Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 6, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 6, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 6, стр. 605-613

Создание продуцента рекомбинантной универсальной пероксидазы VP2 Trametes hirsuta в Penicillium canescens

О. С. Савинова 1, *, А. М. Чулкин 1, К. В. Моисеенко 1, Т. В. Федорова 1

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

* E-mail: savinova_os@rambler.ru

Поступила в редакцию 20.04.2023
После доработки 05.05.2023
Принята к публикации 10.05.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Интерес к пероксидазам секретируемого ферментного комплекса базидиальных грибов обусловлен их широкой субстратной специфичностью и способностью участвовать в процессе биодеградации таких трудно деградируемых биополимеров, как лигнин. Однако из-за сложности выделения этих ферментов из нативных источников, их изучение затруднено. В работе были получены экспрессионные вектора, несущие последовательность, кодирующую универсальную пероксидазу VP2 T. hirsuta LE-BIN072, которые были трансформированы в геном штамма P. canescens. Скрининг трансформантов показал наличие пероксидазной активности до 1 ед./мл. Целевой белок идентифицирован в культуральной жидкости отобранных трансформантов методом масс-спектрометрического анализа. Впервые получен новый штамм P. canescens pVP2D-6 – продуцент рекомбинантной универсальной пероксидазы VP2 T. hirsuta LE-BIN072 и показана способность секретируемого им ферментного комплекса к модификации щелочного лигнина.

Ключевые слова: пероксидаза, лигнолитические ферменты, Trametes hirsuta, Penicillium canescens, гетерологичная экспрессия, лигнин

Лигнин – распространенный природный гетерогенный полимер, составляющий до одной трети всей растительной биомассы, источник ценных ароматических соединений [1, 2]. Наиболее значительным потенциалом в отношении его биодеструкции обладают базидиомицеты, в частности грибы белой гнили рода Trametes, приспособившиеся в ходе эволюции к включению в свои метаболические пути всех компонентов лигноцеллюлозы [3]. Эта способность обусловлена наличием у грибов белой гнили активного секретируемого мультиферментного лигнолитического комплекса, в состав которого входят пероксидазы (использующие H2O2 в качестве окислителя), лакказы (медь-содержащие оксидазы, окисляющие субстраты, восстанавливая кислород до H2O) и различные вспомогательные ферменты (целлобиозодегидрогеназы, хинонредуктазы, а также оксидазы, генерирующие H2O2, такие как арил-алкогольоксидаза) [2, 4–6]. По сравнению с другими пероксидазами и лакказами лигнолитические пероксидазы (ЛП) обладают более высоким окислительно-восстановительным потенциалом, что позволяет им окислять широкий спектр субстратов [7], и привлекают особое внимание исследователей.

Известно, что в геномах базидиомицетов ЛП кодируются обширными мультигенными семействами. Ранее было показано [8], что базидиомицет Trametes hirsuta LE-BIN 072 принимает непосредственное участие в процессе биотрансформации лигнина, и в его геноме было обнаружено 18 генов, кодирующих 9 предполагаемых изоферментов лигнин-пероксидазы (LiP; КФ 1.11.1.14), 7 марганецзависимых пероксидаз (MnP; КФ 1.11.1.13) и 2 универсальные пероксидазы (VP; КФ 1.11.1.16) [9]. Однако при культивировании этого гриба в различных средах в секретомах были детектированы только изоферменты марганецпероксидаз MnP1, MnP2, MnP5, MnP7, лигнинпероксидаза LiP9 и универсальная пероксидаза VP2 [10].

Считается, что LiP базидиомицетов принимают участие в расщеплении преобладающих и наиболее трудно деградируемых нефенольных структур лигнина, тогда как MnP могут участвовать в окислении второстепенных фенольных фрагментов лигнина [11]. Универсальные пероксидазы VP представляют особый интерес благодаря своей способности катализировать процесс деградации соединений, которые другие пероксидазы не способны окислять напрямую. Универсальность этих изоферментов позволяет использовать их в Mn3+-опосредованных или независимых от Mn реакциях с ароматическими соединениями с низким или высоким окислительно-восстановительным потенциалом [12] без применения медиаторов. Однако все еще возникают вопросы о роли универсальных пероксидаз в лигнинолизе. Кроме того, преимуществом этих ферментов является высокая активность в присутствии органических растворителей [13].

На сегодняшний день отсутствие всесторонней характеристики всех членов мультигенного семейства ЛП, в частности гриба T. hirsuta LE-BIN072, сильно ограничивает потенциал использования этих ферментов в биокаталитических технологиях (биопереработка, биоремедиация, целлюлозно-бумажная промышленность). К сожалению, выделение и очистка индивидуальных изоферментов пероксидаз является нетривиальной задачей, так как они имеют близкие молекулярные массы и величины изоэлектрической точки, поэтому подробное изучение свойств индивидуальных изоферментов пероксидаз затруднено. Поскольку получение изоферментов с помощью нативных продуцентов трудно реализуемо, единственным способом решения задачи полной характеристики всех членов мультигенного семейства ЛП является переход к гетерологичным системам экспрессии.

Гетерологичной экспрессии секретируемых базидиальных ферментов в разных организмах посвящен большой объем исследований. Так, например, гетерологичная экспрессия пероксидазы Pleurotus eryngii в Escherichia coli обеспечивает быструю продукцию белка с высоким выходом, однако она ограничена необходимостью посттрансляционных модификаций (фолдинг, включения гема в белок, гликозилирование), которые возможны только у эукариотических организмов [14]. В этом отношении дрожжевые [15] и грибные [16, 17] системы экспрессии имеют явные преимущества. Хорошо зарекомендовали себя системы экспрессии на основе аскомицетов рода Penicillium [18]. Для некоторых из них были разработаны системы клонирования, которые позволили повысить активность продуцентов и существенно расширить спектр продуктов, получаемых на их основе. Так, ранее [19, 20] удалось успешно получить и охарактеризовать 4 рекомбинантных изофермента лакказы T. hirsuta LE-BIN072 (LacA, LacC, LacD и LacF) в аскомицете Penicillium canescens, причем на примере LacA было показано сходство нативного и рекомбинантного ферментов [21]. Таким образом, на основе изученной литературы и собственного опыта коллектива авторов, в качестве перспективного объекта для гетерологичной экспрессии ЛП T. hirsuta LE-BIN072 было предложено использовать аскомицеты рода Penicillium.

Цель работы – создание продуцента рекомбинантной универсальной пероксидазы VP2 гриба T. hirsuta LE-BIN 072 в штамме Penicillium canescens и оценка способности секретируемого ферментного комплекса нового штамма к модификации лигнина.

МЕТОДИКА

Материалы. Олигонуклеотиды были синтезированы в “Евроген” (Россия). Щелочной лигнин с низким содержанием сульфонатов приобретен у “Sigma-Aldrich” (США). Другие материалы и реактивы были приобретены у российских производителей, если не указано иное.

Штаммы и условия культивирования. В работе были использованы штамм базидиомицета Tra-metes hirsuta LE-BIN 072 из Коллекции культур Ботанического института им. В.Л. Комарова (Санкт-Петербург, Россия), штамм Penicillium canescens PCA10 (niaD–) [22] и штамм Escherichia coli XL-10 Gold (“Stratagene”, США).

Гриб T. hirsuta LE-BIN 072 выращивали глубинным способом на орбитальной качалке в колбах объемом 750 мл на глюкозо-пептонной (ГП) среде следующего состава (г/л): пептон – 3.0, глюкоза – 10, KH2PO4 – 0.6, K2HPO4 ⋅ 3H2O – 0.4, MgSO4 ⋅ 7H2O – 0.5, CaCl2–0.5, MnSO4⋅5H2O – 0.05, ZnSO4 – 0.001, FeSO4 – 0.0005, при 27°С, 180 об./мин в течение 10 сут. Культуральную жидкость (КЖ) отделяли центрифугированием, отбирали образцы мицелия для выделения ДНК и РНК.

Штамм-реципиент P. canescens PCA-10 (niaD–) культивировали 7 сут при 30°С в термостате на агаризованной среде (МС) следующего состава (г/л) : NH4Cl – 0.53, D-глюкоза – 10, агар – 2%, раствор минеральных солей - 20 мл/л. Раствор минеральных солей имел следующий состав (г/л): KCl – 26, MgSO4 ⋅ 7H2O – 26, KH2PO4 – 76, раствор микроэлементов – 50 мл/л. Раствор микроэлементов включал (мг/л): CuSO4 ⋅ 5 H2O – 400, FeSO4 ⋅ 5 H2O – 800, MgSO4 ⋅ 2 H2O – 800, Na2MoO4 ⋅ 2 H2O – 800, ZnSO4 ⋅ 7 H2O – 800, B4Na2O7 – 40.

Трансформанты P. canescens выращивали на агаризованной среде МС, в качестве источника азота использовали NaNO3. При глубинном культивировании штаммов P. canescens использовали жидкую ферментационную среду (ФС) следующего состава (г/л): свекловичный жом – 30, пептон – 50, KН2РО4 – 25, рН 4.5 [23]. Водной суспензией конидий (4 × 105 конидий/мл) засевали 100 мл среды. Культивирование проводили на орбитальной качалке в колбах объемом 750 мл при 240–250 об./мин и 30°С в течение 7 сут.

Выделение ДНК и РНК. ДНК из мицелия T. hirsuta выделяли с помощью набора DNeasy Plant Mini Kit (“Qiagen”, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для быстрого скрининга трансформантов ДНК P. canescens выделяли из споровой суспензии методом, описанным в работе [24]. Выделение РНК проводили с использованием реагента TRIzol Reagent (“Thermo Fisher Scientific”, США) согласно инструкции производителя. Количественно ДНК и РНК оценивали на приборе NanoDrop Lite (“Thermo Fisher Scientific”, США), качественно – электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. кДНК получали обратной транскрипцией с использованием обратной транскриптазы Maxima H Minus Reverse Transcriptase (“Thermo Fisher Scientific”, США) согласно рекомендациям производителя.

Конструирование экспрессионных плазмид. С помощью высокоточной ДНК-полимеразы Q5 (“NEB”, Англия) амплифицировали интронированные и сплайсированные последовательности фрагмента гена, кодирующие зрелую пероксидазу VP2 T. hirsuta LE-BIN072 (GenBank: ON230121.1), с геномной ДНК и кДНК в качестве матрицы соответственно. Использовали праймеры с введенными сайтами рестрикции: BpiI в районе отщепления сигнального пептида и XhoI после сайта терминации трансляции. Для амплификации интронированного фрагмента гена использовались праймеры VР2D и VP2DR, для сплайсированного – VР2D и VP2RR (последовательности праймеров представлены в табл.1; жирным шрифтом выделены сайты узнавания, подчеркнуты сайты отщепления). Полученные ДНК-фрагменты очищали от реакционной смеси с помощью набора Cleanup S-cap (“Евроген”, Россия) и обрабатывали пятикратным избытком эндонуклеаз BpiI и XhoI. ДНК вектора pPCGMX также обрабатывали избытком эндонуклеаз Bsp120I и XhoI, после чего ДНК разделяли в 0.8%-ном агарозном геле. Группу фрагментов размером около 6 т. п. н. элюировали из геля. Для элюирования и очистки амплифицированных фрагментов использовали набор Cleanup S-cap (“Евроген”, Россия).

Таблица 1.

Олигонуклеотиды, использованные в работе

Название Последовательность
POD17_For 5'-GCGAGGCCCAATCCCCTTA-3'
POD17_Rev 5'-CGGTCTGCTCGAACTTCTG-3'
BGASD 5'-CAAGCTGCTGAAGCTGAAGCTC-3'
BGASRS 5'-CTCATATTTACCCTGGCATGTCT-3'
VР2D 5'-TAGAAG ACCGGGCCACCTGCAGCG-3'
VP2DR 5'-TATCTCGAGTTAAGAGTTGAGGGGGCTAAAATCACA-3'
VP2RR 5'-TATCTCGAGTTAAGAGTTGAGGGGGATGGCC-3'

Обработанные эндонуклеазами ПЦР-фрагменты целевого гена и ДНК фрагмента вектора pPCGMX, несущего промотор гена bgaS с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид гена bgaS и терминатор bgaS, смешивали в молярном соотношении 3 : 1 и обрабатывали T4 DNA Ligase (“Thermo Fisher Scientific”, США). Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Escherichia coli XL-10 Gold (“Stratagene”, США) для наработки генетического материала. Клетки наращивали с последующим выделением плазмидных ДНК с помощью набора Plasmid Miniprep Color (“Евроген”, Россия). Полученные плазмиды проверяли электофорезом по подвижности в агарозном геле, а также проводили скрининг рестрикцией по сайтам XhoI и BamHI на присутствие фрагментов нужного размера. Проверку отобранных плазмид на правильность сборки и отсутствие ошибок в процессе ПЦР осуществляли секвенированием с использованием праймеров BGASD и BGASRS (табл.1).

Трансформация полученных конструкций в геном P. canescens. Плазмиды, несущие целевые последовательности вводили в геном мутантного по нитратредуктазе штамма P. canescens PCA-10 (niaD–) путем котрансформации в протопласты [22] совместно с плазмидой pSTA10 [25], несущей комплементирующий ген нитратредуктазы (niaD) гриба Aspergillus niger. Трансформанты, высевали на селективную агаризованную среду следующего состава (г/л): сорбитол – 218.6; агар – 20; глюкоза – 8; раствор микроэлементов – 50 мл/л, а также 10 мМ нитрат натрия в качестве источника азота.

Проверку полученных трансформантов на наличие целевых вставок проводили амплификацией целевых фрагментов с ДНК, полученных из споровых суспензий с применением специфических праймеров POD17_For и POD17_Rev (табл. 1).

Оценка оксидазной активности (ОА). ОА оценивали экспресс-методом при росте трансформантов на агаризованной среде МС, содержащей 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты)диаммониевую соль (АБТС) в качестве хромогенного субстрата (1.1 мг/мл). Трансформанты, образующие в процессе роста зеленое гало считались перспективными для дальнейшего анализа. ОА в КЖ определяли при выращивании грибов на жидкой среде ФС спектрофотометрически на спектрофотометре PerkinElmer Lambda 35 (“PerkinElmer”, США) при длине волны λ = = 436 нм в 0.1 М натрий-ацетатном буфере, рН 4.5, как описано в работе [19] с использованием раствора АБТС в качестве хромогенного субстрата в присутствии 0.1 мМ H2O2. За 1 условную единицу активности принимали увеличение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 мин.

Электрофорез белков. КЖ анализировали методом ДДС-электрофореза по методу Лэммли в 12%-ном полиакриламидном геле на приборе Mini Protean III (“Bio-Rad”, США) с окраской Кумасси бриллиантовым голубым R-250. В качестве стандарта использовали смеси белков Page Ruler™ Prestained Protein Ladder (“Fermentas”, Литва) в диапазоне 10–200 кДа.

Масс-спектрометрический анализ белков. Полученные белковые пятна анализировали на масс-спектрометре Ultraflex II (“Bruker”, Германия) с матричной лазерной десорбцией/ионизацией на источнике и тандемным времяпролетным масс-анализатором (MALDI TOF/TOF MS/MS). Масс-спектры обрабатывали с помощью пакета программ FlexAnalysis 3.3 (“Bruker Daltonics”, Германия), идентификацию белков – с помощью программы Mascot (www.matrixscience.com). Полученные данные были сопоставлены с базой данных белков T. hirsuta LE-BIN 072 (GeneBank: PRJNA271118) [26] и NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Белки-кандидаты с показателем достоверности >76 в базе данных NCBI считались надежными (p < 0.05), белки с показателем достоверности >50 считались вероятными.

Биотрансформация щелочного лигнина. КЖ концентрировали ультрафильтрацией на мембране Vivaspin Turbo, 10K MWCO (“Sartorius”, Германия) в 10 раз.

Биотрансформацию проводили как описано в [6] с некоторыми модификациями. Раствор щелочного лигнина (“Sigma-Aldrich”, США) с концентрацией 2 г/л, pH 5.0, разливали по 1 мл в пластиковые пробирки объемом 5 мл. Затем добавляли равный объем концентрированной КЖ. В качестве контроля также готовили образцы, где вместо лигнина добавляли стерильную воду. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 144 ч с перемешиванием на ротационном смесителе ELMI Rotamix RM-1 (Латвия). Обесцвечивание лигнина отслеживали в ходе инкубирования на 24, 72 и 144 ч, измеряя поглощение при 465 нм на спектрофотометре PerkinElmer Lambda 35 [27]. Спектры снимали в диапазоне 200–700 нм сразу после добавления лигнина к КЖ, а также через 24 и 144 ч инкубации.

Все измерения проводили в 3 биологических повторностях. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Статистическая обработка данных проводилась с использованием метода дисперсионного анализа. При обнаружении достоверного значения (р < 0.05) F-статистики, различия между индивидуальными средними были оценены с использованием теста множественного сравнения Тьюки (р ≤ 0.05).

Визуализацию плазмидных карт и подбор олигонуклеотидов осуществляли в программе Vector-NTI 10.1.1 (“Invitrogen”, США).

Для определения сайтов отщепления сигнального пептида пероксидаз использовали программное обеспечение SignalIP 6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для создания продуцента рекомбинантной универсальной пероксидазы VP2 базидиомицета T. hirsuta LE-BIN072 в качестве реципиента был использован штамм мицелиального гриба P. canescens PCA-10 (niaD–). Этот штамм обладал следующими преимуществами: быстрый рост биомассы, наличие развитой системы биосинтеза внеклеточных ферментов, сильные промоторы, обеспечивающие высокую экспрессию целевых генов, наличие эффективного метода трансформации целевых плазмид для этого штамма, мутация в гене нитратредуктазы (niaD-) [28], позволяющая отбирать трансформанты на селективной среде, а также возможность получения целевого белка в активной форме [20, 21].

Создание плазмидных конструкций. Поскольку регулирование экспрессии белка в аскомицетах происходит в основном на уровне транскрипции, использование высокоактивных областей контроля транскрипции грибов имеет решающее значение при гетерологичной экспрессии. При создании плазмид использовали промотор гена bgaS, кодирующий β-галактозидазу гриба P. canescens, обеспечивающий гетерологичную экспрессию ферментов в клетках гриба с высоким выходом [23, 28]. Ген пероксидазы экспрессировали с использованием сигнальной последовательности гена bgaS β-галактозидазы P. canescens.

Плазмиды были созданы на основе вектора pPCGMX, содержащего полный ген bgaS секретируемой β-галактозидазы P. canescens, имеющего уникальный сайт рестрикции Bsp120I в районе отщепления сигнального пептида и сайт XhoI перед терминатором транскрипции [29].

Интронированные и сплайсированные последовательности, кодирующие пероксидазу VP2 T. hirsuta LE-BIN072 (GenBank: ON230121.1) были амплифицированы, причем при амплификации в целевые последовательности вводили уникальные сайты рестрикции BpiI и XhoI. Для этого олигонуклеотиды были выбраны так, чтобы при последующей состыковке целевых фрагментов с областью, кодирующей сигнальный пептид β-галактозидазы, сохранялась рамка считывания и аминокислотная последовательность в месте соединения. В результате слияния полученных целевых ПЦР-фрагментов с ДНК фрагмента вектора pPCGMX, несущего промотор гена bgaS, с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид гена bgaS и терминатор bgaS, были получены целевые плазмиды. Проверка выделенных плазмид на правильность сборки рестрикцией и последующим секвенированием кодирующих областей пероксидазы позволила отобрать 2 плазмиды – pVP2D и pVP2CD, с правильной интронированной и сплайсированной кодирующей последовательностью соответственно. Карты отобранных плазмид представлены на рис. 1.

Рис. 1.

Карты полученных плазмидных конструкций, несущих интронировунную (а) и сплайсированную (б) кодирующие последовательности пероксидазы VP2 T. hirsuta LE-BIN072.

Отбор трансформантов. При трансформации полученных плазмид, несущих целевые последовательности пероксидазы, в геном P. canescens PCA-10 (niaD–), было получено не менее 100 трансформантов для каждой плазмиды. Для дальнейшего скрининга из них отбирали по 30 трансформантов для каждой плазмиды.

Выращивание отобранных трансформантов глубинным способом в среде ФС в течение 7 сут показало, что максимальная пероксидазная активность по АБТС в присутствии H2O2 (1 усл. ед./мл) была зафиксирована на 5–6 сут культивирования трансформантов. В качестве отрицательного контроля использовали КЖ реципиента. По 10 наиболее активных трансформантов-продуцентов рекомбинантной пероксидазы VP2 было выбрано для обоих штаммов (по 5 с плазмидой pVP2D и по 5 – с pVP2CD).

Для оптимизации процедуры подтверждения присутствия плазмид с целевыми вставками в отобранных трансформантах была проведена ПЦР-амплификация целевых областей с использованием ДНК, выделенной экспресс-методом из споровых суспензий каждого трансформанта [24]. Применение этого метода позволило ускорить процесс отбора целевых клонов. Результат оценивали методом электрофореза по подвижности в агарозном геле и размеру полученных фрагментов (пример, рис. 2а). По результатам амплификации было выбрано 2 трансформанта-продуцента VP2 – P. canescens pVP2D-6 и P. canescens pVP2D-8.

Рис. 2.

Электрофорез в агарозном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации со специфическими праймерами (а); ДДС-электрофорез в ПААГ (б) КЖ P. canescens (красным отмечена область, в которой найдены фрагменты VP2): К - реципиент P. canescens PCA10 (niaD–) (отрицательный контроль), 1 – трансформант P. canescens pVP2D-3, 2 – P. canescens pVP2D-6, 3 – P. canescens pVP2D-8, М – маркеры молекулярной массы.

Анализ КЖ трансформантов методом ДДС-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 2б) с последующей масс-спектрометрической идентификацией (MALDI TOF/TOF MS/MS) белков, обнаруженных в диапазоне 30–55 кДа позволил подтвердить наличие VP2 T. hirsuta LE-BIN072 в КЖ отобранных трансформантов P. canescens pVP2D-6 и P. canescens pVP2D-8.

Необходимо отметить, что в настоящей работе при создании продуцента рекомбинантной VP2 успешнее оказалась конструкция с интронированной кодирующей целевой последовательностью. Подобный результат был показан Абяновой и соавт. [21] при получении рекомбинантной лакказы А T. hirsuta LE-BIN072 в этом же реципиенте. Таким образом, можно сделать вывод, что в выбранном штамме P. canescens происходит правильный сплайсинг интронов в полном гене VP2 пероксидазы, как и в случае гена lacA лакказы базидиального гриба T. hirsuta. Однако полученные результаты не исключают наличие особенностей посттрансляционных модификаций и секреции пероксидаз в P. canescens, оказывающих влияние на активность целевого фермента. Активность полученной КЖ по АБТС в присутствии Н2О2 не превышала 1 усл. ед. /мл (рис. 3).

Рис. 3.

Динамика активности пероксидазы (по АБТС в присутствии Н2О2) у отобранных рекомбинантных штаммов: 1 – реципиент P. canescens PCA10 (niaD–) (отрицательный контроль), 2 – трансформант P. canescens pVP2D-6, 3 – трансформант P. canescens pVP2D-8.

Таким образом, использованную экспрессионную систему можно считать достаточно эффективной с точки зрения получения секретируемого рекомбинантного изофермента пероксидазы VP2. Однако требуются дополнительные эксперименты по оптимизации условий культивирования с целью повышения активности и количества секретируемого белка. В дальнейшей работе использовали штамм P. canescens pVP2D-6 как более активный.

Биотрансформация щелочного лигнина. Поскольку пероксидазам отводят ведущую роль в процессе деструкции лигнина [6, 30], была проведена оценка способности секретируемых ферментов нового штамма P. canescens pVP2D-6, включающих пероксидазу VP2 T. hirsuta, к модификации щелочного лигнина.

Структура лигнина включает мономерные звенья трех типов – п-гидроксифенильные (H-звенья), гваяцильные (G-звенья), и сирингильные (S-звенья), сшитые различными кислород- и углерод-углеродными связями [31]. Хромофорные функциональные группы, содержащиеся в лигнине, включая хиноны и метоксизамещенные фенокси-группы, могут быть сопряжены с двойными связями или карбонильными функциональными группами. Ненасыщенные функциональные группы поглощают видимый свет и придают лигнину коричневый цвет [32]. Обесцвечивание лигнина предполагает его трансформацию [33].

В настоящей работе к концентрированной КЖ, полученной после выращивания нового штамма P. canescens pVP2D-6, добавляли раствор лигнина в соотношении 1 : 1 и инкубировали в течение 144 ч. Концентрация лигнина в реакционной смеси составила 1 г/л, при этом реакционная смесь имела насыщенный желто-коричневый цвет (рис. 4, 1). По мере увеличения времени инкубирования наблюдалось обесцвечивание реакционной смеси (рис. 4 2, 3), которое не наблюдали в контрольном образце (с КЖ реципиента). Уже за сутки происходило обесцвечивание реакционной смеси на 11%, а через 144 ч – на 28% по сравнению с исходным.

Рис. 4.

Обесцвечивание щелочного лигнина в КЖ гриба P. canescens pVP2D-8: 1 – исследуемый образец лигнина сразу после добавления концентрата КЖ, 2 – через 24 ч инкубирования, 3 – через 144 ч инкубирования.

Известно, что для различных типов лигнина характерно наличие локального максимума в УФ-спектре поглощения при 280 нм [31]. Изменение поглощения при 280 нм при биотрансформации лигнина, в частности мицелиальными грибами, считается показателем его модификации. Ранее Лара с соавт. [33] показали уменьшение интенсивности поглощения при длине волны 280 нм (гипохромный эффект) в процессе инкубирования синтетического черного щелока, содержание лигнина в котором может составлять до 40%, с мицелием Trametes elegans в течение 15 сут, объяснив это “изменениями в молекулах за счет лигнинолитических реакций”.

В настоящем исследовании при увеличении времени инкубации исследуемых образцов с КЖ штамма P. canescens pVP2D-6 наблюдалось некоторое изменение поглощения в диапазоне 260–500 нм (рис. 5), однако, несмотря на видимое обесцвечивание реакционной смеси, в спектре при 280 нм вместо ожидаемого уменьшения через 24 ч наблюдалось незначительное увеличение оптической плотности, которое сохранялось до конца инкубации (144 ч). Аналогичные эффекты наблюдали при окислении катехина и кверцетина (полифенольных соединений из группы флавоноидов) рекомбинантной универсальной пероксидазой TvVP2 базидиомицета Trametes versicolor [34]. Авторы показали, что инкубация этих флавоноидов с пероксидазой TvVP2 в присутствии пероксида водорода приводила к значительным изменениям оптического спектра. В случае катехина наблюдали значительное увеличение ОП около 400 нм, что свидетельствовало об образовании хинонов, а в случае кверцетина – уменьшение пика при 370 нм и небольшое увеличение поглощения ~290 нм. Последнее, по мнению авторов, могло соответствовать продукции 3,4-дигидроксибензойной (протокатеховой) кислоты.

Рис. 5.

УФ-спектры поглощения исследуемых образцов в диапазоне 260–320 нм: 1 – исследуемый образец лигнина сразу после добавления концентрата КЖ, 2 – через 24 ч инкубирования, 3 – через 144 ч инкубирования.

Известно, что универсальные пероксидазы грибов белой гнили способны напрямую окислять фенольные и нефенольные структурные единицы лигнина с образованием катион-радикалов, которые затем могут, как подвергаться серии неферментативных реакций, включая расщепление С–С и С–О-связей, так и сочетаться между собой в случайном порядке, приводя к реполимеризации лигнина [11, 30, 35].

В работе [11] авторами было показано, что универсальная пероксидаза базидиомицета Pleurotus ostreatus способна расщеплять наиболее частые межзвенные связи в лигнине (β-O-4'), приводя тем самым к деполимеризации лигнина и высвобождению фенольных соединений. Образующиеся при биотрансформации лигнина промежуточные фенольные соединения, такие как ванилин, синаповая кислота, конифериловый спирт и др. [36], могут вносить вклад в интенсивность поглощения реакционной смеси при 280 нм.

В работе [35] было показано, что атака универсальной пероксидазы базидиомицета P. eryngii (VPL2, GenBank: AF007222) начинается с наиболее легко окисляемых фенольных фрагментов лигнина, а метилированный и ацетилированный лигнин значительно хуже окислялись ферментом. При этом VP P. eryngii была способна модифицировать также и нефенольный лигнин, но значительно хуже, чем содержащий фенольные структуры. Кроме того, VP P. eryngii проявляла более высокое сродство в отношении полимерного лигнина, чем к простым ароматическим соединениям [35]. Действительно, ранее было показано, что секреция лигнолитических пероксидаз в процессе роста гриба T. hirsuta в среде с добавлением лигнина менялась волнообразно [37]. При этом универсальная пероксидаза VP2 начинала секретироваться на более ранних сроках культивирования и уже на 3–6 сут хорошо детектировалась в культуральной среде. Далее по мере трансформации лигнина в секретоме гриба детектировались и другие лигнолитические пероксидазы (разные изоферменты марганец-пероксидаз).

Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты позволили сделать вывод, что рекомбинантная универсальная пероксидаза VP2 гриба белой гнили T. hirsuta модифицировала структурные звенья щелочного лигнина, о чем свидетельствовало обесцвечивание реакционной смеси. Однако этот фермент, по всей видимости, подобно универсальной пероксидазе VP базидиомицета P. eryngii, окислял в первую очередь фенольные фрагменты лигнина.

Полученный в работе новый штамм P. canescens pVP2D-6 – продуцент рекомбинантной лигнолитической пероксидазы VP2 базидиомицета T. hirsuta LE-BIN072, планируется использовать для выделения целевого изофермента VP2 и изучения его свойств, что в дальнейшем может помочь более детально установить механизм биоразложения лигнина грибами белой гнили Trametes sp., тем самым открыть новые перспективы для направленного применения ферментов лигнолитического комплекса грибов, в частности пероксидаз.

При проведении исследований использовалось оборудование Центра коллективного пользования “Промышленные биотехнологии” Федерального государственного учреждения “Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук”.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 22-74-00078, https://rscf.ru/project/22-74-00078.

Список литературы

  1. Ponnusamy V.K., Nguyen D.D., Dharmaraja J., Shobana S., Banu J.R., Saratale R.G. et al. // Bioresour. Technol. 2019. V. 271. P. 462–472. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2018.09.070

  2. Biko O. D.V., Viljoen-Bloom M., van Zyl W. H. // Enzyme Microb. 2021. V. 141, 109669. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2020.109669

  3. Kainthola J., Podder A., Fechner M., Goel R. // Bioresour. Technol. 2021. V. 321. 124397. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124397

  4. Abbas A., Koc H., Liu F., Tien M. // Curr Genet. 2005. V. 47. P. 49–56. https://doi.org/10.1007/s00294-004-0550-4

  5. Dashtban M., Schraft H., Syed T.A., Qin W. // Int. J. Biochem. Mol. Biol. 2010. V. 1. P. 36–50.

  6. Zhang S., Xiao J., Wanga G., Chen G. // Bioresour. Technol. 2020. V. 304. 122975. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.122975

  7. Liers C., Aranda E., Strittmatter E., Piontek K., Plattner D.A., Zorn H. et al. // J. Mol. Catal. B Enzym. 2014. V. 103. P. 41–46. https://doi.org/10.1016/j.molcatb.2013.09.025

  8. Moiseenko K.V., Glazunova O.A., Savinova O.S., Vasina D.V., Zherebker A.Ya., Kulikova N.A. et al. // Bioresour. Technol. 2021. V. 335. 125229. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125229

  9. Vasina D.V., Moiseenko K.V., Fedorova T.V., Tyazhelova T.V. // PLoS ONE. 2017. V. 12. № 3. e0173813. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173813

  10. Savinova O.S., Shabaev A.V., Glazunova O.A., Moiseenko K.V., Fedorova T.V. // Appl. Biochem. Microbiol. 2022. V. 58. Suppl. 1. P. S113–S125.

  11. Fernández-Fueyo E., Ruiz-Dueñas F.J., Martínez M.J., Romero A., Hammel K.E., Medrano F.J., Martínez A.T. // Biotechnol. Biofuels. 2014. V. 7. № 2. https://doi.org/10.1186/1754-6834-7-2

  12. Ruiz-Duenas F.J., Morales M., Garcia E., Miki Y., Martinez M.J., Martinez A.T. // J. Exp. Bot. 2009. V. 60. № 2. P. 441–452. https://doi.org/10.1093/jxb/ern261

  13. Rodakiewicz-Nowak J., Jarosz-Wilkolazka A., Luterek J. // Applied Catalysis A: General. 2006. V. 308. P. 56–61.

  14. Perez-Boada M., Doyle W.A., Ruiz-Duenas F.J., Martinez M.J., Martinez A.T. // Enzyme Microb. Technol. 2002. V. 30. P. 518–524.

  15. Majekea B.M., García-Aparicioa M., Biko O.D, Viljoen-Bloom M., van Zyl W.H., Görgensa J.F. // Enzyme Microb. 2020. V. 139. 109593.https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2020.109593

  16. Stewart P., Whitwam R. E., Kersten P. J., Cullen D., Tien M. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. № 3. P. 860–864. https://doi.org/10.1128/aem.62.3.860-864.1996

  17. Sugano Y., Nakano R., Sasaki K., Shoda M. // Physiology and Biotechnology. 2000. V. 66. № 4. https://doi.org/10.1128/AEM.66.4.1754-1758.2000

  18. Chekushina A.V., Dotsenko G.S., Sinitsyn A.P. // Catalysis in Industry. 2013. V. 5 № 1. P. 98–104. https://doi.org/10.1134/S2070050413010042

  19. Savinova O.S., Moiseenko K.V., Vavilova E.A., Tyazhelova T.V., Vasina D.V. // Biochimie. 2017. V. 142. P. 183–190. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2017.09.013

  20. Savinova O.S., Moiseenko K.V., Vavilova E.A., Chulkin A.M., Fedorova T.V., Tyazhelova T.V., Vasina D.V. // Front. Microbiol. 2019. V. 10. 152. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00152

  21. Abyanova A.R., Chulkin A.M., Vavilova E.A., Fedorova T.V., Loginov D.S., Koroleva O.V., Benevolensky S.V. // Appl. Biochem. Microbiol. 2010. V. 46. № 3. P. 313–317.

  22. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuck A.J. // Curr. Genet. 1995. V. 28. P. 474–478.

  23. Чулкин А.М., Логинов Д.С., Вавилова Е.А., Абянова А.Р., Зоров И.Н., Курзеев С.А., Королева О.В., Беневоленский С.В. // Прикл. биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. № 2. С. 163–170.

  24. Fraczek M.G., Zhao C., Dineen L., Lebedinec R., Bowyer P., Bromley D., Delneri M. Current Protocols in Microbiology. 2019. V. 54. e89. https://doi.org/10.1002/cpmc.89

  25. Unkles S.E., Campbell E.I., Punt P.J., Hawker K.L., Contreras R., Hawkins A.R. et al. // Gene. 1992. V. 111. № 2. P. 149–155.

  26. Shabaev A.V., Moiseenko K.V., Glazunova O.A., Savinova O.S., Fedorova T.V. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. № 10322. https://doi.org/10.3390/ ijms231810322

  27. Лисов А.В., Заварзина А.Г., Белова О.В., Леонтьевский А.А. // Микробиология. 2020. Т. 89. № 3. С. 300–307. https://doi.org/10.31857/S0026365620030118

  28. Sinitsyn A.P., Rozhkova A.M. Microorganisms in Biorefineries. Penicillium canescens Host as the Platform for Development of a New Recombinant Strain Producers of Carbohydrases. / Ed. B. Kamm Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2015. V. 26. P. 1–19.

  29. Королева О.В., Федорова Т.В., Беневоленский С.В., Вавилова Е.А., Чулкин А.М. // Патент РФ. 2015. № 2538149.

  30. Айзенштадт М.А., Боголицын К.Г. // Химия растительного сырья. 2009. № 2. С. 5–18.

  31. Ruwoldt J., Tanase-Opedal M., Syverud K. // ACS Omega. 2022. V. 7. P. 46371–46383.https://doi.org/10.1021/acsomega.2c04982

  32. Sadeghifar H., Ragauskas A. // Polymers. 2020. V. 12. № 5. P. 1134. https://doi.org/10.3390/polym12051134

  33. Lara M.A., Rodriguez-Malaver A.J., Rojas O.J., Holmquist O., Gonzalez A.M., Bullon J., Penaloza N., Araujo E. // International Biodeterioration & Biodegradation. 2003. V. 52. P. 167–173. https://doi.org/10.1016/S0964-8305(03)00055-6

  34. Amara S., Perrot T., Navarro D., Deroy A., Benkhelfallah A., Chalak A. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2018. V. 84. e02826-17. https://doi.org/10.1128/AEM.02826-17

  35. Sáez-Jiménez V., Rencoret J., Rodríguez-Carvajal M.A., Gutiérrez A., Ruiz-Dueñas F.J., Martínez A.T. // Biotechnol Biofuels. 2016. V. 9. P. 198. doi.org/https://doi.org/10.1186/s13068-016-0615-x

  36. Silva D., Sousa A.C., Robalo M.P., Martins L.O. // New Biotechnology. 2022. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2022.12.003

  37. Moiseenko K.V., Glazunova O.A., Savinova O.S., Vasina D.V., Zherebker A.Ya., Kulikova N.A., Nikolaev E.N., Fedorova T.V. // Bioresour. Technol. 2021. V. 335. 125229. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125229

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал