Радиационная биология. Радиоэкология, 2020, T. 60, № 5, стр. 516-523

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Основная часть работы проводилась на клетках линейной культуры MCF-7/MDR1. Эта радиорезистентная клеточная линия происходит из злокачественной опухоли молочной железы человека и демонстрирует феномен множественной лекарственной устойчивости из-за гиперэкспрессии MDR1-гена. В сравнительных экспериментах использовали культуры клеток материнской линии MCF-7, которые не обладают химио- и радиорезистентностью.

Выращенные в чашках Петри клетки подвергали воздействию γ-излучения (2–8 Гр, терапевтическая установка с источником ⁶⁰Со).

Гипертермическую обработку клеток проводили перед облучением, погружая герметично закрытые чашки Петри с клеточными культурами в термостатированную водяную баню RC6 LAUDA (Германия) с температурой 42–44°С. Кроме температуры, варьировали продолжительность пребывания клеток в условиях гипертермии.

Относительные количества апоптотических и некротических клеток определяли на проточном цитофлуориметре “FACS Vantage” (Becton Dickinson, США) после двойного окрашивания клеточных суспензий ФИТЦ-меченным аннексином V и йодистым пропидием по известной методике [10].

Активность работы выкачивающего мембранного насоса (продукт гена MDR1 gp170) оценивали на том же проточном цитофлуориметре после окрашивания клеточных суспензий флуоресцирующим красителем Hoechst 33342 (Invitrogen, США).

Выживаемость обработанных клеток оценивали в МТТ-тесте, а также по клоногенности (т.е. способности образовывать многоклеточные колонии после цитотоксических воздействий) [10]. Значения факторов изменения дозы (ФИД) для 10% выживания облученных клеток рассчитывали из кривых роста клеточных колоний, как описано ранее [7].

Для анализа уровня экспрессии генов осуществляли сбор проб РНК спустя 0 (сразу после воздействия), 2, 4 и 24 ч после гипертермической обработки клеток (43°C в течение 1 ч в водяной бане), а также в контрольных клетках, не подвергавшихся действию повышенной температуры. Клетки лизировали при помощи реагента RNAzol (Sigma, США). Дальнейшее выделение и очистку РНК проводили согласно инструкции производителя. Качество очищенной РНК проверяли при помощи электрофореза по соотношению 16S и 28S рибосомальной РНК в пробе, а также на спектрофотометре “NanoDrop” (NanoDrop Technologies, США). По 1 мкг РНК с каждой пробы брали для получения кДНК при помощи набора реагентов High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, США) согласно протоколу производителя. Реакцию обратной транс-крипции проводили в амплификаторе “Терцик” (ДНК-технология, Россия). Анализ уровня экспрессии генов осуществляли при помощи ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе “Rotor Genе” (“Corbet Research”, Австралия) с использованием набора реагентов “SYBR ® Premix Ex Taq™ II” (TaKaRa Bio Inc., Япония) согласно инструкции производителя. Обработку данных для анализа изменения уровня экспрессии генов, что отражает транскрипционный ответ на ГТ, проводили методом дельта-дельта Ct [11], в качестве референсного был выбран ген “домашнего хозяйства” ALAS1. Последовательности прямых и обратных праймеров, используемых в работе, приведены в табл. 1.

Изменения относительного содержания шаперонов HSP90, HSP70 и HSP27 в цитозольной (Тритон Х-100-растворимой) и в содержащей белковые агрегаты ядерно-цитоскелетной (Тритон Х-100-нерастворимой) фракциях определяли с помощью иммуноблоттинга и последующего сканирования проявленных блотов [12, 13]. После теплового стресса клетки инкубировали в присутствии циклогексимида (50 мкг/мл), чтобы исключить прирост содержания HSPs в цитозоле за счет их de novo синтеза.

Все количественные результаты представлены как усредненные данные 4–6 независимых экспериментов с тремя повторностями для каждой точки. Статистическую обработку результатов проводили по критерию Манна–Уитни с помощью программы “Statistica 6.0” (“Microcal Softcare, Inc.”).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поскольку ранее нами было установлено, что химиорезистентные клетки линии MCF-7/MDR1 более устойчивы к облучению, чем клетки MCF-7 [7], важно было сравнить термочувствительность этих двух опухолевых культур. Результаты МТТ-теста, представленные на рис. 1, как и данные по определению апоптоза и некроза после прогрева (см. контроль без облучения на рис. 2), показывают, что по сравнению с клетками MCF-7 клетки MCF-7/MDR1 не являются значимо более терморезистентными. Такое сходство реакций на гипертермию в этих двух культурах позволяло предположить, что клетки MCF-7/MDR1 тоже возможно радиосенсибилизировать путем предварительного прогрева.

Рис. 1.

Результаты МТТ-теста, демонстрирующие близкую термочувствительность клеток MCF-7 и MCF-7/MDR1. Среднее значение оптической плотности, полученное для образцов клеток при нормальной температуре (37°С), принимали за 100%.

Fig. 1. MTT test results showing similar radiosensitivity of MCF-7 and MCF-7/MDR1 cells. The average optical density obtained for cell samples at normal temperature (37°C) was taken as 100%.

Рис. 2.

Процент апоптоза и некроза в клетках MCF-7 и MCF-7/MDR1, подвергнутых гипертермии, облучению или комбинации обоих воздействий. * Значимое отличие от показателей, представленных в виде соседнего (черного) столбика, р < 0.05. ** Значимое отличие от показателей, представленных в виде пары столбиков с пометкой 4 Гр, p < 0.05.

Fig. 2. Percentage of apoptosis and necrosis in MCF-7 and MCF-7/MDR1 cells exposed to hyperthermia, radiation, or a combination of both. * Significant difference from the neighboring (black) column, p < 0.05. ** Significant difference from a pair of columns marked 4 Gy, p < 0.05.

Действительно, сравнительный анализ клоногенности клеток MCF-7/MDR1, облученных без или после прогрева, выявил радиосенсибилизирующие эффекты гипертермической предобработки, причем степень радиосенсибилизации коррелировала с температурой прогрева (рис. 3). В табл. 2 приведены величины факторов изменения дозы (ФИД), рассчитанные для 10%-ной выживаемости прогретых и облученных клеток обеих линий. Из представленных данных следует, что в качестве радиосенсибилизирующего воздействия гипертермия не менее эффективна для клеток MCF-7/MDR1, чем для клеток MCF-7. Сравнив значения ФИД, можно заметить, что степень радиосенсибилизации прогретых клеток MCF-7/MDR1 вполне сопоставима с таковой в клетках MCF-7, обработанных проникающими в клетку низкомолекулярными радиосенсибилизаторами (см. [7]). Радиосенсибилизирующий эффект гипертермии проявлялся не только в падении клоногенности (рис. 3, табл. 2), но и в значительном усилении пострадиационной клеточной гибели. А именно, более чем трехкратное увеличение уровня пострадиационного апоптоза имело место в образцах прогретых клеток MCF-7/MDR1 по сравнению с клетками этой же линии, не подвергшихся гипертермическому воздействию. Причем этот прирост апоптотической фракции был даже больше, чем в прогретых и облученных клетках MCF-7 (рис. 2). В целом результаты анализа клоногенности и клеточной гибели хорошо согласуются друг с другом. В совокупности все это доказывает возможность эффективного использования гипертермии для радиосенсибилизации радиорезистентных опухолей, невосприимчивых к фармакологическим радиосенсибилизаторам.

Рис. 3.

Результаты теста на клоногенность, демонстрирующие термо-радиосенсибилизацию клеток MCF-7 и MCF-7/MDR1. Выживаемость колоний, полученную для образцов клеток при нормальной температуре (37°С), принимали за 100%.

Fig. 3. Clonogenicity test results showing thermo-radiosensitization of MCF-7 and MCF-7/MDR1 cells. The colony survival rate obtained for cell samples at normal temperature (37°C) was taken as 100%.

Мы также старались исследовать молекулярные механизмы выявленного феномена. Принято считать, что в основе радиосенсибилизирующего действия гипертермии лежит термо-денатурация и агрегация белков в клетках-мишенях, что приводит к нарушению клеточного гомеостаза и серьезно затрудняет реализацию механизмов радиопротекции и пострадиационного восстановления [3]. Поскольку ранее были показаны корреляции радиосенсибилизирующих эффектов гипертермии с протеотоксичностью теплового воздействия [8], здесь мы сравнивали проявления протеотоксичности в прогретых клетках MCF-7/MDR1 и MCF-7. Характерными клеточными реакциями на протеотоксический стресс являются активация транскрипционного фактора HSF1 и HSF1-опосредованная экспрессия генов индуцибельных HSP [9]. Поэтому мы проанализировали динамику экспрессии генов индуцибельных HSP27 и HSP70 в двух клеточных культурах, подвергнутых тепловому стрессу, с целью сравнительной оценки протеотоксичности. Эта динамика должна отражать степень повреждения (термо-денатурации) клеточных белков в том и другом случаях. В ходе работы было установлено, что клетки обеих линий – и химиочувствительные клетки MCF-7, и химиорезистентные клетки MCF-7/MDR1, в первые четыре часа после прогрева сходным образом отвечают на тепловой стресс. А именно, запускается экспрессия генов HSP27 и HSP70 (рис. 3) уже в момент действия высокой температуры, и затем наращивается уровень мРНК этих генов в течение, как минимум, 4 ч после окончания прогрева. Эти результаты подтверждают, что химиорезистентные клетки MCF-7/MDR1 почти столь же чувствительны к действию повышенной температуры, как и химиочувствительные клетки MCF-7.

Ранее было показано, что сила радиосенсибилизирующих, цитотоксических и протеотоксических эффектов гипертермии коррелирует с истощением цитозольного пула шаперонов (HSP) за счет их перехода в Тритон Х-100-нерастворимую (ядерно-цитоскелетную) фракцию в результате связывания с термо-денатурированными клеточными белками [8]. В этой работе мы проводили аналогичные исследования, чтобы сравнить динамику “инсолюбилизации” HSP90, HSP70 и HSP27 в прогретых клетках MCF-7 и MCF-7/MDR1. Результаты, представленные в табл. 3, демонстрируют для обоих вариантов схожую динамику накопления HSP в ядерно-цитоскелетной фракции, что должно говорить о примерно одинаковых уровнях и скорости термо-денатурации внутриклеточных белков в той и другой культуре. Данные табл. 3 находятся в полном соответствии с показателями, представленными на рис. 4, а также с результатами по клеточной гибели и клоногенности (см. рис. 1–3 и табл. 2).

Рис. 4.

Динамика изменения уровня экспрессии генов HSP27 и HSP70 в ответ на гипертермию. По оси ординат отложена кратность изменения уровня экспрессии гена HSP27 и HSP70 относительно уровня экспрессии этого же гена в контроле (принят за 1). Условные обозначения: “К” – контроль; “43°C” – сразу после прогрева; “43°C + 2 ч”, “43°C + 4 ч”, “43°C + 24 ч” – через 2, 4 и 24 ч после прогрева соответственно.

Fig. 4. Dynamics of changes in the level of expression of HSP27 and HSP70 genes in response to hyperthermia. On the ordinat-axis pending the frequency change of the gene expression levels of HSP27 and HSP70 relative expression level of that gene in the control (taken as 1). Symbols: “C” – control; “43°C” – immediately after heating up; “43°C + 2 h”, “43°C + 4 h”, “43°C + 24 h” – 2, 4 and 24 hours after heating up, respectively.

ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что гипертермическая предобработка может значительно усилить цитотоксическое действие γ-излучения на радиорезистентные опухолевые клетки линии MCF-7/MDR1, которые, как было ранее показано, невосприимчивы к “химиотерапевтическим” радиосенсибилизаторам, таким как доксорубицин, таксол или 17AAG [7]. Даже относительно мягкие условия гипертермической предобработки позволяли снизить пострадиационую клоногенность MCF-7/MDR1 клеток на 50–80% (рис. 3).

Полученные результаты позволяют утверждать, что раковые клетки с химио- и радиорезистентными фенотипами не обязательно обладают еще и терморезистентностью, причем этот факт можно использовать в терапевтических целях. Чтобы понять молекулярную природу обнаруженного феномена, необходимо обсудить механизмы, благодаря которым происходит радиосенсибилизация прогретых клеток-мишеней. Известно, что радиосенсибилизирующие эффекты гипертермии обусловлены, в основном, ее протеотоксичностью, т.е. повреждающим действием теплового стресса на термолабильные клеточные белки, которые денатурируют, теряют функциональную активность и образуют агрегаты. Инактивация и агрегация многих белков в ядре, цитоплазме и органеллах прогретой клетки приводят к нарушению биосинтеза, сигнальной регуляции, ионному дисбалансу и пр., что делает ее более уязвимой к облучению [3, 8]. Соответственно, оценивая уровень протеотоксичности того или иного воздействия на клетки, можно сделать вывод относительно эффективности ожидаемой радиосенсибилизации. Внутриклеточным сенсором протеотоксичности можно считать транскрипционный фактор HSF1, который активируется в ответ на появление в цитоплазме денатурированных и агрегированных белков [9]. Прямым следствием активации HSF1 являются транскрипция HSP генов и накопление мРНК, кодирующих индуцибельные HSPs, что можно определить с помощью ПЦР; именно такой подход был нами применен для генов HSP70 и HSP27. Из полученных результатов следует, что в прогретых клетках той и другой культуры HSF1-опосредованные реакции довольно похожи (см. рис. 4), и это говорит о близких уровнях протеотоксичности в обоих случаях, а значит, объясняет, почему термо-радиосенсибилизация практически равно эффективна для клеток MCF-7 и для радиорезистентных клеток MCF-7/MDR1.

Важным событием в механизме термо-радиосенсибилизации раковых клеток является, на наш взгляд, переход цитозольных HSP90, HSP70 и HSP27 в Тритон Х-100-нерастворимую фракцию прогретых клеток (см. табл. 3). Такая спровоцированная клеточным стрессом “инсолюбилизация” шаперонов была описана еще давно [12, 13], и причины этого явления более менее понятны. Когда в испытавшей тепловой шок клетке многие белки денатурируют и агрегируют, HSPs активно вовлекаются в этот процесс, узнавая белковые молекулы с нарушением нативной структуры и образуя с ними шаперон-субстратные комплексы. Так, цитозольные HSPs коагрегируют с денатурированными белками, и эти агрегаты, достигнув определенных размеров и массы, седиментируют при низкоскоростном центрифугировании клеточных лизатов в Тритон Х-100-содержащем буфере [12, 13]. Другая причина обогащения шаперонами Тритон Х-100-нерастворимой (ядерно-цитоскелетной) фракции прогретых клеток – это то, что цитозольные HSPs связываются с поврежденными сайтами изначально нерастворимых в детергенте белковых структур цитоскелета, хроматина и ядерного матрикса. И одно, и другое являются естественным проявлением биологической (шаперонной) функции HSPs, которые должны взаимодействовать с поврежденными стрессом белками, чтобы способствовать их ренатурации и дезагрегации или деградации [12, 13]. Считается, что “отвлечение” HSP70 и HSP90 на взаимодействие с денатурированными белками приводит к распаду комплексов HSP70-HSF1-HSP90, благодаря чему HSF1 освобождается, активируется и запускает транскрипцию HSP генов [9]. Важно, что в течение какого-то промежутка времени после прогрева шаперонная функция HSPs может быть в конфликте с их антиапоптотической функцией. Действительно, и HSP90, и HSP70, и HSP27 известны как эндогенные супрессоры апоптоза; они образуют ингибирующие комплексы с эффекторами апоптоза (цитохром-Ц, Apaf-1, каспазы и др.) или активирующие комплексы с антиапоптотическими белками (Akt, сюрвивин и др.) и таким образом способны блокировать каскады реакций, ведущие к апоптотической гибели клетки [14, 15]. Сразу после теплового шока в клетке, вероятно, возникает своего рода конкуренция между белковыми субстратами за связывание с цитозольными шаперонами (HSPs) [8]. Очевидно, что появившиеся в большом количестве термо-денатурированные внутриклеточные белки будут рекрутировать HSP90, HSP70 и HSP27, тем самым не давая этим шаперонам взаимодействовать с белками-регуляторами апоптоза и прерывать исполнение апоптотического сценария. По своей сути, такие внутриклеточные конфликты и конкуренции есть осуществление физиологического “контроля качества”: клетка, перенесшая стресс и получившая слишком серьезные повреждения, должна быть элиминирована через апоптоз. Здесь мы показали, что этот же механизм, по-видимому, можно реализовать и в отношении радиорезистентных опухолевых клеток: в прогретых MCF-7/MDR1 клетках истощается цитозольный пул шаперонов (см. табл. 3), и после облучения в них интенсифицируется апоптоз (см. рис. 2), что свидетельствует о термо-радиосенсибилизации этих клеток, которая определялась и в других тестах (рис. 1 и 3).

Множественная лекарственная устойчивость опухолей является одной из главных проблем в лечении рака. Многие злокачественные новообразования человека оказываются устойчивыми к химиотерапии или приобретают такую устойчивость в процессе лечения [5]. Если опухоль, демонстрирующая множественную лекарственную устойчивость, к тому же еще и радиорезистента, это резко сужает возможности консервативной терапии, тем более что применение фармакологических радиосенсибилизаторов не имеет здесь перспектив по понятной причине. Мы полагаем, что в таких случаях гипертермия, вызывающая радиосенсибилизацию химио- и радиорезистентных опухолей, может существенно повысить эффективность лучевой терапии. В пользу этого говорят наши экспериментальные данные, полученные на сублинии опухолевых клеток MCF-7/MDR1, обладающих химио- и радиорезистентностью. Современные устройства для клинической гипертермии позволяют с помощью фокусирования высокочастотных или ультрачастотных электромагнитных полей создавать локальный прогрев опухоли-мишени без серьезного повреждения прилегающих нормальных тканей [16]. Следовательно, предлагаемый нами способ вполне применим на практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данное исследование показало, что терморезистентность не ассоциируется с радио- и химиорезистентным фенотипом раковых клеток и, следовательно, локальная гипертермия может успешно применяться для радиосенсибилизации радиорезистентных солидных опухолей, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.