Растительные ресурсы, 2019, T. 55, № 2, стр. 259-267

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования были выбраны деревья ели канадской, произрастающие на территории городского парка г. Минска. Хвою отбирали с различных, рядом растущих 17 деревьев и получали усредненный образец. Это позволяет получить результаты исследований характеристик эфирного масла на 90%-ном доверительном уровне [10]. Пробы помещали в полиэтиленовые пакеты для минимизации потерь наиболее летучих компонентов. Из отобранных образцов хвои по методике, предложенной в работе [11], составляли сборную пробу, с которой и проводили дальнейшие эксперименты. Поскольку на выход и содержание основных компонентов эфирного масла оказывает влияние срок хранения отобранных образцов, поэтому для минимизации потерь компонентов выделение эфирного масла проводили не позднее чем через 4 ч после отбора [12].

Конкурирующими методами получения эфирных масел являются дистилляция и экстракция растворителями [13]. Для случая, когда эфирных масел в растении достаточно много (более 1%), предпочтительнее использовать метод перегонки с водяным паром. Отобранную хвою отделяли от стволиков, измельчали до размера 3–5 мм, составляли навеску от 200 до 250 г и из нее методом гидродистилляции в течение 16 ч отгоняли эфирное масло, а количественный выход определяли вольюметрически. Выход эфирного масла из навески хвои был рассчитан с учетом влажности на массу абсолютно сухого сырья (а. с. с.).

Важными физико-химическими характеристиками любого эфирного масла является показатель преломления и плотность. Величину этих показателей оценивали согласно [14].

Качественный и количественный анализ состава масел осуществляли методами газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) без предварительного фракционирования и спектроскопии ЯМР.

Хроматографический анализ выполняли на хроматографе Кристалл 5000.1 с использованием кварцевой капиллярной колонки длиной 60 м с нанесенной фазой 100%-ным диметилсилоксаном. Условия хроматографирования: изотермический режим при 70 °С в течение 20 мин, затем программированный подъем температуры со скоростью 2 °С/мин до 150 °С с выдержкой при конечной температуре 40 мин. Температура испарителя 250 °С. Идентификацию отдельных компонентов осуществляли с использованием эталонных соединений, а также на основании известных литературных данных по индексам удерживания [15].

Запись спектров ЯМР проводили на спектрометре AVANCE-500 (Германия) с рабочими частотами для ядер ¹Н и ¹³С – 500 и 125 МГц, соответственно. Для количественного анализа образцов готовили растворы эфирных масел определенной концентрации в СDCl₃ (1–10%). Химические сдвиги сигналов протонов соединений определяли по сигналу хлороформа (СНСl₃, δ = 7.27 м. д.), который присутствует в качестве примеси в дейтерированном растворителе. Для детального анализа интенсивностей сигналов отдельных соединений в спектре учитывали релаксацию протонов всех групп ядер входящих в состав соединений.

При записи спектров ¹³С в качестве реперного также использовали сигнал растворителя (δ = 77.7 м. д.). Для количественного анализа спектры записывали с подавлением взаимодействия с протонами с использованием импульсных последовательностей, исключающих проявление эффекта Оверхаузера, и с задержками между импульсами >5 Т₁, где Т₁ – время спин-решеточной релаксации наиболее медленно релаксирующих ядер. Для уменьшения времени спин-решеточной релаксации в растворы добавляли трис-ацетилацетонат хрома (стандартный релаксант, используемый для записи спектров ¹³С в количественном режиме) в количестве 5% от массы навески исследуемого образца. Поскольку релаксант незначительно изменяет химические сдвиги ядер ¹³С компонентов эфирных масел, для контроля были записаны спектры доступных индивидуальных соединений, присутствующих в этих маслах: α-пинен, Δ³-карен, β-пинен, α-терпинеол, камфен, лимонен, борнилацетат, п-цимол, мирцен, β-фелландрен, α-фелландрен, β-кариофиллен, борнеол, γ-терпинен, терпинолен, камфора.

Минерализацию образцов хвои выполняли на приборе микроволновой подготовки МС-6 по методике, описанной в инструкции к прибору. Содержание элементов Pb, Cd, Cu, Co, Ni, Mn, Cr в хвое определяли методом атомно-абсорбционного анализа [16]. Определение S проводили методом нефелометрии по стандартной методике [17].

Измерения содержания металлов, серы и компонентов эфирного масла проводили в трехкратной повторности. Статистический анализ проводили в соответствии с методиками, изложенными в [18]. Результаты трех независимых измерений представлены как среднее арифметическое значение. Относительное среднеквадратичное отклонение, рассчитанное по трем параллельным измерениям, не превышало 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Хорошо известно, что состояние лесов, а также содержание и состав эфирного масла напрямую зависят от степени загрязненности территории произрастания промышленными полютантами [19]. Основными токсикантами, воздействующими на хвойные растения и накапливающимися в них, являются соединения серы, в основном диоксид серы, и тяжелые металлы [20]. В исследованных образцах в течение года наблюдалось среднее содержание серы (930 мг/кг а. с. с.) и свинца (0.62 мг/кг а. с. с.). Полученные результаты по содержанию серы, свинца и ряда других элементов хорошо согласуются с данными работ [21, 22] и позволяют утверждать, что изучаемые ели произрастают на достаточно загрязненной территории. Следует отметить, что в весенне-летний период несколько возрастает содержание в хвое серы и свинца (на 7–10%), что объясняется высокой запыленностью городских насаждений в данный период. Содержание Cd, Co, Cu, Ni, Mn, Cr достаточно низкое (на уровне фоновых значений) и скорее всего не оказывает влияния на состав масла. В целом изменения содержания токсичных элементов в течение года незначительны и находятся в пределах ошибки измерений.

При оценке перспективности сырья древесной зелени для промышленного использования, получения биологически активных веществ необходимо было оценить выход эфирного масла. Выделенное еловое масло представляло собой жидкость светло-желтого цвета с древесно-хвойным запахом и жгучим вкусом, плотностью 0.861 ± 0.002. Мажорный букет елового масла: свежий, яркий, древесно-хвойный, травяная нота аира. Как видно из табл. 1, выход масла составлял 1.2–1.6% от массы используемого сырья, что согласуется с данными работы [23]. При этом наблюдаются два максимума содержания масла в мае и декабре. Высокое содержание масла в мае объясняется тем, что в данный период процессы биосинтеза протекают с максимальной скоростью. При этом в последующие месяцы количество эфирного масла уменьшается в первую очередь за счет интенсивного выделения основных компонентов в атмосферу. В осенние и зимние месяцы процессы биосинтеза заторможены, а низкие температуры затрудняют испарение эфирных масел, что способствует их сохранению в хвое и тем самым увеличению содержания терпеноидов.

Следует отметить, что достаточно низкое общее содержание масла связано прежде всего с произрастанием растений на загрязненной территории, где биосинтез масла ингибируется токсичными элементами. В свою очередь выход масла из растений, произрастающих в экологически чистых районах, выше и достигает более 2.5% [22].

Средняя величина показателя преломления эфирного масла в течение года составила 1.4732 ± 0.0001. Следует отметить, что величина показателя преломления является интегральной характеристикой и незначительно зависит от времени отбора образцов. Незначительные изменения показателя наиболее вероятно связаны с колебаниями количества основных компонентов эфирного масла в течение года.

На рис. 1 представлены фрагменты спектров ЯМР ¹³С эфирных масел ели канадской, отобранные в декабре и июне месяце. Поскольку детальный анализ спектров ЯМР эфирного масла ели канадской с полным отнесением сигналов отдельных компонентов проводился ранее [24], на фрагментах показаны наиболее характеристичные сигналы атомов углерода веществ с высоким содержанием. Приведенные во фрагментах химические сдвиги ¹³С (δ, м. д.) атомов углерода камфоры – 220.2; камфена – 99.8; 166.9; лимонена – 109.1; 121.3; 134.3; 150.8; борнилацетата – 80.4; 171.9; α-пинена – 11.7; 145.2; 1,8-цинеола – 87.9. Как видно, качественно спектры подобны. Однако в спектре эфирного масла “зимнего” образца наблюдается значительно более интенсивный сигнал лимонена и камфена. В “летнем” образце наблюдается интенсивный сигнал 1,8-цинеола и α-пинена. Кроме того, основными соединениями, идентифицированными в спектре, были камфора и борнилацетат. Следует отметить, что интенсивности линий этих компонентов также отличаются.

Рис. 1.

Фрагмент спектра ЯМР ¹³С эфирного масла ели канадской Picea glauca, отогнанного в декабре (верхний спектр) и июле (нижний спектр) (Наиболее характеристичные сигналы). 1 – камфора, 2 – камфен, 3 – лимонен, 4 – борнилацетат, 5 – α-пинен, 6 – 1,8-цинеол. Fig. 1. Fragment of NMR-spectrum ¹³C of Picea glauca essential oil distilled in December (upper spectrum) and July (lower spectrum). 1 – camphor, 2 – camphene, 3 – limonene, 4 – bornyl acetate, 5 – α-pinene, 6 – 1,8-cineole.

В таблице представлены результаты хроматографического анализа выделенных масел. Как показано ранее, компонентный состав эфирного масла ели канадской весьма сложен и содержит около 130 компонентов [22]. Из них, используя эталонные соединения, было идентифицировано 45 индивидуальных веществ. Основными компонентами эфирных масел хвои ели канадской (содержание более 1%) являются: α-пинен, камфен, лимонен, 1.8-цинеол, камфора, борнилацетат, что согласуется с данными работы [25]. Как видно, содержание всех компонентов не постоянно и изменяется в течение года. Наиболее значительно меняется содержание таких компонентов как лимонен и 1,8-цинеол. Следует отметить изменения в групповом составе (см. табл. 1). В частности, в весенне-летний период содержание кислородсодержащих соединений и сесквитерпеновых углеводородов возрастает, а монотерпеновых – снижается. Такая картина, в целом, характерна для составов эфирных масел хвойных растений. Интенсивные процессы биосинтеза в сочетании с высокими среднесуточными температурами способствуют ускорению образованию в первую очередь кислородсодержащих соединений. Следует отметить, что в эфирном масле на протяжении всего года наблюдается высокое содержание камфоры и борнилацетата (порядка 40%). Такое высокое содержание данных компонентов позволяет использовать эфирное масло ели канадской в качестве источника биологически активных веществ и сырья для производства.

Согласно данным работы Э.Д. Левина [26], процесс биосинтеза терпенов для семейства Pinaceae не тормозится на стадии получения отдельного терпена. На рис. 2 представлена динамика изменения содержания основных компонентов масла внутри соответствующих групп. В весенне–летний период снижение содержания пинена и камфена и увеличение в это время содержания камфоры и борнилацетата может быть следствием взаимосвязи путей их биосинтеза, что согласуется с данными [27]. Как видно содержание лимонена резко снижается в весенне–летний период, а выход 1,8-цинеола напротив возрастает. Это также может указывать на то, что данные компоненты связаны между собой процессами биосинтеза. Активное участие лимонена в процессах биосинтеза подтверждается схемой образования терпеноидов [27].

Рис. 2.

Динамика изменения основных компонентов эфирного масла ели канадской Picea glauca в течение года. По горизонтали – месяцы; по вертикали – содержание, %. Fig. 2. Dynamics of Picea glauca essential oil major components throughout the year. X-axis – months; y-axis – containing, %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, из всех образцов древесной зелени ели канадской Picea glauca (Moench) Voss. выделено эфирное масло, измерен его выход и физико-химические характеристики. Показано, что количество масла изменяется в течение года на величину около 30%. Методами газожидкостной хроматографии и ЯМР спектроскопии проведен детальный анализ динамики накопления камфоры, борнилацетата, лимонена, камфена, α-пинена и 1,8-цинеола в эфирном масле ели канадской, произрастающей на территории городских парков в течение года. Антибатное изменение содержания пинена, камфена и камфоры, борнилацетата, а также лимонена и 1,8-цинеола, вероятно, указывает на взаимосвязь реакций их биосинтеза. Высокое содержание камфоры и борнилацетата в эфирном масле в течение всего года позволяет использовать его в качестве сырья для получения биологически активных веществ.