Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 3, стр. 289-294

МЕТОДИКА

Установка для биобаллистики. Для проведения биобаллистической трансформации эксплантов N. tabacum использовали генную пушку “PDS-1000/He Hepta System”, 450–2200 кПА (“Bio-Rad”, США) [3–5].

Плазмидная ДНК. В работе использовали плазмиду pHBT95::sGFP(S65T)-NOS [6], которая была любезно предоставлена Лабораторией стрессоустойчивости растений ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (Россия).

Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (“Thermo Scientific”, Литва) в соответствии с указанным в инструкции производителя протоколом. После выделения на спин-колонках плазмиды переосаждали 80%-ным этанолом или ПЭГ/MgCl₂ (10% PEG 6000: MgCl₂ 10 мM) [7].

Растительный материал. Растения табака N. tabacum выращивали в климатической камере in vitro. Для этого семена табака стерилизовали промыванием в 75%-ном этаноле, далее выдерживали в 2%-ном растворе гипохлорита натрия в течение 3 мин и троекратно промывали стерильной дистиллированной водой. Семена проращивали в чашках Петри в стерильных условиях на агаризованной среде Мурасиге–Скуга (МС). После прорастания растения переносили в индивидуальные контейнеры с агаризованной средой МС и выращивали в течение 6 недель в климатической камере при температуре воздуха 21°C с 16-часовым фотопериодом.

Для проведения каждого эксперимента использовали растения 6-недельного возраста, от каждого растения отбирали как молодые, так и старые листья. Перед биобаллистической обработкой контейнеры открывали в ламинарном боксе и скальпелем отрезали выбранные листья в стерильных условиях. Экспланты помещали на чашки Петри с агаризованной средой МС и переносили к месту проведения эксперимента.

Биобаллистическая трансформация. Подготовку микрочастиц для биобаллистики, подготовку оборудования к обстрелу и нанесение ДНК на микрочастицы осуществляли как описано в технической документации производителя (PDS-1000/He Biolistic Delivery System, Instruction Manual), составленной по данным исследований Сэнфорда и Гордона–Камма [8, 9], и с учетом поставленной в исследовании задачи.

Навеску микрочастиц массой 30 мг помещали в пробирку объемом 1.5 мл и после добавления 1 мл 70%-ного этанола интенсивно перемешивали в течение 3–5 мин с использованием мини-центрифуги вортекс при скорости 2800 g (BioSan Combi-Spin FVL-2400n, Латвия), затем отстаивали 15 мин для осаждения и удаляли супернатант после центрифугирования (в течение 5 с на вортексе). Осажденные частицы трижды промывали стерильной дистиллированной водой (объемом по 1.0 мл), каждый раз перемешивая и отстаивая в течение 1 мин. Осажденные частицы суспендировали в 500 мкл стерильного 50%-ного глицерина, а затем распределяли в пробирки (объемом 1.5 мл) по 50 мкл суспензии частиц, обеспечивая их равномерное распределение за счет периодического вортексирования.

Основная задача подготовки оборудования к работе состояла в обеспечении стерильности всех деталей генной пушки. Стерилизацию экрана, останавливающего мембраны при выстреле (Stopping screen), а также ряда деталей, в частности: держателя прорывающейся мембраны (Rapture Disk Retaining Cap); держателя макроносителей, на который нанесены микрочастицы для стрельбы (Macrocarrier holder), вместе с помещенными в него макроносителями, – осуществляли автоклавированием обернутых в фольгу деталей. Полочку для установки образца и камеру для стрельбы стерилизовали 70% этанолом, а прорывающую мембрану – быстрым погружением в 70%-ный изопропанол непосредственно перед установкой в генную пушку.

Рис. 1.

Изображение успешно трансформированных клеток N. tabacum с транзиентной экспрессией гена GFP, pHBT95::sGFP(S65T)-NOS, фильтр GFP Plant, давление 1350 (а), 1100 psi (б). Увеличение ×5.

Для одного семизарядного выстрела наносили выделенную плазмидную ДНК на подготовленные микрочастицы следующим образом. К суспензии микрочастиц (50 мкл) добавляли 5 мкл ДНК (в концентрации 1.0 мкг/мкл), 50 мкл CaCl₂ (2.5 М), перемешивали 2–3 мин, отстаивали при комнатной температуре (1 мин) и центрифугировали (2 с). Полученные микрочастицы затем последовательно обрабатывали 70%-ным суперчистым этанолом (140 мкл) и после центрифугирования отбирали супернатант, который обрабатывали 100%-ным суперчистым этанолом (140 мкл), центрифугировали и отбирали супернатант. Полученные микрочастицы с осажденной на них ДНК ресуспендировали в 100%-ном этаноле (48 мкл) и наносили на мембраны макроносителей, помещенные в держателе. Держатель на стерильной фильтровальной бумаге предварительно помещали на абсолютно сухой CaCl₂ для обеспечения высыхания суспензии после нанесения. На каждый макроноситель наносили по 6 мкл подготовленных микрочастиц, с нанесенной на них плазмидной ДНК, и распределяли по площади 1 см² в центре макроносителя. Пипетирование проводили максимально быстро, чтобы не допустить осаждения микрочастиц. Процесс нанесения частиц проводили в ламинарном боксе для обеспечения стерильности.

Во всех экспериментах концентрация плазмидной ДНК составляла 1000 нг/мкл, расстояние от мембран с микрочастицами до растительного материала 9 см. В работе использовались микрочастицы вольфрама следующих размеров: 0.7, 1.1, 1.3, 1.7 мкм. В экспериментах по изучению влияния величины давления и метода очистки плазмидной ДНК в качестве носителя использовались вольфрамовые частицы диаметром 1.3 мкм.

Микроскопирование образца проводилось через 4 дня после обстрела с помощью Leica MZ FL III Fluorescence Stereo Microscope (“Leica Microsystems”, Германия) под наборами фильтров GFP Plant – возбуждение флуоресценции длиной волны 470, наблюдение в диапазоне 40 нм, и GFP2 – возбуждение флуоресценции длиной волны 425, наблюдение в диапазоне 60 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние величины давления на эффективность трансформации. Плазмидная ДНК несущая ген, кодирующий GFP, была предварительно очищена методом переосаждения этанолом. В эксперименте использовали два варианта величины давления гелия на разрывную мембрану: 1350 и 1100 psi, контрольный вариант опыта (стрельба “пустыми” микрочастицами, без плазмидной днк) проводился при давлении 1350 psi.

Чтобы сравнить результаты стрельбы, мы сделали по 10 снимков каждого образца на увеличении ×5 и посчитали количество трансформированных клеток, попавших в поле зрения.

В результате трансформации листовых эксплантов N. tabacum на третий день наблюдали наибольшее количество трансформированных клеток в варианте с давлением 1350 psi. Исходя из полученных результатов (табл. 1, рис. 1), давление 1350 psi было наиболее подходящим для трансформации эксплантов N. tabacum с использованием Bio-Rad PDS-1000/He, хотя давление 1550 psi также приводило к удовлетворительным результатам.

Рис. 2.

Изображение успешно трансформированных клеток N. tabacum с транзиентной экспрессией гена GFP в эксперименте по определению оптимального давления выстрела, pHBT95::sGFP(S65T)-NOS, фильтр GFP Plant, давление 1350 psi, этанол (а), 1350 psi, PEG, MgCl₂ и этанол (б), 1550 psi, этанол (в), 1550 psi, PEG, MgCl₂ и этанол (г). Увеличение ×5.

Влияние давления и метода очистки на эффективность трансформации. Экспланты N. tabacum подвергали бомбардировке при 1350 и 1550 psi частицами, покрытыми ДНК, очищенной с использованием переосаждения этанолом или PEG/MgCl₂ и переосаждения этанолом (табл. 2, рис. 3).

Рис. 3.

Изображение успешно трансформированных клеток N. tabacum с транзиентной экспрессией гена GFP в эксперименте по определению оптимального размера микрочастиц вольфрама, pHBT95::sGFP(S65T)-NOS, фильтр GFP Plant, размер частиц 0.7 (а), 1.1 (б), 1.3 (в), 1.7 мкм (г). Увеличение ×5.

Результаты показали, что использование ДНК, очищенной переосаждением этанолом, дает большее количество успешно трансформированных клеток по сравнению с PEG/MgCl₂ с последующим переосаждением этанолом.

Эффективность трансформации в зависимости от размера частиц. Далее исследовали влияние размера микрочастиц (вольфрама) на трансформацию эксплантов N. tabacum с использованием давления 1350 psi и повторного осаждения ДНК этанолом, а также с использованием микрочастиц вольфрама следующих размеров: 0.7, 1.1, 1.3, 1.7 мкм.

Результаты показали, что оптимальный размер микрочастиц вольфрама для трансформации N. tabacum составлял 1.3 мкм (табл. 3, рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Опубликовано значительное количество работ, описывающих отработку протокола биобаллистической трансформации для различных видов растений [3–5]. Большинство экспериментов было проведено с использованием генной пушки PDS-1000, Bio-Rad. Можно привести пример работы, в которой в 1996 г. с помощью биобаллистического метода была трансформирована клеточная культура риса Pusa basmati для придания культуре устойчивости к гербициду. Кроме того, была использована система детекции успешности трансформации GUS [3]. Обстрел производился при давлении 1500 psi микрочастицами размером около 1 мкм, а параметры, такие как материал частиц (золото и вольфрам), расстояние до поверхности эксплантов (9 и 12 см), менялись для подбора оптимальных. В результате опытов оптимальным было признано использование золотых частиц, эффективность которых была в 2.5–5.4 раз больше, чем у вольфрамовых, и расстояние от макроносителей до трансформируемого образца – 9 см [3].

При величине давления, используемого в упомянутом исследовании (1550 psi), в настоящей работе также были получены неплохие результаты, однако для растения N. tabacum оптимальным оказалось давление 1350 psi. В исследовании было также выбрано расстояние до эксплантов 9 см, так как при меньшем расстоянии микрочастицы не распределялись равномерно по обстреливаемой площади. Оптимальный размер частиц для трансформации N. tabacum оказался больше, чем для риса P. basmati.

В более позднем исследовании эмбрионы пшеницы Triticum aestivum L. трансформировали системами, содержащими кодирующие репортерные гены GUS и GFP. Были испытаны частицы золота размером 0.4–1.2 мкм и давление в установке 450, 650, 950 и 1100 psi, обстрел производился на расстоянии 9 см. Давления 650 и 950 psi представлялись исследователями как оптимальные для трансформации незрелых зародышей пшеницы. Оптимальный размер частиц золота составлял 0.6 мкм [4].

При исследовании биобаллистической трансформации Triticum aestivum [5] авторы определяли, какой метод нанесения ДНК на микрочастицы более эффективен – PEG/Mg²⁺ или Spd/Ca²⁺ (с использованием спермидина). Обработка также проводилась золотыми частицами размером 0.6 микрона с расстояния 6 см при давлении 900 psi. Использование PEG/Mg²⁺ было более эффективным, но результаты трансформации с помощью Spd/Ca²⁺ сильно различались в зависимости от количества спермидина.

В одной из последних работ изучалась трансформация перца Capsicum frutescens L. плазмидой с системой детекции, основанной на экспрессии белка GFP (Green Fluorescent Protein). Бомбардировку проводили микрочастицами золота 0.6, 1.0 и 1.6 мкм на расстоянии 3, 6 и 9 см от макроносителей до эксплантатов при 900, 1100 и 1350 psi. По результатам исследований оптимальное сочетание параметров было установлено для стрельбы с расстояния 6 см частицами размером 1.6 мкм при давлении 1350 psi [10].

В отличие от исследований оптимальных параметров протокола биобаллистической трансформации для различных растений, которые были проведены ранее, в настоящем исследовании для доставки генетического материала в клетку использовались только вольфрамовые микрочастицы. В связи с трудностями доставки золотых частиц, вольфрамовые микрочастицы оказались более доступными и экономически выгодными носителями плазмидной ДНК для трансформирования растений.

Также в работе использовалась система детекции на основе временной экспрессии белка GFP с плазмидой pHBT95::sGFP(S65T)-NOS. Использование этой конструкции позволило фиксировать результаты трансформации через 4 дня после проведения обработки без необходимости извлекать растение из стерильных условий. Такой подход ускоряет работу с трансформированными эксплантами и анализ результатов, а, кроме того, позволяет проводить обстрел целых растений в условиях in vitro, предотвращая их гибель и позволяя проводить дальнейшие наблюдения за их развитием.

***

Биобаллистическая трансформация растений – перспективное направление генной инженерии, значительно расширяющее возможности исследований, т. к. позволяет трансформировать растения, не поддающиеся классической агробактериальной трансформации.

Экспериментально подтверждено, что оптимальные параметры биобаллистической трансформации на установке “PDS-1000/He Hepta System” для модельного растения N. tabacum следующие: давление – 1350 psi, расстояние от макроносителей до образца – 9 см, размер вольфрамовых микрочастиц – 1.3 мкм, очистка после выделения на спин-колонках – переосаждение этанолом.

Полученные результаты будут использованы для дальнейшей отработки методики биобаллистической трансформации модельного растения N. tabacum, а также других видов растений. В дальнейшем планируется проведение экспериментов по расширению перечня носителей и трансформированных видов растений, особенно, культур сельскохозяйственного значения, что позволит реализовать разработанный протокол в фундаментальных и прикладных исследованиях.

Авторы выражают благодарность Лаборатории стрессоустойчивости растений ВНИИ Сельскохозяйственной биотехнологии (Россия) за предоставленную плазмиду pHBT95::sGFP(S65T)-NOS.