Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 3, стр. 275-280

МЕТОДИКА

В работе использовали бактерии R. leguminosarum bv. viciae – эффективный для азотфиксации штамм 1022, полученный из Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (ВКСМ, Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург, Россия).

Культивирование бактерий. Планктонную культуру бактерий выращивали в термостате при температуре 26°С в конических колбах объемом 100 мл на среде (рН 7.0), содержащей гороховый отвар (30 г сухого гороха/л), глюкозу – 15 г/л и CaCO₃ – 5 г/л. Титр бактерий определяли на планшетном спектрофотометре “АИФР-01 Униплан” (ВНИИ оптико-физических измерений, Москва, Россия) при 655 нм. В качестве контроля при измерении титра бактерий использовали питательную среду аналогичного состава, но без бактерий.

Для исследования использовали бактерии в стационарной фазе роста. Биопленки готовили в чашках Петри с полиэтиленовыми дисками. В чашки Петри вносили по 8 мл планктонной культуры бактерий с титром 0.3 × 10⁸ кл./мл и культивировали на среде с гороховым отваром в течение 3 сут при 27°С. Затем среду удаляли, добавляли 8 мл такой же чистой среды и продолжали культивирование в тех же условиях еще в течение 3 сут. Для определения плотности биопленки среду удаляли, фиксировали 96%-ным этиловым спиртом на полиэтиленовом диске и окрашивали 0.1%-ным кристаллическим фиолетовым и трижды промывали дистиллированной водой. Далее добавляли 2 мл воды, инкубировали в течение 2 мин и измеряли интенсивность окраски полученного раствора на спектрофотометре при 495 нм. Плотность биопленки была пропорциональна интенсивности окраски раствора [7].

Нарингенин (“Sigma-Alcorich” США), растворенный в минимальном объеме метанола, добавляли в среду культивирования бактерий после автоклавирования. Использовали нарингенин в следующих конечных концентрациях: 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ. Контролем служила культура бактерий, выращенная без добавления нарингенина. Предварительные эксперименты показали, что сам по себе метанол в концентрации 10 мкл/30 мл среды не оказывал влияния на рост бактерий. Для искусственного снижения уровня цАМФ в клетках бактерий использовали сурамин – ингибитор трансмембранной аденилатциклазы. В работе 500 мкМ сурамина добавляли к среде, в которой выращивали планктонную культуру и культивировали 5 сут. В отдельных экспериментах сурамин добавляли в среду вместе с нарингенином.

Определение активности трансмембранной аденилатциклазы и концентрации цАМФ. Активность тАЦ определяли в мембранной фракции бактериальных клеток, как планктонной культуры, так и в биопленках, не фиксированных спиртом по методу, описанному в работе [8], и выражали в наномолях цАМФ/мг белка в мин.

Содержание цАМФ определяли методом иммуноферментного анализа в супернатанте, полученном в результате центрифугирования при 10 500 g гомогената клеток бактерий отмытых и разрушенных на ультразвуковом соникаторе “Branson Ultrasonic corp” (США) [8]. Белок определяли по методу Брэдфорда [9].

Эксперименты проводили в трех биологических повторностях. При определении титра бактерий и плотности биопленок использовали восемь аналитический повторностей. В экспериментах по изучению активности компонентов аденилатциклазной сигнальной системы бактерий учитывали десять аналитических повторностей для каждой биологической. Для статистической обработки результатов использовали программу Sigma-Plot, с помощью которой вычисляли среднее арифметическое значение и среднее квадратическое отклонение. Достоверность различий между значениями вычисляли по критерию Дункана, критерию Даннета и двухвыборочному t-критерию Стьюдента при Р ≤ 0.05. На графиках приведены средние значения и среднеквадратическое отклонение. Достоверно различающиеся значения на графиках отмечены звездочками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние нарингенина на динамику роста планктонной культуры и плотность биопленок R. leguminosarum bv. viciae. Для исследования влияния нарингенина на рост планктонной культуры и биопленок использовали несколько концентраций нарингенина: 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ. Все испытанные концентрации почти не оказывали влияния на рост планктонной культуры R. leguminosarum bv. viciae в течение 4 сут эксперимента, на пятые сут плотность ризобиальной культуры снижалась на 40–50% по сравнению с контролем (рис. 1).

Рис. 1.

Влияние нарингенина на рост планктонной культуры R. leguminosarum bv. viciae: 1 – первые сут роста бактерий, 5 – 5 сут роста бактерий. Контроль (К) - планктонная культура без добавления нарингенина. *Различия статистически значимы (P ≤ 0.05) при сравнении вариантов опыта с нарингенином с контролем по критерию Стьюдента. Различия вариантов опыта с различными концентрациями нарингенина между собой по критерию Дункана (P ≤ 0.05) статистически не значимы. (n = 3, m ± S.E).

В то же время на формирование биопленок нарингенин оказывал другой эффект: их плотность возрастала под действием самой низкой из испытуемых концентраций, 500 пМ, но с увеличением концентрации этого соединения наблюдалось снижение плотности биопленок (рис. 2).

Рис. 2.

Влияние нарингенина на плотность биопленок R. leguminоsarum bv. viciae (оптическая плотность (ОП), % к контролю.). Контролем служили биопленки без добавления нарингенина. *Различия статистически значимы (P ≤ 0.05) при сравнении между собой вариантов опыта с различными концентрациями нарингенина по критерию Дункана. n = 3, m ± S.E.

По данным литературы, нарингенин метаболизируется R. leguminosarum bv. viciae с образованием флороглюцина, п-кумаровой кислоты и п-гидроксибензойной кислот [10]. Так как действующая концентрация нарингенина как сигнальной молекулы была мала, то содержание продуктов его метаболизма также было низким и не могло оказывать токсическое воздействие на бактерии.

Влияние нарингенина на активность аденилатциклазы и концентрацию цАМФ в планктонной культуре и биопленках R. leguminosarum bv. viciae. Исследования показали, что уровень эндогенного цАМФ бактерий в планктонной культуре в стационарной стадии роста и в зрелых биопленках существенно различался, в последнем варианте концентрация этой сигнальной молекулы была в 4 раза ниже по сравнению с планктонной культурой (табл. 1). Добавление различных концентраций нарингенина к планктоной культуре и биопленкам приводило к повышению уровня эндогенного цАМФ (табл. 1).

Для изучения влияния нарингенина на активность тАЦ в планктонной культуре и биопленках R. leguminosarum bv. viciae использовали как самую низкую, 500 пМ, так и самую высокую – 1 мкМ концентрации нарингенина. Обе концентрации нарингенина активировали тАЦ как в клетках планктонной культуры, так и в биопленках. Однако в планктонной культуре такое влияние было более выраженным (рис. 3).

Рис. 3.

Влияние нарингенина на активность тАЦ (цАМФ, % к контролю) в клетках планктонной культуры (1) и биопленках R. leguminosarum bv. viciae (2). Контролем служили планктонная культура/биопленки без добавления нарингенина. n = 3, m ± S.E. *Различия статистически значимы (P ≤ 0.05) по двухвыборочному t-критерию Стьюдента при сравнении между собой вариантов опыта: с планктонной культурой и биопленкой.

Для проверки гипотезы о лиганд-рецепторном механизме активации тАЦ нарингенином к планктонной культуре добавляли 500 мкМ сурамина [11]. Известно, что активация тАЦ от мембранных рецепторов происходит с участием ГТФ-связывающих белков (G-белков). Сурамин разобщает связь мембранного рецептора с G-белком, таким образом ингибируя активность тАЦ [12].

Культивирование планктонной культуры бактерий с сурамином в течение 5 сут снижало активность этого фермента более чем на 70% (рис. 4). Однако инкубация с сурамином и 1мкМ нарингенина также в течение 5 сут повышала активность тАЦ до 250% от контроля (рис. 4).

Рис. 4.

Влияние нарингенина (1, 1 мкМ) и сурамина (2, 500 мкМ) и их смеси (3) на активность тАЦ (цАМФ, % к контролю) планктонной культуры R. leguminоsarum bv. viciae. Контролем служила планктонная культура без добавок. *Различия статистически значимы (P ≤ 0.05) при сравнении вариантов 2 и 3 по t-критерию Стьюдента; n = 3, m ± S.E.

Растительно-бактериальный азотфиксирующий симбиоз начинается с обмена сигналами между макро- и микросимбионтом. На ранних этапах взаимодействия растения выделяют в ризосферу флавоноиды, один из которых, нарингенин, необходим для индукции транскрипции генов ключевых факторов образования клубеньков у бактерий рода Rhizobium – Nod-факторов [13, 14]. Nod-факторы запускают комплекс специфических ответов в эпидерме, перицикле и коре корня растения, тем самым обеспечивая основу для последующего проникновения ризобий в клетки растений, развития инфекции и морфогенеза клубеньков [15].

Следует отметить, что в литературе нет однозначного мнения об оптимальных действующих концентрациях нарингенина. По некоторым данным, на индукцию nod-генов и рост культуры R. leguminosarum bv. viciae наибольший активирующий эффект оказывает нарингенин в концентрации 0.5 мкМ [16]. В тоже время, по данным других авторов, различная степень активации этих же генов достигается в диапазоне концентраций нарингенина 2.5–100 нМ [17]. Экзогенный нарингенин в концентрации от 2 до 4 мМ стимулировал скручивание корневых волосков и увеличивал количество образовавшихся клубеньков у гороха. При добавлении 40 мМ нарингенина образование клубеньков ингибировалось [16, 18]. Одной из причин такого разброса данных могла служить способность нарингенина в значительных количествах накапливаться в цитоплазматической мембране R. leguminosarum bv. viciae, таким образом достигая необходимой эффективной концентрации [17]. В проведенных экспериментах все концентрации нарингенина (500 пМ–1мкМ) почти не оказывали влияния на численность бактерий в планктонной культуре. Снижение титра R. leguminosarum bv. viciae на 5 сут, вероятно, связано с влиянием продуктов распада нарингенина (рис. 1). В тоже время в биопленках самая низкая концентрация нарингенина (500 пМ) оказывала стимулирующий эффект, в результате чего повышалась плотность пленки, а высокая концентрация существенно снижала ее (рис. 2). Такое воздействие представляется вполне логичным, поскольку эффективность нарингенина как сигнальной молекулы, по-видимому, проявлялось уже в низких концентрациях.

Известно, что рост бактерий как в планктонной культуре, так и в биопленках регулируется различными аутоиндукторами [17]. Но кроме них, важная роль в развитии бактериального сообщества принадлежит и сигнальным молекулам, в том числе цАМФ [20, 21]. Судя по полученным данным, планктонная культура и биопленки значительно различались по концентрации эндогенного цАМФ и нарингенин оказывал определенное влияние на этот показатель. При этом в планктонной культуре под воздействием нарингенина уровень цАМФ возрастал, однако титр практически не менялся, тогда как в биопленках при увеличении концентрации нарингенина их плотность снижалась, а уровень цАМФ возрастал. Это подтверждает существование особенностей воздействия цАМФ на бактерии в различных формах культивирования [22]. Вероятно, нарушение оптимальной концентрации эндогенного цАМФ в биопленках R. leguminosarum bv. viciae, но не в планктонной культуре, оказывало негативный эффект на их плотность. Это подтверждается данными о влиянии цАМФ на синтез экзополисахаридов бактерий. Эти метаболиты являются неотъемлемой частью матрикса биопленок и нарушение их синтеза отрицательно сказывается на их формировании: цАМФ через ряд каскадных реакций оказывает влияние на индукцию генов LuxS-AI-синтазы, отвечающей за синтез аутоиндуктора – 2-диэфир-фуранозил-бората и гена pssA, кодирующего глюкозил-изопренилфосфаттрансферазу, участвующую в синтезе экзополисахаридов (ЭПС) и в формировании биопленок [20]. Особенно важна роль биопленок на ранних этапах взаимодействия с растениями, потому что в этой форме бактерии более эффективно могут избегать негативного влияния растительных метаболитов, в то же время повышается активность факторов вирулентности [23]. При этом показано, что переход обратимого прикрепления бактерий к необратимому за счет снижения гидрофобности клеток также связан с концентраций эндогенного цАМФ [23].

Поскольку нарингенин активировал тАЦ, а сурамин, разобщающий связь рецептора с G-белком, ингибировал ее активность, можно предположить, что тАЦ может быть одним из компонентов рецептора к нарингенину у бактерий. Подтверждением этому могут служить данные литературы о том, что у Sinorhizobium meliloti при контакте с Medicago sativa активируются три рецептороподобные аденилатциклазы, регулятор транскрипции и целевой ген [5]. Можно предположить, что у бактерий, так же как и у растений [24], тАЦ функционирует в виде многофункциональных молекулярных комплексов, в состав которых входит и рецепторный домен. Несмотря на то, что результаты по ингибированию/активации тАЦ были получены на планктонной культуре, можно считать, что такой же механизм функционирует и в биопленках, поскольку ранее его присутствие также было показано и в биопленках ризобий [25].

Таким образом, можно сделать вывод, что нарингенин через активацию рецептора способен стимулировать ризобиальную тАЦ и, соответственно, влиять на цАМФ-зависимые процессы в биопленках R. leguminosarum bv. viciae, что расширяет и углубляет современные представления о взаимодействиях между бобовыми и R. leguminosarum bv. viciae.