Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 3, стр. 301-308

МЕТОДИКА

В работе анализировали водный экстракт из личинок U. dermestoides старшего возраста, длиной более 1 мм, выращенных в искусственных контролируемых условиях на сухих кормовых субстратах (смеси геркулеса и кукурузной муки). После отделения жуков или личинок от кормового субстрата просеиванием через сито с ячейкой диаметром 1.0 мм биомассу промывали, замораживали, затем гомогенизировали растиранием в холодной дистиллированной воде в холодной ступке холодным пестиком (1 : 15 вес/об.) и экстрагировали на холоду 2 сут при медленном перемешивании. Экстракты фильтровали через капроновую марлю для отделения твердых частиц и мембранный фильтр Миллипор (“Merck”, Германия) с диаметром пор 0.1 мкм для антибактериальной обработки. Хранили экстракты при –18°С.

Протеомный анализ. Для проведения исследования применяли метод протеомного анализа, который описан в работе [8], основанный на одномерном электрофоретическом разделении белков, их трипсинолизе в геле и последующей хромато-масс-спектрометрии. После разделения белков методом электрофореза в ПАГ с SDS полученную белковую дорожку разрезали на 6 фрагментов и проводили гидролиз белков трипсином в геле каждого фрагмента. Полученные пептиды анализировали при помощи ВЭЖХ-МС\МС. Поскольку геном U. dermestoides полностью не расшифрован, идентификацию белков проводили с использованием базы данных последовательностей близкородственного организма Tribolium castaneum (red flour beetle).

Образец водного экстракта размораживали в течение 30 мин на водяной бане при температуре 25°С. Денатурирующий одномерный электрофорез проводили в присутствии SDS с концентрацией полиакриламида от 8 до 12% в разделяющем геле и 5% в концентрирующем геле [9]. Образец в объеме 2, 5 и 10 мкл наносили на дорожку и проводили электрофорез 60 мин при постоянном токе (18 мА). В этом случае напряжение первые 10 мин было 50 V, а с 11 до 60 мин с увеличением до 200 V. Гели фиксировали раствором уксусной кислоты и этанола (2 раза по 20 мин), а затем в течение 1 ч окрашивали раствором Кумасси и отмывали в течение ночи. Белковую полосу, соответствующую объему 10 мкл образца, разрезали на 6 приблизительно равных фрагментов. Фрагменты геля промывали 2 раза по 15 мин 100 мкл 50 мМ раствора бикарбоната аммония, затем высушивали 100% ацетонитрилом (15 мин), после чего раствор удаляли, а полученные образцы досушивали на центрифужном вакуумном испарителе Concentrator Plus (“Eppendorf”, Германия). Для гидролиза белков к каждому из 6 образцов добавляли по 50 мкл 50 мМ ТЭАБ (pH 8.5) и по 10 мкл трипсина (“Promega”, США) в концентрации 0.2 мг/мл. Смесь инкубировали в течение ночи при температуре 37°C при встряхивании 350 об./мин. Реакцию останавливали раствором 0.7%-ной трифторуксусной кислоты с последующей экстракцией 70%-ным ацетонитрилом в 0.1%-ной муравьиной кислоте. Фильтрат высушивали в вакуумном концентраторе и растворяли в 20 мкл 0.1%-ной муравьиной кислоты для последующего масс-спектрометрического анализа.

Хромато-масс-спектрометрический анализ. Анализ пептидов осуществляли с использованием ВЭЖХ системы Ultimate 3000 RSLCnano (“Thermo Scientific”, США) с масс-спектрометром Q-exactive HFX (“Thermo Scientific”, США). Смесь пептидов (1 мкл) наносили на обогащающую колонку Acclaim µ-Precolumn (0.5 × 3 мм, размер частиц 5 мкм, “Thermo Scientific”) при скорости потока 10 мкл/мин в течение 4 мин в изографическом режиме с использованием буфера “С” (2%-ный ацетонитрил, 0.1%-ная муравьиная кислот в деионизованной воде) в качестве подвижной фазы. Далее пептиды разделяли на ВЭЖХ колонке Acclaim Pepmap® C18 (75 мкм × 150 мм, размер частиц – 2 мкм, “Thermo Scientific”) в градиентном режиме элюирования. Градиент формировали подвижной фазой А (0.1%-ная муравьиная кислота) и Б (80%-ный ацетонитрил, 0.1%-ный водный раствор муравьиной кислоты) при скорости потока 0.3 мкл/мин. Колонку промывали 2%-ной подвижной фазой Б в течение 10 мин, после чего линейно увеличивали ее концентрацию до 35% за 43 мин, а затем до 99% за 2 мин, после 2-минутной промывки при 99%-ным буфером Б, его концентрацию линейно снижали до исходных 2% за 3 мин. Общая длительность анализа составляла 60 мин. Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре Q-Exactive HFX в режиме положительной ионизации с использование источника NESI (“Thermo Scientific”, США). Для масс-спектрометрического анализа были установлены следующие параметры настроек: напряжение на эмиттере 2.1 кВ, температура капилляра 240°C. Панорамное сканирование проводили в диапазоне масс от 300 до 1500 m/z при разрешении 120 000. При тандемном сканировании разрешение устанавливали 15 000 в диапазоне масс от 100 m/z до верхней границы, которая определялась автоматически исходя из массы прекурсора, но не более 2000 m/z. Изоляцию прекурсорных ионов проводили в окне ±1 Да. Максимальное число разрешённых для изоляции ионов в режиме MS2 было установлено как не более 40, при этом граница отсечения для выбора прекурсора для тандемного анализа бала установлена как 50 000 единиц, а нормализованная энергия соударения (NCE) равнялась 29. Для тандемного сканирования учитывали только ионы от z = 2+ до z = 6+ по зарядному состоянию. Максимальное время накопления для прекурсорных ионов составило 50 мс, для фрагментных ионов 110 мс. Величину AGC для прекурсоров и фрагментных ионов устанавливали 1*106 и 2*105, соответственно. Все измеренные прекурсоры динамически исключались из тандемного MS/MS анализа на 90 с.

Идентификация белков. Идентификацию белков экстракта личинок U. dermestoides проводили при помощи программы MaxQuant v.1.6.3.4 с использованием поискового алгоритма Andromeda [10], объединяя спектры, полученные для шести фрагментов геля. Для идентификации белков по гомологии использовали базу данных Uniprot c ограничением по видовой принадлежности близкородственного организма – Tribolium castaneum.

Были заданы следующие поисковые параметры: расщепляющий фермент – трипсин, точность определения масс моноизотопных пептидов ±5 ppm, точность определения масс в спектрах MS/MS ± ± 0.01 Да и возможность пропуска двух сайтов расщепления трипсином. Окисление метионинов, N-концевое ацетилирование белка и модификация цистеина пропионамидом были учтены как возможные модификации пептидов. Для валидации сопоставлений (образования пар) спектров и пептидов PSM (Peptide-Spectrum Matches), идентификации пептидов и идентификации белков использовали величину FDR (False Discovery Rate) не более 1.0%. Белки рассматривались в качестве достоверно идентифицированных, если для них было обнаружено, по крайней мере, два пептида. Безметковая количественная оценка содержания белков происходила на основе iBAQ (абсолютная количественная оценка на основе интенсивности).

Функциональный анализ белков экстракта. Анализ белков экстракта личинок проводили с использованием веб-ресурса DAVID [11], загружая в качестве исходных данных все идентифицированные белки, за исключением контаминантов. Рассматривались только статистически значимые гипотезы. Для оценки статистической значимости распределения белков по группам Gene Ontology (GO) в отношении молекулярных функций применяли величину (p-value <0.05) с поправкой на множественность сравнения Беньямини.

Антиоксидантные свойства экстракта. Предварительно в экстракте определяли содержание белка микробиуретовым методом с использованием двухлучевого спектрофотометра “Shimadzu”RF 5301PC (Япония) [12]. Каталазную активность анализировали спектрофотометрическим методом, измеряя убыль концентрации пероксида водорода по поглощению комплекса пероксида водорода с молибдатом [13].

Антиоксидантную активность (АОА) оценивали по тушению хемилюминесценции люминола. Кинетику хемилюминесценции регистрировали на спектрофлуориметре “Shimadzu”RF 5301PC (Япония) при длине волны люминесценции 470 нм при комнатной температуре.

Для количественной оценки способности экстракта личинки жука взаимодействовать с радикалами, локализованными в водной фазе модельной системы, результаты тушения хемилюминесценции пересчитывали в координатах зависимости латентного периода от концентрации белка в экстракте, а также по уменьшению амплитуды хемилюминесценции в присутствии экстракта. В последнем случае измеряли интенсивность хемилюминесценции в контроле, где экстракт был заменен чистым буферным раствором (I0), и в опытных образцах с различным содержанием экстракта (I), с последующим пересчетом в координатах зависимости величины (I0/I – 1) от концентрации белка в экстракте. Полученные зависимости сравнивали с зависимостями амплитуды и латентного периода хемилюминесценции в присутствии тролокса (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid) – водорастворимого синтетического аналога природного антиоксиданта витамина Е.

Среда для инкубации содержала: 0.05 М К-фосфатный буфер, рН 7.4, 2.0 мкМ гемоглобин, 100 мкМ люминол, 100 мкМ ЭДТА и различные количества экстрактов личинки жука (от 10 до 150 мкл). Реакцию начинали добавлением 100 мкМ пероксида водорода. В качестве контроля использовали буферный раствор вместо экстракта. Результаты сравнивали с действием тролокса, измеряя в тех же условиях зависимость амплитуды хемилюминесценции от концентрации тролокса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для анализа белкового состава водного экстракта из личинок U. dermestoides проводили одномерный электрофорез. На рис. 1а представлен гель после проведения электрофореза образца экстракта разных объемов 2, 5 и 10 мкл и схема разрезания дорожки, на которую нанесено 10 мкл, на 6 фрагментов геля для дальнейшего масс-спектрометрического анализа. Фрагменты геля вырезали из середины соответствующей белковой дорожки шириной около 2 мм и длиной около 10–12 мм, как схематично показано на рис. 1б.

Рис. 1.

Гель-электрофорез в ПААГ (а) экстракта личинок, нанесенного в разных количествах: 2 (1), 5 (2) и 10 (3) мкл; схема разделения белковой дорожки на 6 фрагментов геля для дальнейшего масс-спектрометрического анализа (б).

После гидролиза трипсином в геле получали смеси пептидов для последующего ВЭЖХ-МС/МС-анализа. Для каждого вырезанного фрагмента анализ повторяли не менее двух раз. Последующую идентификацию белков экстракта проводили, объединяя все полученные спектры для 6 фрагментов геля в одном поиске. Поиск проводили по гомологии при помощи программы MaxQuant с использованием базы данных близкородственного организма. В результате масс-спектрометрического анализа в экстракте было обнаружено 169 белков и белковых групп, из которых достоверно идентифицировано 104 белка исследуемого организма, гомологичных белкам Tribolium castaneum. Содержание белков в экстракте оценивали при помощи эмпирического показателя iBAQ. Процентное содержание определенного белка рассчитывали, как отношение величины iBAQ белка к сумме всех величин iBAQ для всех идентифицированных белков, умноженное на 100%.

В составе идентифицированных белков в образце экстракта личинки U. dermestoides наиболее представленными были три белка – tr|D6WHK2|D6WHK2_TRICA Nucleoside diphosphate kinase (11.1%), tr|D6WVZ4|D6WVZ4_TRICA Cytochrome c-2-like Protein (13.5%) и tr|D6WB91|D6WB91_TRICA Calmodulin (62%). Другие идентифицированные по гомологии белки, имеющие интерес для оценки биологической активности экстракта, представлены в табл. 1. Их суммарное содержание составило 13.4%.

В результате проведенной функциональной аннотации идентифицированных белков экстракта в терминах GO в отношении молекулярных функций была выявлена статистически значимая группа из пяти белков, обладающих антиоксидантной активностью: A0A139WLA9 (D6X4D1), D6WWA9, D2A3X3, D2A2T2, D6W9X8. Эти белки выделены в табл. 1 жирным шрифтом.

Результаты оценки антиоксидантной активности представлены на рис. 2 и 3. Каталазная активность экстракта личинок составляла 6.3 ± 1.1 мкмоль перекиси/мин мг белка.

Рис. 2.

Характерная кинетика возгорания и тушения хемилюминесценции люминола: 1 – экстракт личинки, 2 – тролокс.

Рис. 3.

Интенсивность АОА экстракта личинки в зависимости от содержания белка в экстракте.

По антиоксидантной активности 1 мг/мл белка личинок в экстракте был эквивалентен 1.36 ± 0.3 мМ тролокса. Этот результат ниже, чем АОА метанольного экстракта из жука U. dermestoides [4], которая составляла 3.65 ± 0.5 эквивалента тролокса. Возможно, это связано с различиями в методике экстракции (водная или метанольная), не исключено также, что при мембранной фильтрации для антибактериальной обработки, были адсорбированы и некоторые активные компоненты.

Проведенный протеомный анализ водного экстракта личинок Ulomoides dermestoides показал присутствие широкого спектра белков, обладающих биологической активностью и использующихся в качестве лекарственных средств. Основной белок в экстракте – кальмодулин, на долю которого приходится 62% от всех выделенных белков. Это кальций-связывающий белок, обнаруживается в цитоплазме всех эукариотических клеток. Кальмодулин является универсальным регулятором многих процессов в клетке, инициирует клеточную активность. Он влияет на такие важные процессы, как воспаление, апоптоз, сокращения гладких мышц, внутриклеточный транспорт, краткосрочная и долговременная память и иммунный ответ [14, 15].

Остальные 40% протеомного экстракта практически в равных частях составляли Цитохром с-2, нуклеозиддифосфаткиназа и смесь антиоксидантных ферментов, биологически активных белков теплового шока и хитиназ.

Цитохром с-2 относится к семейству Цитохром с-типа и является гемо-содержащим белком. Выполняет важную роль при нарушениях окислительного фосфорилирования и дыхания, ингибирует перекисное окисление липидов [16]. Применяется при лечении сердечной недостаточности, рахита, анемии; восстанавливает иммунологическую активность нейтрофилов крови.

Нуклеозиддифосфаткиназа – фермент, катализирующий реакции синтеза различных нуклеозидтрифосфатов из АТФ и соответствующих нуклеозиддифосфатов, участвует в регуляции процессов подвижности клеток, злокачественного роста, апоптоза. Является универсальным регулятором внутриклеточных процессов [17].

В экстракте личинок выявлено присутствие белков, обладающих антиоксидазной активностью (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатион S-трансфераза, пероксиредоксин, тиоредоксин), то есть основных компонентов системы, обеспечивающей антирадикальную защиту организма. Это подтвердилось антиоксидантной активностью экстракта. Относительно небольшое содержание каталазы (0.2%) в экстракте соответствовало низкой каталазной активности. Тем не менее, получена довольно высокая АОА экстракта при сравнении с активностью тролокса, что можно объяснить суммарной активностью супероксиддисмутазы, глутатионтрансферазы, пероксиредоксина и других идентифицированных в экстракте антиоксидантов.

Белки теплового шока вырабатываются клетками при стрессовых условиях в ответ на температурное воздействие, их считают белками стресса [18]. Однако белки теплового шока, такие, как hsp70, участвуют в поддержании иммунитета [19], а также играют важную роль в развитии на эмбриональных или ювенильных стадиях млекопитающих, костистых рыб и некоторых низших позвоночных [20]. Поскольку объектом настоящих исследований являлись личинки старшего возраста перед окукливанием, которые развивались в строго регламентированных условиях, обеспечивающих комфортные условия жизнедеятельности насекомых при отсутствии стресса, можно предположить, что обнаружение белков теплового шока в личинках не связано со стрессом, а служит скорее всего для обеспечения функциональной активности иммунитета.

Присутствие хитиназ является характерным признаком личинок с хитиновой наружной оболочкой, можно предположить, что это связано с периодическими линьками личинок. Личинки до образования куколок проходят несколько стадий линек. Сброшенные личинками хитиновые оболочки скапливаются на поверхности субстрата, и могут вторично использоваться личинками в процессе пищеварении за счет активности хитиназ. Хитиназы могут быть также необходимы личинкам для морфогенеза экзоскелета и/или защиты от патогенных грибов [21].

В целом можно отметить, что идентификация в водном экстракте личинок Ulomoides dermestoides уникального комплекса белков с потенциальной биологической активностью (регуляторными, антиоксидантными, иммуноактивными и противоинфекционными свойствами) открывает перспективы для практического использования экстракта.

Работа одобрена Комиссией по этике ИПЭЭ РАН №56 от 22.03.2022.

Авторы выражают благодарность Р.Л. Илиеву за консультации и ООО Натурбион за участие в получении биомассы личинок.

Протеомный анализ экстракта выполнен с использованием оборудования ЦКП “Протеом человека” ИБМХ.