Радиационная биология. Радиоэкология, 2020, T. 60, № 4, стр. 411-417

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования был выбран фицин фирмы “Sigma-Aldrich”, субстратом для гидролиза служил бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы “Sigma-Aldrich”, носителями для иммобилизации – два вида хитозана, синтезированных ЗАО “Биопрогресс”: хитозан пищевой кислоторастворимый среднемолекулярный (Мr = 200 кДа, степень деацетилирования (СД) 82%, хитозан кислоторастворимый высокомолекулярный (Мr = 350 кДа, СД = 94.85%).

Иммобилизацию фицина на матрице хитозанов осуществляли адсорбционным методом [22, 23]. Определение количества белка в препаратах и каталитической активности фермента проводили модифицированным методом Лоури [24].

Процесс УФ-облучения происходил при непрерывном перемешивании соответственно раствора и суспензии в объеме 4 мл (толщина слоя в середине кюветы – 7 мм) магнитной мешалкой в круглодонной термостатируемой кювете (20 ± 1°С) с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240–390 нм в течение 1, 3, 5, 10, 20, 30 или 40 мин. Доза облучения составила соответственно 151, 453, 755, 1510, 3020, 4530 и 6040 Дж/м².

Регистрацию ИК-спектров анализируемых образцов осуществляли в Центре коллективного пользования научным оборудованием Воронежского государственного университета с помощью ИК-Фурье спектрометра Bruker Vertex-70 (Германия). Спектры снимали с неориентированных порошковых образцов.

Визуализацию аминокислотных остатков – хромофоров для УФ-света – осуществляли в программе Maestro.

Подготовка структуры фермента для докинга выполнялась по стандартной для Autodock Vina схеме, описанной авторами пакета на сайте: из входного файла PDB были удалены координаты атомов (и сами атомы) молекул растворителя, буфера и лигандов. Перед проведением численных расчетов была выполнена расстановка зарядов на поверхности белков c помощью MGLTools. Центр молекулы и параметры бокса («ячейки») мы задавали вручную, добиваясь того, чтобы молекула протеазы полностью была внутри расчетной области пространства.

Модель структуры хитозана была нарисована в молекулярном конструкторе HyperChem, последовательно оптимизирована сначала в силовом поле AMBER, а потом квантово-химически в PM3. Лиганд в расчетах докинга имел максимальную конформационную свободу: допускалось вращение функциональных групп вокруг всех одинарных связей. Расстановка зарядов на молекуле хитозана и ее протонирование/депротонирование осуществлялись автоматически в пакете MGLTools 1.5.6.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента при уровне значимости различий 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При УФ-облучении раствора фицина в дозах от 151 до 1510 Дж/м² наблюдалась тенденция к снижению его активности. Начиная с 3020 Дж/м² и при повышении дозы до 4530 и 6040 Дж/м², зарегистрировано статистически значимое уменьшение каталитической способности свободного фицина на 11, 12 и 17% соответственно.

После иммобилизации фицина на матрице среднемолекулярного хитозана при УФ-облучении в дозе 151 Дж/м² наблюдалась тенденция к снижению активности препарата, однако при дальнейшем облучении в диапазоне доз 453–6040 Дж/м² фермент сохранял свою каталитическую способность на относительно постоянном уровне. После иммобилизации фицина на матрице высокомолекулярного хитозана при УФ-облучении фермент сохранял свою активность на первоначальном (до облучения) уровне, снижение каталитической способности энзима не зарегистрировано во всем диапазоне исследуемых нами доз (рис. 1). При УФ-облучении свободного фицина изменение размера глобулы выявлено при использовании дозы 3020 Дж/м², возможно, это связано с разворачиванием молекулы фермента (рис. 2).

Рис. 1.

Влияние УФ-света на удельную каталитическую активность (А, ед./мг) свободного и иммобилизованного на матрице хитозана фицина: 1 – свободный фицин, 2 – фермент, иммобилизованный на среднемолекулярном хитозане, 3 – фермент, иммобилизованный на высокомолекулярном хитозане.

Fig. 1. Effect of UV light on the specific catalytic activity (A, U/mg) of free and immobilized on the chitosan matrix ficin: 1 – free ficin, 2 – enzyme immobilized on medium molecular weight chitosan, 3 – enzyme immobilized on high molecular weight chitosan.

Рис. 2.

Влияние УФ-света на диаметр молекул фицина.

Fig. 2. The effect of UV light on the diameter of ficin mo-lecules.

Для более детального анализа полученных результатов была осуществлена визуализация хромофоров УФ-света для молекул фицина (PDB ID: 4YYW), по отношению к активному центру фермента (рис. 3). В активном центре фицина находится His 162, в непосредственной близости к нему располагаются сразу два хромофора – Tyr 177 и Trp 178.

Рис. 3.

Хромофоры для УФ-света в молекуле фицина (PDB ID: 4YYW): атомы аминокислотных остатков, входящих в их состав, обозначены шарами, активный центр фермента указан стрелкой. б – повернутая на 180° вокруг горизонтальной оси форма а.

Fig. 3. Chromophores for UV light in ficin molecule (PDB ID: 4YYW): atoms of amino acid residues in their composition are indicated by balls, the active center of the enzyme is indicated by the arrow. b – shape a rotated 180 degrees around the horizontal axis.

На рис. 4 отражены связи и взаимодействия между молекулами фицина (PDB ID: 4YYW) и матрицей хитозана, возникающие в ходе иммобилизации фермента. У фицина в процессах адсорбции на носителе из хромофоров задействован Trp 184, что, вероятно, способствует сохранению его каталитической активности при облучении УФ-светом.

Рис. 4.

Связи и взаимодействия между молекулой фицина (PDB ID: 4YYW) и матрицей хитозана (пунктирными линиями обозначены водородные связи).

Fig. 4. Bonds and interactions between ficin molecule (PDB ID: 4YYW) and chitosan matrix (hydrogen bonds are indicated by dashed lines).

В целях более полного анализа наблюдаемых эффектов были зарегистрированы ИК-спектры фицина, иммобилизованного на матрице среднемолекулярного и высокомолекулярного хитозанов, до и после облучения образцов УФ-светом в дозах 151, 453, 755, 1510, 3020, 4530 и 6040 Дж/м².

На ИК-спектрах фицина, иммобилизованного на матрице высокомолекулярного хитозана, наблюдается сдвиг максимума в области 1062–1080 см^–1 при увеличении дозы облучения, что, вероятно, связано с участием гидроксильных групп в первичных фотобиологических реакциях. Зарегистрированы колебания С–О–Н групп, на что указывает наличие пика в области 1149–1150 см^–1. В полосе 1413–1417 см^–1 наблюдается смещение максимума в сторону уменьшения значений волновых чисел, следовательно, в системе могут проходить реакции с участием ароматического кольца. Наблюдаются симметричные деформационные колебания NН$_{3}^{ + }$-группы и N–Н связи – полосы в ИК-спектре 1587– и 1528–1534 см^–1 соответственно. Полосы 2875–2883 и 3356–3363 см^–1 свидетельствуют о наличии карбонильных групп и валентной =NH–С связи в препаратах иммобилизованной цистеиновой протеазы (рис. 5).

Рис. 5.

ИК-спектры фицина, иммобилизованного на матрице высокомолекулярного хитозана, до и после УФ-облучения в диапазоне доз 151–6040 Дж/м².

Fig. 5. IR spectra of ficin immobilized on a high-molecular chitosan matrix before and after UV irradiation in the dose range 151–6040 J/m².

При иммобилизации на среднемолекулярном хитозане в ИК-спектре белкового препарата присутствуют пики ∼1084, 1151 см^–1, что соответствует валентному колебанию С–О(Н) групп. В полосе 1380–1391 см^–1, которая ответственна за деформационное колебание С–Н связи, зарегистрировано смещение пика в сторону увеличения значений волновых чисел. Изменение интенсивности полосы 1499–1515 см^–1 указывает на характеристическое колебание с участием ароматического кольца (рис. 6).

Рис. 6.

ИК-спектры фицина, иммобилизованного на матрице среднемолекулярного хитозана, до и после УФ-облучения в диапазоне доз 151–6040 Дж/м².

Fig. 6. IR spectra of ficin immobilized on a matrix of medium molecular chitosan, before and after UV irradiation in the dose range of 151–6040 J/m².

Как видно из рис. 5, 6, изменения в ИК-спектрах иммобилизованной цистеиновой протеазы практически не затрагивают полосы, обусловленные белковым компонентом системы: амид I, амид II, амид III, поэтому можно констатировать, что матрица хитозана выступает в качестве фотопротектора для адсорбированного на ней фицина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши экспериментальные данные показывают, что при УФ-облучении свободного фицина в дозе 3020 Дж/м² и выше происходит снижение активности ферментного препарата и увеличение размеров белковой глобулы. При иммобилизации фицина на матрице среднемолекулярного и высокомолекулярного хитозанов после облучения во всем диапазоне используемых нами доз (151–6040 Дж/м²) энзим сохранял свою каталитическую способность на относительно постоянном уровне по сравнению с контрольным образцом. Таким образом, ферментативная активность молекул свободного фицина при воздействии УФ-света подвержена изменению в большей степени, чем в иммобилизованном состоянии, так как образование проанализированных нами связей и взаимодействий между молекулами фермента и матрицей хитозана оказывает значительное влияние на устойчивость иммобилизованного препарата к УФ-излучению.

Приведенные в статье материалы могут быть использованы при комплексном применении протеолитических ферментов (в частности фицина), хитозана и его производных и УФ-излучения при терапии повреждений кожных покровов различной этиологии.