Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 6, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 6, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 6, стр. 622-630

Микробиологическое 1,2-дегидрирование 11-трифторацетата 6α-метилгидрокортизона

Т. С. Савинова 1, *, А. Ю. Аринбасарова 2, А. В. Казанцев 3, О. С. Савинова 4, Н. В. Лукашёв 3

1 Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
141014 город Мытищи, городской округ Мытищи, Московская область, Россия

2 Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН)
142290 Пущино, Московская область, Россия

3 Химический факультет, Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова
119991 Москва, Россия

4 Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

* E-mail: tatiana_savinova@rambler.ru

Поступила в редакцию 17.06.2023
После доработки 29.06.2023
Принята к публикации 03.07.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведена трансформация 11-трифторацетата 6α-метилгидрокортизона (11-ТФА МГК) клетками актинобактерий рода Arthrobacter (Nocardioides) в присутствии α-циклодекстрина (α-ЦД). Изучен состав и динамика накопления в культуральной среде продуктов трансформации при различных значениях рН и соотношении α-ЦД/субстрат. Показано, что добавление α-ЦД в среду для трансформации при рН < 7 способствует увеличению скорости 1,2-дегидрирования с образованием 11-трифторацетата 6α-метилпреднизолона (11-ТФА МПЛ). При рН > 7 первичным процессом является гидролиз 11β-трифторацетилоксигруппы. При этом можно предположить, что α-ЦД участвует в этих процессах как акцептор трифторацетил-иона.

Ключевые слова: 6α-метилгидрокортизона 11-трифторацетат, 6α-метилпреднизолона 11-трифтор-ацетат, 6α-метилпреднизолон, 1,2-дегидрирование, Arthrobacter, Nocardioides, α-циклодекстрин

Известно, что 1,2-дегидропроизводные Δ4-3-кетостероидов, применяемые в качестве активных фармацевтических ингредиентов (АФИ) лекарственных препаратов, например, кортикостероидов, проявляют больший терапевтический эффект с меньшим побочным действием по сравнению с 1,2-насыщенным предшественником. Так, 6α-метилпреднизолон (11β,17α,21-тригидрокси-6α-метилпрегна-1,4-диен-3,20-дион, МПЛ) фармакологически более эффективен по сравнению с 6α-метилгидрокортизоном (11β,17α,21-тригидрокси-6α-метилпрегн-4-ен-3,20-дион, МГК) [1], который в качестве АФИ не применяется. МПЛ – 1,2-дегидропроизводное МГК – является АФИ лекарственных средств для лечения воспалительных, аллергических, онкологических и других заболеваний. В медицинской практике широкое применение получили эфиры МПЛ, такие как 21-ацетат, 21-сукцината натриевая соль, а также ацепонат – 17-пропионилокси-производное 21-ацетата МПЛ [https://www.rlsnet.ru].

МПЛ получают преимущественно реакцией микробиологического 1,2-дегидрирования МГК, используя в качестве биокатализатора различные бактерии, способные продуцировать 3-кетостероид-∆1-дегидрогеназу (3-КСД) (К.Ф. 1.3.99.4). Трансформацию проводят, как правило, покоящимися клетками, используя в качестве среды буферные растворы со значением рН в диапазоне 6.8–7.5 [2–4].

В последние годы большое значение приобрело изучение микробиологического 1,2-дегидрирования 21-ацетокси-производных Δ4-3-кетостероидов с диоксиацетоновой боковой цепью [5–8]. Известно, что в процессе микробиологической трансформации возможно элиминирование сложноэфирной защиты гидроксила при С21, которое может происходить в результате действия эстераз в широком диапазоне значений рН [7, 9]. Однако также известно, что в зависимости от условий проведения процесса биотрансформация может протекать с сохранением сложноэфирной группировки. В связи с этим большое значение приобретает изучение микробиологического 1,2-дегидрирования этерифицированных субстратов с целью сохранения не только 21-ацетокси-группы [7, 8, 10, 11], но и других сложноэфирных защитных групп. Поскольку МПЛ применяется в медицинской практике в виде С21-эфиров, большой интерес уделяется изучению 1,2-дегидрирования С21-эфиров МГК. Известны, в частности, работы по синтезу 21-ацетата МПЛ из 21-ацетата МГК [3, 5, 6].

В химическом синтезе ацепоната МПЛ из МПЛ или 21-ацетата МПЛ важным условием этерификации третичной гидроксильной группы при С17 является защита вторичного гидроксила при С11 [12]. Наиболее предпочтительным для этой цели служит образование 11-трифторацетил-окси-защитной группы, которая легко удаляется основным сольволизом в мягких условиях [12–14]. 11-Трифторацетилокси-защита, как было показано ранее [14], является наиболее приемлемой и в химическом синтезе 6α-метил-производных, в частности МГК из гидрокортизона (ГК) [15, 16]. Причем удаление защитных группировок, включая 11-трифторацетильную, происходит на последней стадии его синтеза. Становится очевидным, что 11-трифторацетат МГК (11-ТФА МГК, рис. 1, 1) можно рассматривать как потенциальный субстрат для дальнейшего 1,2-дегидрирования как с образованием 11-трифторацетата МПЛ (11-ТФА МПЛ, 2), так и его гидролизованного аналога МПЛ (3).

Рис. 1.

Схема трансформации 11-ТФА МГК (I) клетками A. globiformis ВКПМ Ac-1528.

Ранее [16] была показана возможность микробиологического 1,2-дегидрирования производных МГК со сложноэфирной группой при атоме С11 в присутствии β-циклодекстрина (β-ЦД). Применение β-ЦД или его производных для увеличения растворимости стероидных субстратов в водной среде детально изучено и применяется в биотехнологических производствах [17, 18]. Известно, что растворимость стероидов в водных растворах в присутствии циклодекстринов (ЦД) может быть увеличена в 2–1200 раз [9]. Следует отметить, что растворимость α-ЦД в воде составляет 14.5% (вес/об.), что значительно превышает таковую β-ЦД (1.85%, вес/об.) [19]. Однако в отличие от β-ЦД в качестве солюбилизирующего агента в процессах микробиологического 1,2-дегидрирования стероидов рядов андростана и прегнана α-ЦД применяется намного реже. Описано применение α-ЦД в микробиологическом синтезе преднизолона (ПЛ) из ГК (содержание 2 г/л) культурой Arthrobacter simplex [20].

Цель настоящей работы – изучение 1,2-дегидрирования 11β-трифторацетилокси-17α,21-дигидрокси-6α-метилпрегн-4-ен-3,20-диона (11-ТФА МГК, 1) бактериями Arthrobacter globiformis ВКПМ Ac-1528 (193) (син. Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д) [21, 22] при различных значениях рН, а также в присутствии в среде α-ЦД.

МЕТОДИКА

Реактивы. В работе были использованы следующие реактивы: α-ЦД (≥98.0% (HPLC), CAS № 10016-20-3, “Sigma-Aldrich”, США), 21-ацетат кортизона (≥99.0%, CAS № 50-04-4, “Sigma-Aldrich”, США), 6α-метилпреднизолон (≥98%, CAS № 83-43-2, “Sigma-Aldrich”, США); 6α-метилгидрокортизон (98.92%, CAS № 1625-39-4, “SynZeal Research Pvt”, Индия).

11-ТФА МГК (1) был получен из 21-ацетата ГК, как описано в патенте [23]. 11-ТФА МПЛ (2) был получен 1,2-дегидрированием 11-ТФА МГК (1) клетками Nocardioides simplex VКМ Ас-1118 в присутствии β-ЦД, как описано в патенте [16]. 11β,17α,20β,21-Тетрагидрокси-6α-метилпрегна-1,4-диен-3-он (20β-ОН-МПЛ, 5) был получен известным методом стереоспецифического восстановления 20-кетогруппы МПЛ до гидроксильной группы действием NaBH4 [24].

Другие материалы и растворители квалификации “х. ч.” и “ч. д. а.” были приобретены у российских поставщиков ООО “АО Реахим” и ООО “Компонент-Реактив”.

Микроорганизм и условия культивирования. В работе использовали актинобактерии A. globifor-mis ВКПМ Ac-1528 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ “Курчатовский институт” Национального Биоресурсного Центра (Россия). Штамм поддерживали на скошенной агаризованной кукурузно-глюкозной среде следующего состава (г/л): глюкоза –10, кукурузный экстракт –10, вода водопроводная, рН 7.0–7.2. Выращивание проводили в течение 5 сут при температуре 30°С.

Выращивание инокулята. Клетки, выросшие на агаризованной среде, смывали стерильной ди- стиллированной водой, суспензию клеток вносили по 1–2 мл в колбы Эрленмейера (750 мл) со 100 мл кукурузно-глюкозной среды того же состава (рН 7.0–7.2) и инкубировали на качалке (200–220 об./мин) при температуре 29°С в течение16–20 ч.

Выращивание трансформирующей культуры. Полученный инокулят использовали для выращивания трансформирующей культуры. В колбы Эрленмейера (750 мл), содержащие по 100 мл кукурузно-глюкозной среды того же состава (рН 7.0–7.2), стерильно вносили по 1–2 мл полученной суспензии клеток и инкубировали на качалке (220 об./мин) при температуре 29°С в течение 16 ч. В качестве индуктора 3-КСД использовали 21-ацетат кортизона, который добавляли в виде раствора в этаноле (150 мг/л) за 5 ч до окончания процесса роста клеток.

Клетки отделяли от среды центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин, дважды промывали 0.01 М Na-фосфатным буфером (рН 7.2) и затем ресуспендировали в том же буфере. При этом концентрация клеток составляла 50 мг/мл (сухой вес). Суспензию использовали в дальнейшей работе для проведения процесса 1,2-дегидрирования.

Трансформация 11-ТФА МГК (1). Трансформацию 11-ТФА МГК (1) проводили отмытыми клетками в колбах Эрленмейера (250 мл), содержащих по 25 мл 0.01 М Na-фосфатного буфера (рН 6.5 или 7.5) в качестве реакционной среды на качалке (200–220 об./мин) при температуре 29°С. Концентрация клеток составляла 1 г/л (по сухой биомассе). α-ЦД вносили в виде порошка в концентрации 1.0 или 3.0 г/л до внесения субстрата.

Субстрат (1) вносили в виде раствора в метаноле (MeOH) в концентрации 80 мг/мл. Конечная концентрация субстрата в среде составляла 0.5 г/л, а концентрация MeOH не превышала 5%.

Мониторинг процесса трансформации проводили, отбирая пробы из реакционной среды. Пробы экстрагировали этилацетатом (ЭА) в соотношении ЭА : проба – 4 : 1, об./об. Экстракт обрабатывали активированным углем и упаривали досуха. В сухом остатке определяли состав и содержание продуктов трансформации, используя методы ТСХ и ВЭЖХ. Хроматографический анализ соединений 1–5 (рис. 1) проводили на пластинках ПТСХ-АФ-В-УФ “Sorbfil UV-254” (Россия) в системе бензол : ацетон (3 : 1, об./об.). После просмотра в УФ-свете хроматограммы опрыскивали 1%-ным раствором ванилина в 10%-ном растворе хлорной кислоты, проявляли при температуре 100–110°С. В качестве контрольных образцов использовали соединения известной структуры, а именно, 11-ТФА МГК (1), 11-ТФА МПЛ (2), МПЛ (3), МГК (4) и 20β-ОН-МПЛ (5).

Для разделения смесей стероидов использовали хроматографическую колонку с 50-кратным количеством силикагеля “Merck” (0.040–0.063 мм, Германия) по отношению к массе сухого остатка. Продукты трансформации элюировали смесью дихлорметана (ДХМ) и метилэтилкетона (МЭК) с содержанием МЭК от 0 до 20%, растворитель упаривали.

Спектры 1Н-ЯМР соединений снимали на спектрометре “Bruker Avance 400” (США) с рабочей частотой 400 МГц в растворе дейтерохлороформа (CDCl3). В качестве внутреннего стандарта использовали гексаметилдисилоксан.

11-ТФА МГК (1):

1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5.75 (д, J = 1.5 Гц, 1H, 4-H), 5.67 (м, 1H, 11α-Н), 4.63 (дд, J = 20.0, 4.7 Гц, 1Н, 21-СН2), 4.25 (дд, J = 20.0, 4.3 Гц, 1Н, 21-СН2), 1.24 (с, 3Н, 19-СН3), 1.08 (д, J = 6.4 Гц, 3Н, 6α-СН3), 0.81 (с, 3Н, 18-СН3).

11-ТФА МПЛ (2):

1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 6.85 (д, J = 10.1 Гц, 1H, 1-Н), 6.29 (дд, J = 10.1, 1.5 Гц, 1Н, 2-Н), 6.03 (уш.с, 1H, 4-H), 5.70 (м, 1H, 11α-Н), 4.63 (дд, J = = 20.1, 3.9 Гц, 1Н, 21-СН2), 4.24 (дд, J = 20.0, 3.8 Гц, 1Н, 21-СН2), 1.25 (с, 3Н, 19-СН3), 1.13 (д, J = 6.3 Гц, 3Н, 6α-СН3), 0.81 (с, 3Н, 18-СН3).

МПЛ (3):

1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 7.24 (д, J = 10.1 Гц, 1H, 1-Н), 6.28 (дд, J = 10.1, 1.5 Гц, 1Н, 2-Н), 6.02 (уш.с., 1H, 4-H), 4.63 (дд, J = 19.1, 5.9 Гц, 1Н, 21-СН2), 4.49 (м, 1H, 11α-Н), 4.28 (дд, J = 19.1, 5.8 Гц, 1Н, 21-СН2), 1.44 (с, 3Н, 19-СН3), 1.12 (д, J = 6.3 Гц, 3Н, 6α-СН3), 0.96 (с, 3Н, 18-СН3).

МГК (4):

1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5.71 (уш.с, 1H, 4-H), 4.64 (д, J = 19.8, Гц, 1Н, 21-СН2), 4.47 (м, 1H, 11α-Н), 4.29 (д, J = 19.8, 1Н, 21-СН2), 1.41 (с, 3Н, 19-СН3), 1.05 (д, J = 6.3 Гц, 3Н, 6α-СН3), 0.94 (с, 3Н, 18-СН3).

20β-ОН-МПЛ (5):

1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 7.27 (д, J = 10.1 Гц, 1H, 1-Н), 6.26 (дд, J = 10.1, 1.5 Гц, 1Н, 2-Н), 6.02 (уш.с., 1H, 4-H), 4.43 (м, 1H, 11α-Н), 3.84–3.75 (м, 3Н, 20α-H, 21-CH2), 1.45 (с, 3Н, 19-СН3), 1.11 (д, J = 6.3 Гц, 3Н, 6α-СН3), 1.09 (с, 3Н, 18-СН3).

Использовали систему ВЭЖХ “Knauer Smartline” (Германия), снабженную инжектором, УФ-детектором с переменной длиной волны, блоком термостатирования колонки, компьютером, и колонку “Kromasil® 100-5C18” 4.6 × 250 мм, размер частиц 5 мкм (“Eka Chemicals AB”, Швеция). Подвижная фаза: ацетонитрил–Н2О в соотношении 40 : 60 об./об. Скорость потока: 1 мл/мин. Детектирование: УФ, длина волны 254 нм.

Времена удерживания: 11-ТФА МГК (1) – 18.3 мин, 11-ТФА МПЛ (2) – 17.2 мин, МПЛ (3) – 6.1 мин, МГК (4) – 6.7 мин, 20β-ОН-МПЛ (5) – 2.8 мин.

Изучение влияния рН трансформационной среды без трансформирующей культуры как в присутствии в среде α-ЦД, так и без α-ЦД (контроль) проводили в колбах Эрленмейера (250 мл), содержащих по 25 мл 0.01 М Na-фосфатного буфера (рН 6.5 или 7.5). α-ЦД вносили в виде порошка в концентрации 3.0 г/л. Субстрат (1) вносили в виде метанольного раствора в конечной концентрации 0.5 г/л. Реакционные смеси инкубировали на качалке (220 об./мин) в течение 4 сут при температуре 29°С, после чего оценивали содержание стероидов. Для этого содержимое колб экстрагировали ЭА, используя соотношение ЭА : проба (4 : 1, об./об.). Растворитель упаривали до прекращения погона, остаток растворяли в 1 мл смеси ДХМ : MeOH (3 : 1, об./.об). Содержание стероидных соединений оценивали методом количественной ТСХ с применением денситометрического анализа в программе Sorbfil TLC View.

Все эксперименты проводили в 3 биологических повторностях. Статистическая обработка данных проводилась с использованием метода дисперсионного анализа. При обнаружении достоверного значения (р < 0.05) F-статистики, различия между индивидуальными средними были оценены с использованием теста множественного сравнения Тьюки (р ≤ 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что молекулярное инкапсулирование субстрата в полости ЦД существенно зависит не только от структуры гостевой молекулы, но и размера полости циклического олигомера глюкозы. Стероидные соединения могут образовывать комплексы (1 : 1) с β-ЦД и γ-ЦД [25]. Описано образование комплексов включения терпеноидов с β-ЦД в эквимолярном соотношении гость-хозяин (1 : 1) [26]. Однако было обнаружено, что в отличие, например, от прогестерона (ПГ) полному погружению молекулы ГК, отличающейся от ПГ наличием гидроксильных групп при атомах С11 и С21, в полость β-ЦД, содержащего 7 глюкопиранозных звеньев, препятствовали полярные гидроксильные группы на его поверхности [25]. Тхи и соавт. [27] показали, что возможно образование комплекса включения МПЛ с γ-ЦД (8 звеньев глюкопиранозы) и гидроксипропил γ-ЦД за счет включения колец A и B в полость этих ЦД, так как они обладают полостями большего размера. В литературных источниках имеется скудная информация по применению α-ЦД, содержащего 6 глюкопиранозных звеньев, для интенсификации процессов биотрансформации стероидных соединений, в частности 1,2-дегидрирования кортикостероидов. Описано образование комплекса включения α-ЦД с β-ситостерином, при этом максимальная эффективность инкапсулирования достигала 87% при использовании α-ЦД и β-ситостерина в мольном соотношении 2 : 1 [28]. В патенте [20] описано получение преднизолона из ГК с высоким выходом с использованием культуры Arthrobacter simplex (ATCC 6946) с концентрацией субстрата 2 г/л в присутствии α-ЦД при соотношении α-ЦД: ГК, равном 10 : 1 (вес/вес) или ~3.5 : 1 (моль/моль). При этом авторы отмечали, что в присутствии α-ЦД имело место ингибирование осаждения субстрата в водной среде, что приводило к увеличению скорости реакции.

В настоящей работе было проведено изучение микробиологического 1,2-дегидрирования 11-ТФА МГК культурой A. globiformis ВКПМ Ac-1528 при концентрации субстрата 0.5 г/л и значениях рН 6.5 и 7.5. Изучено влияние α-ЦД в мольном соотношении к исходному субстрату 1 : 1 и 3 : 1 при рН 6.5.

Схема микробиологического превращения 11-ТФА МГК (1) бактериями A. globiformis ВКПM Ac-1528 представлена на рис. 1.

Динамика накопления продуктов микробиологического превращения 11-ТФА МГК (1) представлена на рис. 2 и 3.

Рис. 2.

Динамика накопления продуктов трансформации 11-ТФА МГК бактериями A. globiformis ВКПМ Ac-1528 при рН 7.5 в присутствии α-ЦД (11-ТФА МГК: α-ЦД = 1 : 3): 1 – 11-ТФА МГК; 3 – МПЛ; 4 – МГК; 5 – 20β-ОН-МПЛ.

Рис. 3.

Динамика накопления продуктов трансформации 11-ТФА МГК бактериями A. globiformis ВКПМ Ac-1528 при рН 6.5: 1 – 11-ТФА МГК; 2 – 11-ТФА МПЛ; 3 – МПЛ; 5 – 20β-ОН-МПЛ. а – без α-ЦД; б – 11-ТФА МГК: α-ЦД = 1 : 3; в – 11-ТФА МГК: α-ЦД = 1 : 1.

Биотрансформация 11-ТФА МГК (1) при рН 7.5 и мольном соотношении α-ЦД : субстрат (1) – 3 : 1. При значении рН среды для трансформации 7.5 происходило накопление в среде МГК (4) – продукта деэтерификации гидроксильной группы при атоме С11, МПЛ (3) и продукта его последующего 1,2-дегидрирования – МПЛ (3). Так, в указанных условиях (при рН 7.5 в присутствии α-ЦД) за 4 сут клетки бактерий превращали исходный субстрат (1) на ~74%, при этом накопление МПЛ (3) составляло ~ 47%, МГК (4) - 34%, а продукта восстановления 20-кетогруппы (5) - 11.5% (табл. 1, рис. 2). Биотрансформации 11-ТФА МГК (1) с меньшим количеством α-ЦД (1 : 1, моль/моль к субстрату) или без добавления α-ЦД в трансформационную среду также протекали через первичное образование МГК (4) с последующим его превра-щением в МПЛ (3) и далее в 20β-ОН-МПЛ (5). Аналогичная последовательность превращений была отмечена ранее [31] при проведении микро-биологического 1.2-дегидрирования ГК клетками A. globiformis с образованием ПЛ и его 20β-ОН- производного. Контрольный эксперимент (без применения клеток в качестве биокатализатора) показал, что при рН 7.5 происходил гидролиз трифторацетатной группы субстрата (1) с образованием соединения (4). В отсутствие α-ЦД в тех же условиях наблюдалось образование гораздо меньшего количества МГК (4), чем в присутствии α-ЦД (5 и 7.5% соответственно). То есть при рН > 7 первичным процессом является неэнзиматический гидролиз трифторацетилоксигруппы при С11, который ускоряется в присутствии α-ЦД. Эти данные согласуются с литературными данными, согласно которым циклодекстрины способны ускорять гидролиз сложных эфиров в щелочных средах [29]

Таблица 1.

Степень превращения ТФА МГК (1) и выходы продуктов трансформации (2–5) в разных условиях, (% моль)

Соединение рН 7.5 рН 6.5
α-ЦД : субстрат 3 : 1 без α-ЦД α-ЦД : субстрат
1 : 1 3 : 1
48 ч 96 ч 48 ч 96 ч 48 ч 96 ч 48 ч 96 ч
1 52.94 73.64 77.78 87.88 79.44 95.75 91.2 98.69
2 * * 22.32 18.26 19.07 16.74 81.77 55.03
3 37.12 47.04 44.31 11.47 49.08 3.82 20.44 21.95
4 29.62 34.23 * * * * * *
5 4.92 11.41 11.16 85.58 15.34 76.08 2.65 9.29

* – не обнаружено.

.

Следует отметить, что в результате гидролиза, спровоцированного основным характером среды и ЦД, образуется МГК (4), который в нашем случае выступает в роли вторичного субстрата 1,2-дегидрирования. Кроме того, для этого соединения показано ингибирование активности 3-КСД [4, 30], что также является фактором, контролирующим процесс трансформации в целом.

Биотрансформация 11-ТФА МГК (1) при рН 6.5 в присутствии и отсутствии α-ЦД. При значении рН 6.5 1,2-дегидрирование субстрата (1) протекало без образования продукта гидролиза 11β-трифторацетатной группы – МГК (4) – как при использовании α-ЦД, так и без него. Контрольный эксперимент без применения биокатализатора при рН 6.5 в условиях биотрансформации показал, что трифторацетатная защита 11β-гидроксильной группы как у 11-ТФА МГК, так и у 11-ТФА МПЛ, стабильна и продуктов их деэтерификации обнаружено не было.

Максимальное накопление целевого 11-ТФА МПЛ (2) – 81.77% – при степени превращения исходного субстрата (1) 91.2% наблюдалось через 48 ч трансформации в присутствии α-ЦД (табл. 1, рис. 3б), взятого в мольном соотношении α-ЦД: субстрат 3 : 1, при этом содержание в среде побочного соединения (5) было незначительным – 2.65%.

В отсутствие α-ЦД максимальное накопление соединения (2) и его 11β-гидрокси-аналога МПЛ (3) также наблюдалось через 48 ч трансформации, однако их содержание составляло всего 22% и 44% соответственно. При этом степень превращения субстрата (1) через 48 ч была 77.8% (табл. 1, рис. 3а). В то же время после 24 ч трансформации имело место существенное увеличение скорости образования нежелательного продукта восстановления 20-кетогруппы (5). Если на 24 ч его содержание составляло ~1%, то через 48 ч было более 11%, а к концу трансформации (96 ч) – более 85% при степени превращения субстрата ~88%. Таким образом, основным продуктом трансформации 11-ТФА МГК (1) в отсутствие α-ЦД был 20β-ОН-МПЛ (5). Следует отметить, что если процесс конверсии субстрата (1) в присутствии α-ЦД (3 : 1) завершался через 96 ч, то без α-ЦД биоконверсия субстрата (1) прекращалась к 72 ч и далее содержание исходного соединения (1) практически не изменялось, однако происходила интенсивная конверсия образованного МПЛ (3) в 20β-ОН-МПЛ (5).

Уменьшение соотношения α-ЦД: субстрат (1) до эквимолярного (весовое – 2 : 1) приводило к снижению скорости трансформации. Так, если конверсия исходного соединения (1) в присутствии α-ЦД (3 : 1) на 24 ч трансформации составляла 76%, то при использовании эквимолярного количества α-ЦД (1 : 1) – 59.1%, а без α-ЦД – 25% (рис. 3). Кроме того, было отмечено, что, как и в эксперименте без α-ЦД, по мере образования 11-ТФА МПЛ (2) происходил гидролиз сложноэфирной группы при С11 и последующая конвертация МПЛ (3) в 20β-ОН-МПЛ (5). При этом через 96 ч трансформации накопление продукта (5) было значительным (более 76%) при степени превращения исходного субстрата (1) до 96%. На основании анализа и сопоставления полученных результатов стало очевидным, что в изученных условиях трансформации эквимолярное соотношение субстрат: α-ЦД недостаточно.

Следует отметить, что ни в одном из вариантов биотрансформации не было обнаружено образования 11-трифторацетилированного аналога 20β-ОН-МПЛ. Этот факт свидетельствует о том, что восстановлению 20-кетогруппы подвергался только гидролизованный МПЛ (3).

Известно, что комплексы циклодекстринов и стероидных субстратов диссоциируют в водной среде и в биоконверсионной среде находятся в состоянии динамического равновесия со свободным стероидом и молекулами ЦД [19]. Учитывая, что характер связывания субстрата (1), продукта (2) и неэтерифицированных продуктов с α-ЦД может быть различным, можно предположить, что при недостатке α-ЦД возможна конкуренция за образование комплекса между субстратом (1) и продуктами с изменением равновесного состояния в неблагоприятном для продукта (2) направлении. Кроме того, при недостаточном количестве α-ЦД предположительно меняется характер комплексообразования α-ЦД и стероида, что может стать причиной переноса 11-трифторацетильной группы из 11-ТФА МПЛ (2) на молекулу α-ЦД при участии ферментов. Следует отметить, что существенный гидролиз 11-трифторацетатной группы продукта (2) с образованием МПЛ (3), который наблюдался в среде с рН 6.5 в отсутствие α-ЦД, а также при использовании эквимолярного соотношения α-ЦД к субстрату (1), проходил практически с момента образования (2) (рис. 3а, 3в). Учитывая, что 11-трифторацетатная группа обладает стабильностью в кислых средах и наличие гидролиза под действием среды исключено, что было подтверждено в контрольном эксперименте, а также исключено предполагаемое каталитическое влияние на процесс деэтерификации α-ЦД, который в среде с рН 6.5 отсутствует, то можно сделать вывод о том, что имел место ферментативный гидролиз трифторацетатной группы.

Известно, что липазы бактерий обладают способностью катализировать реакции гидролиза и трансэтерификации [32]. Бактерии рода Arthrobacter (позднее название Nocardioides) являются природными продуцентами липолитических ферментов, способных также к гидролизу сложноэфирных связей субстратов и трансэтерификации [33]. Можно предположить, что в условиях биотрансформации субстрата (1) имела место трансэтерификация под действием фермента липазы, которая осуществлялась в 2 этапа: 1 – ацильный перенос трифторацетильной группы с молекулы донора – 11-ТФА МПЛ (2) или 11-ТФА МГК (1) – на липазу культуры A. globiformis ВКПМ Ac-1528, которая является акцептором трифторацетил-иона, с промежуточным образованием ацил-ферментного эфира; 2 – последующее расщепление трифторацетил-ферментного соединения в результате атаки второго нуклеофила. Причем вторым нуклеофилом могла быть молекула воды (гидролиз) или молекула гидроксилсодержащего соединения (переацилирование) [34], в качестве которого и может выступать α-ЦД. Способность циклодектринов участвовать в процессе переноса ацильного радикала в качестве акцептора с образованием структуры с ацилированной вторичной гидроксильной группой ЦД известна. Так, ацильная миграция была детектирована с помощью ЯМР в процессе изучения катализируемого циклодекстрином деацилирования спиронолактона и установлена зависимость ее скорости от структуры ЦД [35]. Было также найдено, что β-ЦД катализирует деградацию спиронолактона путем ковалентного катализа и скорость деацилирования уменьшается с уменьшением значения рН. Ранее также была показана возможность удаления 11-трифторацетатной группы соединения (2) с помощью клеток бактерий Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 [16].

Образованный в результате переацилирования трифторацетилокси-α-ЦД имеет, скорее всего, более низкую способность к комплексообразованию с 11-ТФА МПЛ (2), тем самым не препятствуя процессу его деэтерификации с образованием МПЛ (3) и последующему превращению соединения (3) в соединение (5) при применении в процессе трансформации эквимолярного количества α-ЦД.

Ингибирование активности 3-КСД трифторацетатным ионом в настоящей работе не было выявлено, возможно, из-за эффекта катализируемой ферментом трансэтерификации с участием α-ЦД в качестве акцептора трифторацетил-иона.

Значительное ускорение процесса 1,2-дегидрирования при рН 6.5 в присутствии α-ЦД (3 : 1) может быть объяснено, во-первых, устранением возможного ингибирования 3-КСД субстратом (1) и отсутствующим соединением (4), а также отсутствием эффекта ингибирования продуктами (2) и (3). Продукты 1,2-дегидрирования стероидных субстратов, как известно, способны ингибировать активность фермента [20]. Кроме того, можно предположить, что снятие эффекта ингибирования происходило за счет образования комплексов включения α-ЦД с субстратом (1) и продуктами (2) и (3) избыточным количеством α-ЦД.

Способность циклодекстринов стабилизировать структуры лабильных соединений, что предотвращает деградацию, гидролиз и другие модификации, была отмечена ранее [36]. Также известно [35, 37], что способность ЦД ускорять гидролитическую деструкцию соединения или, наоборот, защищать от этого процесса, зависит от того, локализована ли лабильная часть молекулы в непосредственной близости от каталитически активной гидроксильной группы ЦД, или имеет место проникновение лабильной части в глубь полости ЦД [35]. Учитывая тот факт, что α-ЦД имеет значительно меньший внутренний диаметр полости по сравнению с β-ЦД и тем более в сравнении с γ-ЦД, можно предположить, что исходный субстрат (1) и продукты его биотрансформации погружены не полностью в полость этого циклического олигомера глюкозы.

Отсутствие в обоих случаях, как с использованием α-ЦД, так и без него, в реакционной среде при рН 6.5 продукта гидролиза исходного субстрата (1) МГК (4) может свидетельствовать также о субстратной специфичности липолитического фермента культуры A. globiformis VKPM Ac-1528 в этих условиях. Известно, что липазы обладают чрезвычайно широкой субстратной специфичностью и показывают высокий уровень энантио- и регио-селективности при конверсии различных неприродных соединений [32].

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что в процессе 1,2-дегидрирования 11-ТФА МГК (1) при рН 6.5 α-ЦД, присутствующий в мольном соотношении 3 : 1 к субстрату, защищает как структуру субстрата (1), так и структуру продукта (2), от ферментативного гидролиза 11-трифторацетатной группы.

Таким образом, впервые установлена возможность 1,2-дегидрирования 11-ТФА МГК бактериями A. globiformis ВКПМ Ac-1528 c сохранением сложноэфирной защиты при С11. Обязательными условиями cохранения защиты является наличие в среде α-ЦД в мольном соотношении 3 : 1 к субстрату и проведение процесса при рН < 7. При этом оптимальная продолжительность процесса, при которой достигается максимальный выход 11-ТФА МПЛ (2) до 82% с минимальным образованием побочного продукта (5), составляет 48 ч. Кроме того, основным продуктом трансформации 11-ТФА МГК (1) в отсутствие α-ЦД является 20β-ОН-МПЛ (5). Добавление α-ЦД приводит к изменению направленности трансформации.

Исследование проведено в рамках Госзадания кафедры органической химии химического факультета МГУ по теме: “Синтез и исследование физических, химических и биологических свойств органических и элементоорганических соединений” – Номер ЦИТИС – АААА-А21-121012290046-4.

Список литературы

  1. Annen K., Petzoldt K., Laurent H., Wiechert R., Hofmeister H. // Патент США. 1990. № 4912098.

  2. Kominek L.A., Wolf H.J. // Патент США. 1987. № 4704358.

  3. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А., Андрюшина В.А., Гриненко Г.С., Скрябин Г.К. // Патент РФ. 1995. № 1830949.

  4. Arinbasarova A.Yu., Karpov A.V., Fokina V.V., Medentsev A.G., Koshcheyenko K.A. // Enzym. Microb. Tech. 1996. V. 19. № 7. P. 501–506. https://doi.org/10.1016/S0141-0229(96)80001-C

  5. Pinheiro H.M., Cabral J.M.S. // Biotech. Bioeng. 1991. V. 37. № 2. P. 97–102. https://doi.org/10.1002/bit.260370202

  6. Santos R.A., Caldeira J.C.G., Pinheiro H.M. and Cabral J.M.S. // Biotech. Lett. 1991. V. 13. № 5. P. 349–354. https://doi.org/10.1007/BF01027681

  7. Fokina V.V., Sukhodolskaya G.V., Baskunov B.P., Turchin K.F., Grinenko G.S., Donova M.V. // Steroids. 2003. V. 68. № 5. P. 415–421. https://doi.org/10.1016/S0039-128X(03)00043-6

  8. Фокина В.В., Суходольская Г.В., Шутов А.А., Николаева В.М., Донова М.В., Савинова Т.С., Лукашев Н.В., Суровцев В.В. // Патент РФ. 2013. № 2480475.

  9. Донова М.В. // Биоконверсия стероидных соединений актинобактериями. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 196 c. ISBN 978-5-904385-12-5.

  10. Kominek L.A., Wolf H.J. // Патент США. 1985. № 4524134.

  11. Fokina V.V., Donova M.V. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2003. V. 87. № 4-5. P. 319–325. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2003.10.002

  12. Annen K., Petzoldt K., Laurent H., Wiechert R., Hofmeister H., Wendt H. // Патент Чехословакии. 1986. № 244147.

  13. Annen K., Laurent H., Hofmeister H., Petzoldt K., Wiechert R. // Патент США. 1982. № 4330541.

  14. Annen K., Laurent H., Hofmeister H., Topert M. // Патент США. 1986. № 4619922.

  15. Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Савинова Т.С., Скрябин К.Г., Гриненко Г.С. // Хим.-фарм. журн. 2008. Т. 42. № 3. С. 32–39. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2008-42-3-32-39

  16. Савинова Т.С., Казанцев А.В., Лукашёв Н.В., Аринбасарова А.Ю., Степанов А.И., Скрябин Г.А. // Патент РФ. 2008. № 2337918.

  17. Wang M., Zhang L., Shen Y., Ma Y., Zheng Y., Luo J.J. // Mol. Cat. B: Enzymatic. 2009. V. 59. № 1–3. P. 58–63. https://doi.org/10.1016/j.molcatb.2008.12.017

  18. Zhang L., Wang M., Shen Y., Ma Y., Luo J. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2009. V. 159. № 3. P. 642–654. https://doi.org/10.1007/s12010-008-8499-2

  19. Hesselink P.G.M., van Vliet S., de Vries H., Hesselink B.W. // Enz. Microb. Technol. 1989. V. 11. № 7. P. 398–404. https://doi.org/10.1016/0141-0229(89)90133-6

  20. Udvardy N.E., Bartho I., Hantos G., Trinn M., Vida Z., Szejtli J., Stadler A., Habon I., Balazs M. // Патент США. 1985. № 4528271.

  21. Shtratnikova V.Yu, Schelkunov M.I., Fokina V.V., Bragin E.Y., Shutov A.A., Donova M.V. // BMC Biotechnology, 2021. V. 21. № 7. https://doi.org/10.1186/s12896-021-00668-9

  22. Rohman A., Dijkstra B.W. // Biotechnol. Adv. 2021. V. 49. 107751. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107751

  23. Савинова Т.С., Казанцев А.В., Лукашёв Н.В. // Патент РФ. 2018. № 2663484.

  24. Buhler D.R., Thomas R.C. Jr., Schlagel C.A. // Endocrinology. 1965. V. 76. № 5. P. 852–864. https://doi.org/10.1210/endo-76-5-852

  25. Fourmentin S., Crini G., Lichtfouse E. // Cyclodextrin-Steroid Interactions and Applications to Pharmaceuticals, Food, Biotechnology and Environment. Springer, 2018. P. 19–57. https://doi.org/10.1007/978-3-319-76162-6_2

  26. Donze C., Coleman A.W. // Inclusion Phenom. Mol. Recognit. Chem. 1993. V. 16. № 1. P. 1–15. https://doi.org/10.1007/bf00708758

  27. Thi T.D., Nauwelaerts K., Froeyen M., Baudemprez L., Van Speybroeck M., Augustijns P. et al. // J. Pharm. Sci. 2010. V. 99. P. 3863–3873. https://doi.org/10.1002/jps.22227

  28. Rinaldi L., Binello A., Stolle A., Curini M., Cravotto G. // Steroids. 2015. V. 98. P. 58–62. https://doi.org/10.1016/j.steroids.2015.02.016

  29. VanEtten R.L., Clowes G.A., Sebastian J.F., Bender M.L. // J. Am. Chem. Soc. 1967. P. 3253–3262.

  30. Fokina V.V., Karpov A.V., Sidorov I.A., Andrjushina V.A., Arinbasarova A.Y. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 47. № 6. P. 645–649. https://doi.org/10.1007/s002530050989

  31. Arinbasarova A.Y., Medentsev A.G., Akimenko V.K., Koshcheenko K.A., Skryabin G.K. // J. Steroid Biochem. 1985. V. 23. № 3. P. 307–312. https://doi.org/10.1016/0022-4731(85)90409-1

  32. Безбородов А.М., Загустина Н.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 2014. Т. 50. № 4. С. 347–373. https://doi.org/10.7868/S0555109914040187

  33. Самойлова Ю.В., Сорокина К.Н., Пилигаев А.В., Пармон В.Н. // Катализ в промышленности. 2018. Т. 18. № 6. С. 61–73. https://doi.org/10.18412/1816-0387-2018-6-61-73

  34. Röttig A., Steinbüchel A. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2013. V. 77. № 2. P. 277. https://doi.org/10.1128/MMBR.00010-13

  35. Jarho P., Velde D.V., Stella V.J. // J. Phapm. Sci. 2000. V. 89. №2. P. 241–249. https://doi.org/10.1002/(SICI)1520-6017(200002)89:2<241::AID-JPS11>3.0.CO;2-0

  36. Arun R., Ashok K.C.K., Sravanthi V.V.N.S.S. // Sci Pharm. 2008. V. 76. P. 567–598. https://doi.org/10.3797/scipharm.0808-05

  37. Das S.K., Rajabalaya R., David Sh., Gani N., Khanam J., Nanda A. // RJPBCS. 2013. V. 4. № 2. P. 1694–1720.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал