Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 5, стр. 460-464

МЕТОДИКА

В работе использовали α-химотрипсин (КФ 3.4.21.1, “AppliChem”, Германия), казеинат натрия (“ООО Бригантина”, Россия), нитрат серебра, боргидрид натрия, трихлоруксусную кислоту, гидроксид натрия, уксусную, ортофосфорную и борную кислоты и тирозин (“Вектон”, Россия).

Иммобилизация ХТ на наночастицах Ag осуществлялась путем введения фермента в реакцию восстановления (1) азотнокислого серебра (AgNO₃) боргидридом натрия (NaBH₄) с образованием коллоидного Ag.

Эта реакция осуществлялась в водной среде при атмосферном давлении, 4°С и 24-кратном (относительно эквимолярного) избытке NaBH₄. Величины концентраций Ag (С_Ag) и ХТ (C_ХТ) составляли 0.1 и 2 мг/мл соответственно.

В качестве восстановителя был выбран NaBH₄, поскольку при его значительном избытке можно получить наночастицы размером меньше 50 нм вследствие большой разницы редокс-потенциалов восстановителя (–1.24 В, в щелочной среде) и Ag (0.8 В). Такого размера стабилизированные наночастицы Ag нетоксичны и обладают высокой бактерицидной активностью [8], а иммобилизованный ХТ одновременно выполнял функцию стабилизатора наночастиц Ag в растворе.

Были изучены два способа образования нанокомплексов (рис. 1):

а) ХТ добавляли в реакционную среду одновременно с другими реагентами (метод иммобилизации I, Ag-ХТ-I);

б) ХТ добавляли в реакционную среду через определенные промежутки времени после начала реакции синтеза (метод иммобилизации II, Ag-ХТ-II).

Значения рН растворов измеряли на рН-метре рН-673М (“Измерительная техника”, Россия), а их оптическую плотность определяли в кварцевых кюветах (1 × 1 см) в диапазоне от 220 до 800 нм на спектрофотометре Specord M-40 (“Carl Zeiss”, Германия).

Эффективные гидродинамические радиусы (R_h) наноструктур определяли методом динамического рассеяния света (ДРС) [9]. Корреляционную функцию интенсивности рассеянного света получали с помощью коррелятора Photocor-FC с числом каналов 288 (“ООО Фотокор”, Россия). Анализ корреляционной функции осуществляли с помощью программы обработки данных DLS Dynals (“Гелиос”, Россия).

Протеолитическую активность ХТ определяли согласно ГОСТ 20264.2-88. Гидролиз казеината натрия, который использовался в качестве белкового субстрата, осуществляли при 37°С. Раствор казеината натрия готовили путем его растворения в универсальном буфере с заданным значением рН. Для приготовления универсального буферного раствора использовали 0.1 н. уксусную, ортофосфорную и борную кислоты, которые смешивали в равных объемных соотношениях. Значение рН раствора изменялось добавлением различного количества 1 н. NaOH. Для осуществления гидролиза в 68 мл раствора субстрата (С = 10 мг/мл) вносили 3.4 мл раствора нативного ХТ (С_ХТ = = 2 мг/мл), либо нанокомплекса (С_ХТ = 2 мг/мл). Через определенные промежутки времени из реакционной смеси отбирали по 2 мл, добавляли 3 мл 0.5 н трихлоруксусной кислоты для остановки гидролиза. В качестве контроля использовали 2 мл раствора казеината натрия. Затем выпавший осадок отфильтровывали и измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости при 280 нм. Концентрацию прогидролизованного белка определяли, используя калибровочную кривую, полученную для тирозина.

За единицу активности (ед.) принимали количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоль тирозина в мин в условиях эксперимента. Активность фермента рассчитывалась по формуле:

где A – активность фермента, мкмоль мин^–1, P – концентрация продукта реакции, мкмоль л^–1, t – время реакции, мин.

Удельную активность рассчитывали как число единиц активности на 1 мг фермента:

где A_удел – удельная активность фермента, ед. мг^–1, m – масса фермента, мг.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что оптимальные условия для действия нативного ХТ рН ~8.0, фермент быстро теряет свою активность при рН ниже 7.0 и выше 9.0 [10]. В связи с этим было проведено изучение протеолитической активности нанокомплексов ХТ с наночастицами Ag при значениях рН, равных 6.0, 8.0 и 11.0.

Размеры нанокомплексов Ag-ХТ-I (рис. 1а), определенные методом просвечивающей электронной микроскопии, находились в диапазоне от 2 до 5 нм [11]. Для получения более крупных стабилизированных наночастиц ХТ добавляли в реакционную среду через определенные промежутки времени после начала реакции синтеза (Ag-ХТ-II, рис. 1б).

На рис. 2 представлена зависимость среднего гидродинамического радиуса нанокомплексов Ag-ХТ-II от времени введения ХТ в реакционную смесь после начала реакции синтеза наночастиц Ag. При добавлении ХТ в реакционную смесь после небольшого промежутка времени (10–25 мин) наблюдался постепенный рост размеров нанокомплексов Ag-ХТ-II. Можно предположить, что введение ХТ в реакционную смесь на ранних этапах синтеза, когда окислительно-восстановительная реакция не завершена, способствовало стабилизации не полностью сформировавшихся наночастиц Ag. Вместе с тем, при дальнейшем увеличении продолжительности реакции синтеза наночастиц Ag до добавления ХТ (более 1 ч) не наблюдалось значительного изменения размеров образующихся нанокомплексов. По-видимому, в этом случае введение ХТ в реакцию восстановления приводило к предотвращению возможной агрегации наночастиц.

В связи с этим, была изучена протеолитическая активность нанокомплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II, которые были получены путем введения ХТ в реакцию синтеза через 1 ч после начала реакции.

В табл. 1 представлены значения удельных протеолитических активностей нативного ХТ и нанокомплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II при рН 6.0, 8.0 и 11.0. Видно, что при рН 8.0 наибольшую активность проявлял нативный ХТ (3.45 ед. мг^–1), превышая удельную активность нанокомплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II на ~17 и ~21% соответственно. Однако при рН 6.0 и 11.0 наибольшей активностью обладал нанокомплекс Ag-ХТ-II. Так, его удельная активность превышала как активность ХТ, так и нанокомплекса Ag-ХТ-I, при рН 6.0 на ~17 и ~25% соответственно, а при рН 11.0 – на ~33 и ~41% соответственно.

Однако, значения удельной активности фермента, определяемые на начальном этапе реакции в условиях избытка субстрата, не описывали полностью картину изучаемых процессов. В связи с этим была изучена кинетика накопления продукта ферментативной реакции для нативного и иммобилизованных ферментов (рис. 3а, 3б, 3в). На диаграмме (рис. 4) представлены суммарные данные по влиянию рН на максимальное количество продуктов реакций гидролиза.

При рН 8.0 конечное содержание продукта реакции гидролиза субстрата при использовании нативного фермента превышало эту величину для нанокомплексов на ~13% вне зависимости от метода синтеза. Следовательно, иммобилизация ХТ на наночастицах Ag значительно не снижала его ферментативной активности при рН 8.0. При этом максимальное количество продукта реакции наблюдалось после ~30 мин гидролиза нанокомплексом Ag-ХТ-I, и после ~70 мин – нанокомплексом Ag-ХТ-II. Таким образом, при рН 8.0 реакция гидролиза ферментом, иммобилизованным на наночастицах Ag меньшего размера (Ag-ХТ-I), протекала быстрее, чем при его иммобилизации на более крупных наночастицах (Ag-ХТ-II).

При рН 6.0 и 11.0 наблюдалось повышение конечного содержания продукта реакции гидролиза при использовании нанокомплексов по сравнению с нативным ХТ (рис. 4). При этом наивысшую протеолитическую активность проявлял нанокомплекс Ag-ХТ-II. Так, конечное содержание продукта реакции, катализируемой этим нанокомплексом, повышалось при рН 6.0 по сравнению с нативным ХТ на ~15%, а нанокомплексом Ag-ХТ-I – на ~10%, а при рН 11.0 – по сравнению с нативным ХТ – на ~23%, а нанокомплексом Ag-ХТ-I – на ~17%.

В щелочной среде эффект повышения по сравнению с нативным ХТ протеолитической активности фермента, иммобилизованного на наночастицах, наблюдался и при его иммобилизации на наночастицах селена [3]. Отметим также, что протеолитическая активность нанокомплекса Ag-ХТ-II при рН 6.0 и 11.0 увеличивалась и по сравнению с нанокомплексом Ag-ХТ-I.

Таким образом, иммобилизация ХТ на наночастицах Ag повышала его протеолитическую активность в кислой и сильно щелочной среде, то есть в неоптимальных условиях функционирования нативного фермента.