V. 118. № 11. P. 1833–1847.
Zewde B., Ambaye A., Stubbs J. III.,Dharmara R. // Nanotechnol. Nanomed. 2016. V. 4. № 2. P. 1043–1056.
Плющенко А.В., Боровикова Л.Н., Писарев О.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 2018. Т. 54. № 4. С. 362–365.
Walper S.A., Turner K.B., Medinz I.L. // Curr. Opinion. Biotechnol. 2015. V. 34. № 1. P. 232–241.
Писарев О.А., Титова А.В., Боровикова Л.Н., Киппер А.И., Ворошилова Т.М., Панарин Е.Ф. // Изв. Акад. наук. Сер. хим. 2016. Т. 64. № 3. С. 790–794.
Bhosale M.A., Bhanage B.M. // Curr. Org. Chem. 2015. V. 19. № 8. P. 708–727.
Терентьева E.A., Апяри В.В., Кочук Е.В., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А. // Журн. аналит. химии. 2017. Т. 72. № 11. С. 978–999.
Moritz M., Geszke M. // Chem.Eng. Journ. 2013. V. 226. № 2. P. 596–613.
Brown W. Dynamic Light Scattering: the Method and Some Application. Oxford: Clarondon Press, 1993. 617 p.
Кулаков В.И., Насонова В.А., Савельев В.С. Системная энзимотерапия. Опыт и перспективы. Санкт-Петербург: Интер-Медика, 2004. 264 с.
Плющенко А.В., Митусова К.А., Боровикова Л.Н., Киппер А.И., Писарев О.А. // Оптика и спектроскопия. 2018. Т. 125. № 2. С. 234–239.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Прикладная биохимия и микробиология