Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 5, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 5, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 5, стр. 512-519

Фаговые антитела для определения канамицина

О. И. Гулий 1, *, С. С. Евстигнеева 1, С. А. Староверов 1, 2, А. С. Фомин 1, О. А. Караваева 1

1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, ФИЦ “Саратовский научный центр РАН” (ИБФРМ РАН)
410049 Саратов, Россия

2 Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н.И. Вавилова
410012 Саратов, Россия

* E-mail: guliy_olga@mail.ru

Поступила в редакцию 07.04.2023
После доработки 21.04.2023
Принята к публикации 28.04.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Получены рекомбинантные антитела, специфичные к канамицину, с использованием овечьей дисплейной библиотеки фрагментов scFv (Griffin.1) и показана возможность их применения для определения канамицина методом дот-иммуноанализа. Минимальная определяемая концентрация канамицина составляет 1 мкг/мл (различимое связывание метки, отличное от фонового уровня). Показано, что антиканамициновые фаговые антитела обладали специфичностью в отношении канамицина и не взаимодействовали с другими антибиотиками (неомицином, тетрациклином, ампициллином, гентамицином). Антиканамициновые фаговые антитела являются перспективной альтернативой моноклональным антителам для использования при определении канамицина.

Ключевые слова: фаговый дисплей антител, канамицин, определение, дот-иммуноанализ

Фаговый дисплей – технология, разработанная американским химиком Джорджем П. Смитом, в основе которой лежит экспонирование чужеродных пептидов или белков на поверхности фаговых частиц в составе одного из химерных белков оболочки [1–3]. Эта технология основана на возможности экспрессии чужеродного белка на поверхности нитчатого бактериофага М13, проведении встройки гена, кодирующего фрагмент эндонуклеазы рестрикции EcoRI, в единую рамку трансляции с минорным белком оболочки pIII нитчатого бактериофага [4]. Метод представления пептида на поверхности бактериофага М13 был изобретен в 1985 г. В 1989 г. были клонированы гены иммуноглобулинов, что позволило обойтись без гибридомной технологии для получения антител. Первоначально в бактериях синтезировали Fab или scFv фрагменты антител, создавая библиотеки клонов, и проводили вручную отбор наиболее аффинных клонов с помощью радиоактивно-меченного антигена, что было весьма трудоемко и неэффективно. В 1990 г. впервые использовали дисплейную технологию представления фрагментов антител на поверхности фагов, а в 1991 создали первую библиотеку вариабельных фрагментов. Метод фагового дисплея был использован для экспонирования антигенсвязывающих фрагментов иммуноглобулинов на поверхности бактериофага fd [5]. В результате появился новый комбинаторный подход к разработке рекомбинантных антител, являющийся альтернативным традиционной гибридомной технологии. Технология фагового дисплея основана на простых процедурах манипулирования с ДНК и бактериями [4–6], что значительно сокращает время получения и стоимость стабильных клонов [7, 8]. Общая схема получения комбинаторной фаговой библиотеки включает следующие этапы.

1. Из донорских иммунных или интактных В-лимфоцитов человека, мыши, кролика, цыпленка, свиньи, собаки, обезьяны, овцы, коровы и др. выделяют мРНК и клонируют гены scFv, Fab-фрагментов или др.

2. Данные гены встраивают в фагмиду в единую рамку трансляции с геном, кодирующим белок капсида (обычно p3).

Полученными фагмидами заражают клетки Escherichia coli, в которых происходит экспрессия фагмидных генов и сборка вирионов, которые в составе капсидных белков будут экспонировать и чужеродный фрагмент антитела. В зависимости от выбранной векторной системы этот этап проходит с использованием хелперных фагов или без них. Таким образом, получают популяцию бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности определенный антигенсвязывающий домен [9, 10]. Схема конструирования фрагментов антител фаговой библиотеки представлена на рис. 1 [11].

Рис. 1.

Схема конструирования фрагментов антител фаговой библиотеки [11].

Фаговый дисплей антител, позволяющий получать антитела к низкомолекулярным антигенам (гаптенам), является перспективной методикой для определения антибактериальных препаратов. С момента получения первых антител на поверхности фагов интерес к применению фагового дисплея неуклонно растет. За последние пять лет количество публикаций, посвященных применению рекомбинантных фаговых антител возросло более чем в два раза: от 70 статей в 2018 г. до 142 статей в 2022 г. [12–16]. Так, например, с применением технологии фагового дисплея получены и апробированы в различных методах иммуноанализа фаговые антитела к ивермектину [17], диминазину [18], ферритину [19], силимарину [20], ампициллину [21]. Одним из антибиотиков, который применяется не только для лечения, но и в качестве стимулятора роста животных и в кормовых добавках для профилактики заболеваний, является канамицин [22]. Неконтролируемое применение канамицина приводит не только к повышению устойчивости бактерий к нему, но и вызывают накопление остатков канамицина в воде. Канамицин угрожает здоровью человека, поскольку он может накапливаться в организме и характеризуется потенциальной ототоксичностью и нефротоксичностью [23, 24]. Особенную опасность представляет канамицин при попадании в воду, поскольку для его гидролиза необходима температура не ниже 100°C [25], поэтому контроль содержания канамицина в воде и развитие методов для его определения представляет особый интерес.

Наиболее распространенным вариантом получения антител, обладающих специфичностью к конкретному антигену, является иммунизация животных. Возможность использования антиканамициновых антител нефагового происхождения для определения антибиотика описана в работах [26–30]. Альтернативным методом получения специфичных антител, не требующим иммунизации животных, является технология фагового дисплея. Поэтому важным моментом при развитии методов определения канамицина является подбор специфичного антитела, в том числе с помощью технологии фагового дисплея.

Цель работы – совершенствование технологии фагового дисплея для получения антиканамициновых антител и оценка возможности их применения для определения канамицина.

МЕТОДИКА

Бактериальная культура и питательные среды. Использованы бактерии Escherichia coli штамма TG1, полученные из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (Россия, http://collection.ibppm.ru). Культуры выращивали на жидкой питательной среде 2хTY следующего состава (г/100 мл воды): NaCl – 0.5; триптон (“Becton, Dickinson and Company”, Франция) – 1.6; дрожжевой экстракт – 1.0, при 37°C с перемешиванием при 160 об./мин.

В работе использовали антибиотики: канамицин, ампициллин, тетрациклин, гентамицин, неомицин (“Sigma”, США).

Аффинная селекция миниантител из фаговой библиотеки. В работе использовали фаговую библиотеку антител (Ат) овцы, любезно предоставленную профессором Университета г. Абердин (Великобритания) У. Харрисом [9]. В работе использовали хелперный бактериофаг М13К07 (“Stratagene”, Швеция).

Синтез белковых конъюгатов канамицина проводили по методике, описанной в работе [30].

Для селекции фагов, несущих антитела к конъюгатам канамицина с бычьим сывороточным альбумином (БСА), в качестве твердой фазы для закрепления антигена использовали мембрану “Wester S”, как описано в [21, 32]. Блокировку незанятого антигеном пространства на стенках планшета проводили 2% раствором сухого обезжиренного молока (“Scharlau”, Испания) в течение 1 ч. Элюцию фаговых частиц проводили триэтиламином. Элюированные фаговые частицы использовали для инфицирования клеток E. coli штамма TG1. Методика получения фаговых антител подробно описана в работе [21].

Отбор фаговых частиц библиотеки или аффинная селекция проводилась следующим образом: клоны библиотеки инкубировали с иммобилизованным антигеном (канамицином); удаляли при помощи отмывки фаговые частицы, не связавшиеся с антибиотиком; элюировали связавшиеся фаговые частицы; заражали отобранными клонами клетки E. coli и проводили амплификацию с последующим выделением аффинных клонов, как описано [21].

Концентрацию фаговых частиц определяли спектрофотометрически, как описано в работе [33] на спектрофотометре UV-VIS Specord BS 250 (“Analytik Jena AG”, Германия) в Центре коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии “Симбиоз” ИБФРМ РАН.

Полученный препарат фаговых частиц использовали для проведения последующих раундов селекции, осуществляемых в аналогичных условиях. Специфичность полученных препаратов фаговых антител определяли методом дот-иммуноанализа. Титр сыворотки определяли с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) по общепринятой методике [34]. Титр фаговых антител составил 1 : 2000.

Наночастицы золота. Наночастицы золота со средним диаметром частиц (15 нм) получали, используя реакцию восстановления золотохлористоводородной кислоты (“Aldrich”, США) цитратом натрия (“Fluka”, Швейцария) по методу, описанному в работе [35]. Наночастицы контролировали по фотометрической калибровке, с помощью трансмиссионной электронной микроскопии и регистрации динамического рассеяния света, как описано [36] в Центре коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии “Симбиоз” ИБФРМ РАН.

Дот-иммуноанализ. Для дот-иммуноанализа использовали мембрану “Western S” (“Sigma-Aldrich”, США), которую предварительно погружали в раствор метанола на 30 с. Методика проведения подробно описана в работе [21]. Канамицин наносили на мембрану “Western S” в концентрациях 0.5; 1; 2; 4, 6, 12, 25, 50 и 100 мкг/мл. Блокировку мембраны проводили в течение 1 ч 2%-ным сухим молоком, разведенным в фосфатном буферном растворе (рН 7.0). Мембрану погружали в раствор специфичных фагмид, разведенных до концентрации 1 × 1013 в 1 мл 10 мМ фосфатного буфера, и проводили инкубацию в течение ночи при 4°C. Затем мембрану отмывали от неспецифически связавшихся фаговых антител в фосфатном буфере и погружали в конъюгат коллоидного золота с кроличьими антифаговыми антителами (А520 = 0.5) при 25°C на ночь. После окрашивания мембрану промывали в фосфатном буфере и высушивали.

Метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для ИФА использовали 96-луночные полистироловые планшеты. Ампициллин, канамицин и тетрациклин растворяли в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7.0). Антибиотики титровали (исходная концентрация 1 мг/мл) с помощью двойных последовательных разведений и иммобилизировали в планшетах методом простой адсорбции при комнатной температуре на протяжении ночи. В качестве первичных антител вносили фаговые антиканамициновые антитела (разведение 1 : 10), которые затем взаимодействовали со вторичными кроличьими антифаговыми антителами (разведение 1 : 2). Для ферментативного мечения взаимодействия антиген-антитело была использована пероксидаза хрена, конъюгированная с козьими антикроличьими антителами. В качестве субстрата для пероксидазы использовали о-фенилендиамин в присутствии перекиси водорода. Оптическую плотность образцов после проведения ферментативной реакции измеряли с помощью мультипланшетного фотометра Multiskan Ascent (“ThermoLabsystems”, Финляндия) при длине волны 492 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При отработке технологии фагового дисплея для получения антиканамициновых антител, были проведены с первого по четвертый раунды селекции фаговых антител, специфичных к канамицину. Проверку специфичности антиканамициновых фаговых антител после каждого раунда селекции проводили методом дот-иммуноанализа, который заключается в качественном и полуколичественном тестировании антител. Суть метода заключается в визуализации специфического взаимодействия адсорбированного на мембране антигена и меченых (коллоидными или молекулярными метками) антител. В работе использовали стратегию вторичного мечения, которая успешно была ранее апробирована в работе [19]: сначала проводили биоспецифическую реакцию канамицин/фаговые антитела, а затем визуально оценивали реакцию с помощью меченых наночастицами поликлональных кроличьих антифаговых антител. На рис. 2 представлены данные дот-иммуноанализа для антиканамициновых фаговых антител после 3 и 4 раундов селекции, поскольку специфичность антиканамициновых фаговых антител в отношении канамицина увеличилась после этих раундов селекции. При проведении исследований по определению минимальной концентрации антигена, визуально детектируемого с помощью антиканамициновых фаговых антител методом дот-иммуноанализа показано, что данные антитела позволяют определять канамицин. Так, из результатов, представленных на рис. 2б видно, что фаговые антитела, специфичные к канамицину, позволяли определять канамицин в водных растворах методом дот-иммуноанализа с нижним пределом детекции 1 мкг/мл.

Рис. 2.

Дот-иммуноанализ фаговых антител, специфичных к канамицину, полученных с использованием фаговой библиотеки после третьего (а) и четвертого (б) раундов селекции: 1 – 100; 2 – 50; 3 – 25; 4 – 12.5; 5 – 6; 6 – 5; 7 – 4; 8 – 3; 9 – 2; 10 – 1 (мкг/мл).

Дополнительно для оценки специфичности антиканамициновых антител проводили ИФА после первого (рис. 3а), второго (рис. 3б), третьего (рис. 3в) и четвертого (рис. 3г) раундов селекции антител. В качестве дополнительного контроля специфичности антиканамициновых фаговых антител, использовали ампициллин и тетрациклин. Данные, полученные методом ИФА (рис. 3), показывают, что фаговые антиканамициновые антитела выявляли канамицин, но не обнаруживали другие антибиотики.

Рис. 3.

ИФА фаговых антител, специфичных к канамицину после первого (а), второго (б), третьего (в) и четвертого (г) раундов селекции: 1 – канамицин, 2 –ампициллин, 3 – тетрациклин.

На основании проведенных исследований сделан вывод, что для повышения чувствительности фаговых антител рекомендовано проводить не менее четырех раундов селекции.

Для экспериментов по оценке специфичности фаговых антител к канамицину использовали антибиотики, которые относятся к разным классам:

Рис. 4.

Структурные формулы канамицина, гентамицина и неомицина.

тетрациклин – представитель тетрациклинов, занимает 1 место по объему продаж среди всех антибиотиков; ампициллин – представитель бета-лактамных антибиотиков вместе с пенициллинами (сведения по бета-лактамным антибиотикам приводятся совместно с пенициллинами) занимают 2 место по объему продаж среди всех антибиотиков [37].

При разработке специфичного рецептора для определения антигена одним из важных моментов является оценка неспецифичного взаимодействия с другими аналитами. Поэтому дополнительно проводили анализ возможности неспецифичного взаимодействии антиканамициновых антител с другими представителями аминогликозидных антибиотиков. В работе использовали гентамицин и неомицин. Структурные формулы используемых в работе аминогликозидных антибиотиков представлены на рис. 4. Условия проведения анализа для всех антибиотиков были аналогичны тем, которые были и при использовании канамицина. Как видно из данных, представленных на рис. 5, фаговые антиканамициновые антитела взаимодействуют только с канамицином, но не связываются с ампициллином, гентамицином, тетрациклином и неомицином.

Рис. 5.

Анализ взаимодействия фаговых антител, специфичных к канамицину, полученных с использованием фаговой библиотеки после 4 раунда селекции, в отношении канамицина, неомицина, гентамицина, тетрациклина и ампициллина методом дот-иммуноанализа: 1 – 128; 2 – 64; 3 – 32; 4 – 16; 5 – 8.0; 6 – 4.0; 7 – 2; 8 – 1.0 мкг/мл.

Таким образом, отработана технология получения антиканамициновых антител с помощью фагового дисплея. Методом дот-иммуноанализа при биоспецифичном взаимодействии отобранных фаговых антиканамициновых антител проведено определение канамицина в водных растворах, при минимальной определяемой концентрации 1 мкг/мл (различимое связывание метки, отличное от фонового уровня). Показано, что полученные антиканамициновые антитела специфичны в отношении канамицина и не взаимодействуют с представителями других антибактериальных препаратов: ампициллином, тетрациклином, гентамицином и неомицином.

Перспективность получения и применения моноклональных и поликлональных антител для определения канамицина показаны с помощью конкурентного прямого ИФА и иммунохроматографического анализа [38], метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа [39], а также с помощью иммуносенсорных технологий [40–43]. В данной работе показана альтернативная возможность получения антител, специфичных к канамицину, с применением технологии фагового дисплея. Технология фагового дисплея обеспечивает быструю и экономичную наработку антител с использованием нитевидного фага. Производство рекомбинантных антител включает несколько этапов, но все они проводятся in vitro и отсутствует необходимость проведения экспериментов с привлечением животных. Это основное и важное преимущество данной технологии по сравнению с традиционными методами получения антител. Еще одним преимуществом фагового дисплея является меньшее время, необходимое для продукции антител. Это делает фаговый дисплей эффективным в долгосрочной перспективе. Однако, следует признать, что фаговые антитела имеют низкую аффинность по сравнению с обычными иммуноглобулинами.

Таким образом, рекомбинантные антитела, полученные с помощью фагового дисплея, создают перспективную платформу для определения антибиотиков и могут быть использованы для их анализа.

Исследования проводились с использованием оборудования Центра коллективного пользования “Симбиоз” (ЦКП “Симбиоз”) ИБФРМ РАН (Саратов).

Список литературы

  1. Willats W.G.T. // Plant Mol. Biol. 2002. V. 50. P. 837–854. https://doi.org/10.1023/A:1021215516430

  2. Wang L.-F., Yu M. // Curr. Drug Targets. 2004. V. 5. P. 1–15. https://doi.org/10.2174/1389450043490668

  3. Кузьмичева Г.А., Белявская В.А. // Биомедицинская химия. 2016. Т. 62. № 5. С. 481–495. Kuzmicheva G.A., Belyavskaya V.A. // Biochem. Moscow Suppl. Ser. В. 2017. V. 11. Р. 1–15. https://doi.org/10.18097/PBMC20166205481

  4. Smith G.P. // Science. 1985. V. 228. P. 1315–1317. https://doi.org/10.1126/science.4001944

  5. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. // Nature. 1990. V. 348. P. 552–554. https://doi.org/10.1038/348552a0

  6. Smith G.P., Petrenko V.A. // Chem. Rev. 1997. V. 97. P. 391–410. https://doi.org/10.1021/cr960065d

  7. Chassagne S., Laffly E., Drouet E., Hérodin F., Lefranc M.-P., Thullier P. // Mol. Immunol. 2004. V. 41. P. 539–546. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2004.03.040

  8. Jacobsson K., Rosander A., Bjerketorp J., Frykberg L. // Biol. Proced. Online. 2003. V. 5. P. 123–135. https://doi.org/10.1251/bpo54

  9. Charlton K.A., Moyle S., Porter A.J.R., Harris W.J. // J. Immunol. 2000 V. 164. P. 6221–6229. https://doi.org/10.4049/jimmunol.164.12.6221

  10. Bashir S., Paeshuyse J. // Antibodies. 2020. V. 9. P. 21. https://doi.org/10.3390/antib9020021

  11. Тикунова Н.В., Морозова В.В. // Acta Nat. 2009. Т. 1. С. 22–31. doi.org/ Tikunova N.V., Morozova V.V. // Acta Nat. 2009. V. 1. P. 20–28. https://doi.org/10.32607/20758251-2009-1-3-20-28

  12. Zhao H., Nie D., Hu Y., Chen Z., Hou Z., Li M., Xue X. // Molecules. 2023. V. 28. P. 2621. https://doi.org/10.3390/molecules28062621

  13. Guliy O.I., Evstigneeva S.S., Dykman L.A. // Biosens Bioelectron. 2023. V. 222. P. 114909. https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114909

  14. Tang H., Gao Y., Han J. // Int J Mol Sci. 2023. V. 24 (4). P. 4176. https://doi.org/10.3390/ijms24044176

  15. Mahdavi S.Z.B., Oroojalian F., Eyvazi S., Hejazi M., Baradaran B., Pouladi N. et al. // Int J Biol Macromol. 2022. V. 208. P. 421–442. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.03.113

  16. Li L., Wu S., Si Y., Li H., Yin X., Peng D. // Compr Rev Food Sci Food Saf. 2022. V. 21. P. 4354–4377. https://doi.org/10.1111/1541-4337.13018

  17. Пристенский Д.В., Староверов С.А., Ермилов Д.Н., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53. С. 57–64. Pristensky D.V., Staroverov S.A., Ermilov D.N., Shchyogolev S.Y., Dykman L.A. // Biochem. Moscow Suppl. Ser. В. 2007. V. 1. P. 249–253. https://doi.org/10.1134/S1990750807030146

  18. Staroverov S.A., Sidorkin V.A., Fomin A.S., Shchyogolev S.Y., Dykman L.A. // J. Vet. Sci. 2011. V. 12. P. 303–307. https://doi.org/10.4142/jvs.2011.12.4.303

  19. Staroverov S.A., Volkov A.A., Fomin A.S., Laskavuy V.N., Mezhennyy P.V., Kozlov S.V. et al. // J. Immunoassay Immunochem. 2015. V. 36. P. 100–110. https://doi.org/10.1080/15321819.2014.899257

  20. Staroverov S.A., Kozlov S.V., Fomin A.S., Gabalov K.P., Khanadeev V.A., Soldatov D.A. et al. // ADMET DMPK. 2021. V. 9. P. 255–266. https://doi.org/10.5599/admet.1023

  21. Гулий О.И., Алсовэйди А.К.М., Фомин А.С., Габалов К.П., Староверов С.А., Караваева О.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 2022. Т. 58. № 5. С. 513–519. Guliy O.I., Alsowaidi A.K., Fomin A.S., Gabalov K.P., Staroverov S.S., Karavaeva O.A. // Appl. Biochem. Microbiol. 2022. V. 58. № 5. P. 646–651. https://doi.org/10.1134/S000368382205008810.1134/S0003683822050088https://doi.org/10.31857/S0555109922050087

  22. Durante-Mangoni E., Grammatikos A., Utili R., Falagas M.E. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2009. V. 33. P. 201–205. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2008.09.001

  23. Jiang M., Karasawa T., Steyger P.S. // Front. Cell Neurosci. 2017. V. 11. P. 308. https://doi.org/10.3389/fncel.2017.00308

  24. Shavit M., Pokrovskaya V., Belakhov V., Baasov T. // Bioorg. Med. Chem. 2017. V. 25. P. 2917–2925. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2017.02.068

  25. Tang M., Li F., Yang M., Zhang Y. // J. Environ. Sci. (China). 2020. V. 97. P. 11–18. https://doi.org/10.1016/j.jes.2020.04.032

  26. Jin Y., Jang J.W., Han C.H., Lee M.H. // J Vet Sci. 2006. V. 7(2). P. 111–117. https://doi.org/10.4142/jvs.2006.7.2.111

  27. Pietschmann J., Dittmann D., Spiegel H., Krause H.J., Schröper F. // Foods. 2020. V. 9. P. 1773. https://doi.org/10.3390/foods9121773

  28. Li C., Zhang Y., Eremin S.A., Yakup O., Yao G., Zhang X. // Food Chem. 2017. V. 227. P. 48–54. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.01.058

  29. DeCastro A.F., Place J.D., Lam C.T., Patel C. // Antimicrob Agents Chemother. 1986. V. 29. № 6. P. 961–964. https://doi.org/10.1128/AAC.29.6.961

  30. Wei Q., Zhao Y., Du B., Wu D., Li H., Yang M. // Food Chem. 2012. V. 134. № 3. P. 1601–1606. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.02.126

  31. Самсонова Ж.В., Щелокова О.С., Иванова Н.Л., Рубцова М.Ю., Егоров А.М. // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. № 6. С. 668–675. Samsonova Z.V., Shchelokova O.S., Ivanova N.L., Rubtsova M.Y., Egorov A.M. // Appl. Biochem. Microbiol. 2005. V. 41. № 6. P. 589–595. https://doi.org/10.1007/s10438-005-0107-4

  32. Charlton K.A., Moyle S., Porter A.J., Harris W.J. // J. Immunol. 2000. V. 164. P. 6221–6229. https://doi.org/10.4049/jimmunol.164.12.6221

  33. Smith G.P., Scott J.K. // Methods Enzymol. 1993. V. 217. P. 228–257. https://doi.org/10.1016/0076-6879(93)17065-D

  34. Shah K., Maghsoudlou P. // Br. J. Hosp. Med. 2016. V. 77. P. 98–101.

  35. Frens G. // Nat. Phys. Sci. 1973. V. 241. P. 20–22. https://doi.org/10.1038/physci241020a0

  36. Guliy O.I., Zaitsev B.D., Burygin G.L., Karavaeva O.A., Fomin A.S., Staroverov S.A., Borodina I.A. // Ultrasound Med. Biol. 2020. V. 46. P. 1727–1737. https://doi.org/10.1016/j.ultrasmedbio.2020.03.014

  37. European Medicines Agency, European Surveillance of Veterinary Antimicrobial Consumption, 2021. “Sales of Veterinary Antimicrobial Agents in 31 European Countries in 2019 and 2020”. (EMA/58183/2021).

  38. Jin Y., Jang J.-W., Han C.-H., Lee M.-H. //J. Vet. Sci. 2006. V. 7(2). P. 111–117.

  39. Воронежцева О.В., Еремин С.А., Ермолаева Т.Н. // Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация. 2009. № 2. С. 11–17.

  40. Zhao Y., Wei Q., Xu C., Li H., Wu D., Cai Y., Mao K., Cui Z., Du B. // Sens. Actuators B Chem. 2011. V. 155. № 2. P. 618–625. https://doi.org/10.1016/j.snb.2011.01.019

  41. Shinko, E.I., Farafonova, O.V., Ermolaeva, T.N. // Zavodskaya Laboratroiya. Diagnostika Materialov. 2021. V. 87. № 12. P. 11–16. https://doi.org/10.26896/1028-6861-2021-87-12-12-17

  42. Shinko E.I., Farafonova O.V., Shanin I.A., Eremin S.A., Ermolaeva T.N. // Anal. Lett. 2022. V. 55. № 7. P. 1164–1177. https://doi.org/10.1080/00032719.2021.1991364

  43. Bizina E.V., Farafonova O.V., Zolotareva N.I., Grazhulene S.S., Ermolaeva T.N. // J. Anal. Chem. 2022. V. 77. № 4. P. 458–465. https://doi.org/10.1134/S1061934822040049

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал