Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 6, стр. 561-570

МЕТОДИКА

Получение рекомбинантного химозина марала. Конструирование экспрессионного вектора. В работе использовали нуклеотидную последовательность, кодирующую прохимозин (ПроХн) марала, представленную в базе GenBank (MT225406). Для экспрессии в системе Escherichia coli (штамм SHaffle express) оптимизировали кодонный состав последовательности при помощи онлайн сервиса “Codon Optimisation Tool” (“Integrated DNA Technologies”, США). Оптимизированная нуклеотидная последовательность ПроХн марала (CYM-Cer) была синтезирована ООО “ДНК-синтез” (Россия) и получена в составе клонирующего вектора pGH. Синтезированный ген был клонирован в состав экспрессионного вектора pET21a (“Novagen”, “Merck”, ФРГ) по уникальным сайтам рестрикции (HindIII и BamHI). В результате, был получен плазмидный вектор pET21-CYM-Cer.

Получение препарата рХн марала. Сконструированной экспрессионной плазмидой (pET21-CYM-Cer) проводили химическую трансформацию клеток E. coli, штамм SHaffle express. Индивидуальные колонии, содержавшие рекомбинантные плазмиды, культивировали на орбитальном шейкере (180 об./мин) в среде LB в течение ночи при 37°C. Инокулят в соотношении 1 : 100 переносили в колбы Эрленмейера, содержавше свежую среду LB, и растили до оптической плотности (при 600 нм), равной 0.8. Для оптимизации продукции целевого белка варьировали концентрацию вносимого индуктора, а также время и температуру дополнительной стадии культивирования. В инокулят вносили изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 0.1, 1.0, 10.0 мМ, и дополнительно культивировали штамм-продуцент на шейкере (180 об./мин) в течение 2, 6 и 12 ч при 25 и 37°C.

После завершения культивирования из биомассы клеток продуцента выделяли тельца включения, содержавшие рекомбинантный ПроХн марала (рПроХн Cer). Для этого биомассу осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин при 4°С. Полученный осадок ресуспендировали в буфере STET, рН 8.0, (содержавшем 8% сахарозы, 50 мМ трис, 20 мM ЭДТА, 5% тритона X-100), из расчета 20 мл на 1 грамм биомассы и инкубировали в течение ночи при 4°С. После окончания инкубации клетки разрушали при 4°С с использованием ультразвукового (УЗ) гомогенизатора Soniprep 150 Plus (“MSE”, КНР). Суспензию клеток подвергали УЗ воздействию (2000 Вт/литр и 283 Вт/см²) в течение 1 мин, затем смесь охлаждали до 4°С. Процедуру повторяли трижды. Тельца включения осаждали центрифугированием при 20 000 g в течение 20 мин при 4°С.

Солюбилизацию телец включения и последующий рефолдинг целевого белка проводили по методу [10] с небольшими модификациями. Осажденные тельца включения солюбилизировали в буфере А, рН 10.7 (50 мМ KH₂PO₄, 150 мМ NaCl) в который добавляли мочевину, до конечной концентрации 8 М, инкубировали 24 ч при 15°С и центрифугировали при 20 000 g в течение 20 мин. В полученном супернатанте определяли концентрацию белка. Для ренатурации полученного рПроХн супернатант разбавляли буфером А до конечной концентрации белка 0.7 мг/мл и оставляли на 12 ч при 15°С. Затем в раствор вносили 1.0 М HCl до рН 8.0, выдерживали смесь 60 мин при 15°С и диализировали против буфера В, рН 8.0, содержавшего 50 мМ трис и 150 мМ NaCl, в течение ночи при 4°С. По завершении диализа получали препарат ренатурированного рПроХн Cer.

Зимоген активировали методом ступенчатого изменения рН. В образец рПроХн Cer, при постоянном перемешивании, вносили 2.0 М НCl до рН 3.0 и инкубировали его в течение 24 ч при комнатной температуре. После окончания инкубации рН образца доводили до 5.8, используя 0.5 М NaOH. В результате активации получали препарат рХн Cer.

Исследование биохимических свойств. Молокосвертывающую активность, общую ПА, ТС и зависимость продолжительности коагуляции от рН и концентрации хлорида кальция в коровьем молоке определяли по ранее опубликованным методикам [11, 12] с незначительными модификациями. Биохимические свойства рХн Cer сравнивали с коммерческими препаратами рХн Bos (сухая форма) и рХн Cam (жидкая форма) производства компании “Chr. Hansen” (Дания). Для проведения исследований готовили 0.5–1.0%‑ный водный раствор рХн Bos, а рХн Cam разбавляли дистиллированной водой в 80–100 раз. При определении биохимических свойств рХн Cer, рХн Bos и рХн Cam нормировали по МА. Исследование каждого биохимического параметра проводили дважды с интервалом 1–3 сут между сериями. Все измерения повторяли трижды.

Общая молокосвертывающая активность. В качестве стандарта использовали 0.5%-ный водный раствор сухого коммерческого препарата рХн Bos с заявленной активностью, равной 2235 IMCU/г. Для перевода значений IMCU (International Milk Clotting Units) в УЕ, использовали повышающий коэффициент 125. Субстратом служило сборное непастеризованное коровье молоко, в которое вносили NaN₃ до конечной концентрации 0.02% и доводили рН до 6.5. Субстрат (2.5 мл), прогретый на водяной бане при 35°С не менее 5 мин, быстро смешивали с 0.2 мл исследуемого рХн и регистрировали время образования первых хлопьев коагулята. Общую МА жидких препаратов рХн рассчитывали по формуле (1) и выражали в условных единицах на миллилитр (УЕ/мл).

МА_St – заявленная МА стандарта в условных единицах (УЕ/г);

200 – фактор разведения (мл/г);

Т₁ – время (с) свертывания субстрата стандартом;

Т₂ – время (с) свертывания субстрата раствором исследуемого фермента.

Удельная молокосвертывающая активность. Удельную МА (УЕ/мг белка) препарата рХн Cer рассчитывали после определения общей МА и концентрации белка. Для оценки удельной МА эталонных коммерческих препаратов готовили 1.0%-ный водный раствор рХн Bos, а жидкий препарат рХн Cam разбавляли в 100 раз дистиллированной водой. В полученных растворах определяли МА, концентрацию белка и рассчитывали удельную МА.

Общая протеолитическая активность и специфичность. В качестве субстрата использовали 1%‑ный раствор казеина по Гаммерстену в 20 мМ Na-фосфатном буфере, рН 5.6. Аликвоты субстрата (2.0 мл) выдерживали на водяной бане в течение 15 мин при 35°С, затем вносили в них раствор исследуемого МФ (0.5 мл), тщательно перемешивали и отмечали время начала инкубации. Через 30, 90 и 180 мин инкубации реакцию останавливали, добавляя к 2.5 мл фермент-субстратной смеси 2.5 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), тщательно перемешивали, оставляли на 30 мин при комнатной температуре и фильтровали через бумажный фильтр. В фильтрате определяли оптическую плотность при 280 нм (D₂₈₀). В качестве спектрофотометрического контроля использовали компоненты фермент-субстратной смеси которые вносили непосредственно в 5%‑ную ТХУ. Общую ПА выражали в единицах D₂₈₀. Для оценки специфичности препаратов рХн использовали ПА, за которую принимали значения D₂₈₀ образцов, после инкубации в течение 180 мин. Строили график зависимости D₂₈₀ от продолжительности инкубации. Специфичность определяли, как соотношение удельной МА и общей ПА (МА/ПА).

Термостабильность. Растворы исследуемых МФ прогревали в диапазоне 30–60°С в течение 30 мин, быстро охлаждали до комнатной температуры и определяли их остаточную МА. За 100% принимали значения МА, полученные для образцов, прогретых при 30°С. Строили график зависимости остаточной МА от Т (°С) прогревания.

Зависимость продолжительности коагуляции от рН молока. Субстратом служило сборное непастеризованное коровье молоко, в которое вносили NaN₃ до конечной концентрации 0.02%. Готовили субстрат с рН 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8 и 7.0 и определяли в них продолжительность образования сгустка, после внесения раствора исследуемого МФ. За 100% принимали продолжительность свертывания субстрата при рН 6.0. Строили график зависимости продолжительности коагуляции (%) от рН молока.

Зависимость продолжительности коагуляции от концентрации хлорида кальция. Субстратом служило сборное пастеризованное коровье молоко, в которое вносили NaN₃ до конечной концентрации 0.02% и доводили рН до 6.5. В субстрат добавляли CaCl₂ до конечной концентрации 1–5 мM и определяли продолжительность образования сгустка после внесения раствора исследуемого МФ. За 100% принимали значения, полученные на субстрате, в который не вносили CaCl₂. Строили график зависимости продолжительности коагуляции (%) от концентрации CaCl₂.

Другие методы. Продукцию рекомбинантного белка в клетках E. coli анализировали методом электрофореза по Лэммли [13]. В качестве маркеров молекулярных масс (ММ) использовали смеси белков “PageRuler™ Unstained Protein Ladder” (“Thermo Fisher Scitntific”, США) и М31 (“Сибэнзим”, Россия). Для определения на электрофореграммах площадей полос белковых компонентов и концентрации в них белка использовали программу GelAnalyzer 19.1. Для калибровки применяли препараты бычьего сывороточного альбумина (БСА) различной концентрации. Концентрацию белка в растворах, содержащих рПроХн и рХн, определяли по методу Брэдфорда [14].

Статистическую обработку полученных данных проводили в вычислительной среде табличного процессора Excel 2008 (“Microsoft Corporation”, США). Для количественных переменных результаты представляли в виде среднего арифметического (М) с указанием среднеквадратического отклонения (±SD). На графиках не указан 95%-ный доверительный интервал, поскольку его абсолютные значения были <10% от М.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение рХн марала. Для получения рХн могут использоваться системы экспрессии бактерий (E. coli), дрожжей (Pichia (Komagataella) pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces lactis), плесневых грибов (Aspergillus niger), а также высших млекопитающих и растений [1]. В настоящее время в производстве сыров официально применяются рХн Bos и рХн Cam, синтезируемые в эукариотических системах экспрессии высшего плесневого гриба A. niger var. awamori и молочных дрожжей K. lactis [1]. В то же время, для большого сегмента научно-исследовательских и скриннинговых работ, использование хорошо изученных и простых прокариотических систем экспрессии предпочтительнее и намного выгоднее, чем получение стабильных эукариотических продуцентов.

Система продукции рекомбинантных белков на основе E. coli позволяет получать за относительно короткий промежуток времени целевой продукт в количествах, достаточных для первичной биохимической характеристики. Ранее при помощи векторной системы pET21 в сочетании с E. coli штамм BL21(DE3) был получен эффективный продуцент рПроХн альпака [9]. Для продукции рПроХн Cer мы использовали другой штамм E. coli – SHaffle express, разработанный для обеспечения корректного формирования дисульфидных связей в рекомбинантных белках, синтезируемых de novo [15].

Нуклеотидная последовательность, соответствующая последовательности ПроХн марала (ПроХн Сer), с оптимизированным для экспрессии в системе E. coli кодонным составом, была клонирована в составе вектора pET21 в единой рамке трансляции с экспрессионным тагом Т7, представляющим лидерную последовательность (11 аминокислотных остатков) гена 10 бактериофага Т7 (рис. 1). Присутствие этой последовательности на N- или C-концевой части целевого рекомбинантного белка способно значительно повысить его выход [16].

Рис. 1.

Генетическая карта плазмидного вектора pET21-CYM-Cer: T7 promoter – промотор гена белка 10 фага Т7; T7 tag – лидерная последовательность гена 10 бактериофага Т7; Cer – последовательность ПроХн марала; T7 terminator – терминатор бактериофага Т7.

Зависимость эффективности продукции целевого белка от концентрации индуктора, температуры и продолжительности культивирования анализировали методом электрофореза (рис. 2). Наибольший выход рПроХн Cer наблюдался при концентрации ИПТГ, равной 10 мМ и культивировании продуцента при 25°С в течение 6 ч с момента внесения индуктора (рис. 2а, 6).

Рис. 2.

Электрофорез препаратов биомассы клеток, полученных при культивирования штамма-продуцента при 25 (а) или 37°С (б) и концентрации ИПТГ 0.1 (1, 4, 7), 1.0 (2, 5, 8), 10.0 (3, 6, 9) мМ; М – маркеры молекулярных масс. Рамкой обведены фракции с ММ, близкой к расчетной для рПроХн марала.

После подбора оптимальных условий продукции целевого фермента был исследован белковый состав биомассы, лизата и телец включения клеток продуцента (рис. 3). На долю протеина, концентрация которого составляла около 3 мг/мл, а ММ была близка к расчетной для рПроХн Cer (41 кДа), приходилось не менее 30% от общего количества белков биомассы (рис. 3, 1). Растворимая часть биомассы клеток E. coli, несущих плазмиду pET21а-Cer, почти не содержала целевой белок (рис. 3, 2), в то время как фракция телец включения более чем на 95% состояла из рПроХн Cer (рис. 3, 3). Это свидетельствовало о том, что подобранные условия экспрессии гена ПроХн Cer в системе E. coli обеспечивали эффективный синтез целевого белка и его накопление в тельцах включения.

Рис. 3.

Результаты электрофореза белковых препаратов, полученных из клеток штамма-продуцента: 1 – биомасса клеток продуцента; 2 – растворимая фракция биомассы после обработки буфером STET; 3 – нерастворимая фракция (тельца включения) после обработки лизирующим буфером; 4, 5, 6 – калибровочные препараты БСА, с нагрузкой 1, 2 и 3 мкг на трек соответственно; 7 – рХн марала, полученный после активации зимогена; М – маркеры молекулярных масс.

Препарат рХн Cer, полученный после рефолдинга и активации рПроХн, содержал лишь незначительное количество балластных белковых примесей (рис. 3, 7 ).

Молокосвертывающая активность. По общей МА рХн Cer незначительно уступал коммерческому рХн Bos (табл. 1). Для того, чтобы сравнить коагуляционную способность рХн Cer и коммерческих химозинов, была рассчитана удельная МА этих препаратов. По удельной МА рХн Cer уступал рХн Bos и рХн Cam на 36 и 104% соответственно. Можно предположить, что низкая удельная МА рХн Cer, по сравнению с эталонными коагулянтами молока обусловлена недостаточной эффективностью рефолдинга, поскольку восстановление корректной трехмерной структуры затруднено при получении рХн в системах экспрессии E. coli [10, 17–19],

Удельная МА рХн Cam в 1.68 раза превосходит удельную коагуляционную активность рХн Bos (табл. 1). Это хорошо согласовывалось с результатами работы [2], в которой было показано, что соотношение удельной МА рХн Bos и рХн Cam составляет 1 : 1.7.

Таким образом, полученный препарат рХн Cer оказался способным свертывать коровье молоко, но по удельной коагуляционной активности заметно уступал эталонным коммерческим МФ. Это означает, что при использовании в сыроделии его расход будет выше, чем у эталонных коагулянтов. При увеличении удельной МА рХн Cer в 1.6–2.6 раза, его дозировка для получения молочного сгустка может быть сопоставима с дозировками рХн Bos и рХн Cam.

Общая протеолитическая активность и специфичность. Для биохимической характеристики нового МФ крайне важна оценка его общей ПА. В сыроделии высокая ПА коагулянта молока считается негативным фактором, поскольку приводит к снижению выхода готовой продукции, способствует формированию пороков вкуса и консистенции сыра и ухудшает технологические характеристики подсырной сыворотки, используемой в качестве сырья при производстве ряда молочных продуктов [20].

Протеолитическую активность коагулянтов молока можно условно разделить на специфическую и неспецифическую. В результате специфической или молокосвертывающей активности происходит только гидролиз связи F105-M106 в молекуле κ-казеина. Протеолиз κ-казеинов по этому сайту дестабилизирует казеиновые мицеллы и приводит к образованию молочного сгустка. Неспецифическая или общая ПА, характеризует способность МФ гидролизовать любые пептидные связи за исключением связи F105-M106 κ-казеина. Соотношение МА и общей ПА (МА/ПА) называется специфичностью. Идеальный коагулянт молока для сыроделия должен обладать высокой специфичностью, то есть проявлять максимальную МА при минимальной общей ПА [21]. Чем выше специфичность, тем универсальнее МФ и шире ассортимент сыров, для выработки которых он может использоваться.

После инкубации с субстратом в течение 180 мин рХн Cer демонстрировал более высокую общую ПА, чем рХн Cam и рХн Bos (табл. 2).

Динамика накопления продуктов протеолиза рХн Cer оказалась похожей на динамику рХн Bos и заметно отличалась от рХн Cam (рис. 4а). Эти различия наблюдались уже через 30 мин инкубации. Если принять за 100% ПА рХн Bos, проявляемую в течение 180 мин инкубации, то ПА рХн Cer и рХн Cam составят ≈114 и ≈30% соответственно.

Рис. 4.

Результаты сравнительного изучения зависимостей общей протеолитической активности (D₂₈₀) от продолжительности инкубации (а), остаточной молокосвертывающей активности (МА, %) от температуры прогревания (б), продолжительности коагуляции молочного субстрата (%) от концентрации хлорида кальция (в) и рН (г); 1 – рХн марала, 2 – рХн коровы, 3 – рХн одногорбого верблюда.

Полученные низкие значения общей ПА характерны для рХн Cam и согласуются с данными работы [2], в которой показано, что рХн Cam обладает вчетверо меньшей ПА, чем рХн Bos. Ранее установлено, что общая ПА рХн близкого родственника одногорбого верблюда, альпака (Vicugna pacos), при одинаковой МА была примерно в 2.9 раза ниже, чем у рХн Bos [9]. По-видимому, низкая общая ПА и высокая специфичность характерны для химозинов представителей семейства Верблюдовые (Camelidae).

Для сравнения специфичности рХн Cer и эталонных рХн были использованы величины их удельной МА и общей ПА. При этом показатели рХн Bos принимали за 100%. Рассчитанная специфичность рХн Cer оказалась в 1.8 и 10.0 раза ниже, чем у рХн Bos и рХн Cam (табл. 3). Таким образом, по специфичности, а следовательно и по степени универсальности, исследованные ферменты располагались в следующей последовательности: рХн Cam > рХн Bos > рХн Cer.

Очевидно, что низкая специфичность рХн Cer являлась следствием его малой удельной МА, которая, в свою очередь, может быть обусловлена неполным рефолдингом. Следует отметить, что эффективность рефолдинга генно-инженерных химозинов, полученных после солюбилизации телец включения, в среднем редко превышает 30% [10, 17–19]. Можно предположить, что использование эукариотической системы экспрессии вместо E.coli (штамм SHaffle express) позволит повысить выход активного рХн Cer, а также его удельную МА и специфичность.

Литературные сведения о специфичности рХн Bos и рХн Cam носят противоречивый характер. Согласно работе [4], специфичность рХн Cam примерно на 11% ниже, чем у рХн Bos. А по данным работы [2], соотношение МА/ПА рХн Cam в 7 раз превосходит рХн Bos. Представления о более высокой специфичности рХн Cam по сравнению с рХн Bos, подтверждаются результатами изучения ПА этих ферментов непосредственно в сырах [22].

Таким образом, общая ПА полученного в данной работе рХн Cer оказалась выше, чем ПА рХн Bos и рХн Cam в 1.14 и 3.79 раза соответственно. Совокупность высокой ПА и малой удельной МА, обусловливает низкую специфичность рХн Cer. Это ограничивает его применение производством сыров с короткими сроками созревания и хранения. Для повышения специфичности и универсальности рХн Cer, требуется существенное увеличение его удельной МА. В случае ее повышения в 3–5 раз, рХн Cer сможет конкурировать по специфичности с одним из эталонных МФ – рХн Bos.

Термостабильность является важной характеристикой любого нового МФ, поскольку коагулянт с высоким порогом термоинактивации может проявлять нежелательную ПА на стадиях выработки сыров, связанных с повышением температуры нагревания, а также при длительном созревании и хранении готовой продукции. Активность химозинов, остающихся в сырном зерне после удаления сыворотки, вносит весомый вклад в “протеолитическое созревание” различных видов сыров, от мягких до сверхтвердых. Например, таких, как Camembert [23], Beyaz Peynir [24], Maasdam [25], Grana Padano [26], Parmigiano Reggiano [27, 28]. Используя информацию о диапазоне температурной устойчивости коагулянта молока можно регулировать степень протеолиза и сроки созревания сыров как путем варьирования температуры обработки сырного зерна, так и за счет применения МФ с различной ТС [25].

Согласно данным работы [2] общая ПА рХн Bos и рХн Cam увеличивалась при повышении температуры. Максимальную ПА рХн Cam проявлял при 55.0°С, а рХн Bos – при 52.5°С. При выработке сыров типа Reggianito с их применением увеличение температуры нагревания сгустка с 50 до 56°С приводило к значительному снижению концентрации продуктов протеолиза αs1-казеина. Но даже после повышения температуры второго нагревания до 56°С в созревающих и хранящихся сырах, выработанных с применением более термостабильного рХн Cam, интенсивность протеолиза была выше, чем при использовании рХн Bos. И это несмотря на то, что общая ПА рХн Cam в 3.5–4.0 раза ниже, чем у рХн Bos [2, 22].

Термостабильность рХн одного и того же вида, полученного в разных системах экспрессии, может различаться. Так, пороги полной температурной инактивации рХн Cam, экспрессированного в клетках высших плесневых грибах (A. niger) [2] и дрожжей (P. pastoris) [22], отличались на 10°С, что указывало на возможную роль посттрансляционных модификаций в формировании температурной устойчивости фермента.

Порогом термоинактивации считали Т (°С), при которой МФ сохранял не менее 80% от исходной коагуляционной активности. Согласно этому критерию порог ТС для рХн Bos составил 50°С, а для рХн Cer и рХн Cam – 55°С. Несмотря на одинаковый порог термоинактивации, ферменты марала и верблюда различались по динамике снижения МА в диапазоне температур 50–60°С (рис. 4б). После прогревания при 55°С коагуляционная активность рХн Cer оказалась в 3.5 раза выше, чем у рХн Cam. Это свидетельствовало о более высокой температурной стабильности рХн Cer по сравнению с рХн Cam. Следует также отметить, что эталонные химозины полностью инактивировались после прогревания при 60°С в то время, как рХн Cer при этой температуре еще сохранял примерно 8% от исходной МА (табл. 4).

В системе экспрессии E. coli (штамм BL21(DE3)), ранее были получены рХн альпака и рХн Bos, которые на 10–15°С превосходили по ТС контрольный коммерческий рХн Bos, продуцируемый в эукариотической системе A. niger var. awamori [9]. Можно предположить, что повышенная ТС рХн Cer также обусловлена особенностями посттрансляционного процессинга эукариотического фермента, синтезируемого в прокариотической системе экспрессии.

Таким образом, порог термоинактивации рХн Cer составил 55°С, что на 5°С превосходит данный показатель для рХн Bos. Несмотря на то, что порог термоинактивации рХн Cam и рХн Cer был одинаковым, скорость снижения МА верблюжьего фермента после прогревания при 55°С оказалась в 3.5 раза выше, чем у рХн Cer. Это позволяет считать рХн Cer более термостабильным. Повышенная, по сравнению с эталонными ферментами ТС ограничивает сферу применения рХн Cer и предполагает его использование, прежде всего, в производстве сыров с короткими сроками созревания и хранения.

Зависимость МА от концентрации хлорида кальция. Большинство видов сыров вырабатывается из пастеризованного молока. При высокотемпературной обработке необратимо осаждается часть присутствующих в молоке солей кальция. В результате этого концентрация ионизированного кальция снижается, что приводит к увеличению продолжительности образования молочного сгустка под действием МФ. Для того, чтобы избежать повышения дозы вносимого МФ и улучшить коагуляционную способность пастеризованного молока в него вносят ≈1–4 мM CaCl₂ [29].

Важно отметить, что увеличение концентрации CaCl₂ в молочном субстрате особенно на стадии свертывания молока вызывает повышение не только коагуляционной активности, но и общей ПА фермента [30]. Поэтому использование МФ с высокой чувствительностью к концентрации Ca²⁺ связано с опасностью негативных последствий увеличения его общей ПА. В связи с этим необходимо, чтобы любой новый коагулянт молока по чувствительности к концентрации Ca²⁺ был эквивалентен современным эталонным ферментам – рХн Bos и рХн Cam.

Все исследованные рХн увеличивали МА в ответ на повышение концентрации CaCl₂ в диапазоне 0–1 мМ, при этом время образования сгустка сокращалось на 40.5–44.8% (табл. 5). Однако на дальнейшее повышение концентрации CaCl₂ ферменты реагировали по-разному. Наиболее чувствительным к увеличению содержания Са²⁺ в молоке оказался рХн Bos. При повышении концентрации хлорида кальция с 2 до 5 мМ его МА увеличивалась в 2.5–4.5 раза. Коагуляционная активность рХн Cer и рХн Cam в меньшей степени зависела от нарастания концентрации СaCl₂. По чувствительности к изменениям концентрации ионов кальция в молоке оба фермента оказались похожими (рис. 4в). В диапазоне 2–5 мМ CaCl₂ продолжительность образования молочных сгустков при действии рХн Cer и рХн Cam сокращалась в 2.0–3.1 раза.

Полученные данные, позволили сделать вывод о том, что по чувствительности коагуляционной активности к концентрации CaCl₂ в молоке рХн Cer не уступает эталонным генно-инженерным коагулянтам и полностью соответствует требованиям сыроделия.

Зависимость МА от рН субстрата. Продолжительность коагуляции молока под действием МФ зависит от электростатических и гидрофобных свойств мицелл казеина, которые связаны с концентрацией ионов водорода. При подкислении молока суммарный отрицательный заряд казеинов снижается, вследствие приближения рН к значениям их рI. Это уменьшает силы электростатического отталкивания между мицеллами и одновременно усиливает казеин-казеиновые гидрофобные взаимодействия, что способствует ускорению образования молочного сгустка [21]. В случае нарастания рН казеин-казеиновые гидрофобные взаимодействия ослабевают, поскольку суммарные отрицательные заряды казеинов увеличиваются. Растущие силы электростатического отталкивания препятствуют сближению одноименно заряженных казеиновых мицелл и замедляют образование сычужного сгустка.

Оптимумы действия химозинов различных видов животных находятся в диапазоне рН 4.5–5.5 [http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.23.4]. Однако при выработке большинства видов сычужных сыров МФ вносится в молочную смесь при рН 6.5–6.6. В связи с этим, одним из требований к любому новому МФ для сыроделия является способность эффективно коагулировать молоко в слабокислом диапазоне рН, удаленном от рН-оптимума.

Наименьшую чувствительность к увеличению рН молока в диапазоне 6.0–7.0 продемонстрировал рХн Cer, а наибольшую – рХн Bos (рис. 4г). В диапазоне рН 6.0–6.4 все ферменты проявляли близкую МА. При рН 6.6 продолжительность свертывания молока для рХн Cer, рХн Cam и рХн Bos увеличивалась в 1.9, 2.1 и 2.3 раза соответственно (табл. 6). Полученные результаты согласуются с данными других публикаций, в которых были показаны аналогичные зависимости продолжительности свертывания от рН молочного субстрата для рХн Bos, рХн Cam и рХн альпака [2, 4, 9, 30].

Результаты исследования свидетельствуют о том, что рХн марала способен эффективно свертывать коровье молоко при рН 6.5–6.6 и не уступает по этому показателю коммерческим генно-инженерным химозинам.

Таким образом, в прокариотической системе экспрессии E.coli (штамм SHaffle express) получен рХн Cer. Оптимальными условиями для достижения максимального выхода рПроХн Cer в тельцах включения были: концентрация изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида, равная 10 мМ, температура культивирования продуцента – 25°С и продолжительность культивирования – 6 ч с момента внесения индуктора.

Исследован комплекс биохимических свойств рХн Cer, важных для использования при производстве сычужных сыров. По чувствительности МА к изменениям рН и концентрации хлорида кальция в молоке, рХн Cer оказался сопоставимым с эталонными МФ и по данным показателям полностью соответствует требованиям сыроделия. По удельной МА, общей ПА, специфичности и ТС рХн Cer уступает коммерческим эталонным ферментам, что ограничивает его применение производством сыров с короткими сроками созревания и хранения. Можно предположить, что продукция рХн Cer в эукариотической системе, не требующей проведения рефолдинга целевого белка и обеспечивающей качественно иной уровень посттрансляционной модификации, позволит в дальнейшем улучшить его биохимические показатели, важные с точки зрения современного сыроделия и расширить область его применения.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ (номер темы FZMW-2020-0002, “Разработка продуцентов рекомбинантных ферментов для сыроделия”).