Растительные ресурсы, 2019, T. 55, № 4, стр. 439-448

Таксономические проблемы

P. niruri таксономически путают с другими видами, называемыми “quebra pedra” (в переводе – “разрушитель камней”), особенно с P. amarus и P. urinaria. Эта путаница проистекает из первоначальной классификации Карла Линнея, который ошибочно классифицировал ряд близкородственных и таксономически сходных видов как P. niruri, что привело к дальнейшей ошибочной идентификации и ошибочной классификации последующих ученых [9, 11 ] . Бразильское название “quebra pedra” не определяет один вид, а вместо этого относится к ряду похожих видов. Аналогичным образом, в Индии общее название этого вида трав применяется как для P. niruri, так и для P. urinaria, хотя P. urinaria обычно кажется несколько визуально отличным [11 ] . На самом деле, так называемый P. niruri, описанный в Индии, является смесью трех различных видов: P. amarus, P. fraternus и P. debilis [12 ] . Отсутствие консенсуса относительно идентичности P. niruri привело к некоторой путанице и разногласиям среди исследователей, изучающих этот вид. Это становится особенно проблематичным при изготовлении и регулировании лекарственных средств растительного происхождения, где необходимо проверять подлинность растений, чтобы гарантировать качество и безопасность рассматриваемого растительного лекарственного средства [13 ] . Например, Бразильская фармакопея признает только два вида Phyllanthus: P. niruri и P. tenellus как терапевтически активные и безопасные для потребления человеком [13 ] . Из-за преобладания совместно обитающих морфологически схожих видов существует высокая вероятность того, что местные фермеры или коллекционеры создают смеси нескольких различных видов, тем более что с таксономистами редко консультируются в процессе сбора [14 ] . В исследовании Aita et al. были изучены 16 образцов “quebra pedra” от 14 продавцов на уличном рынке в Порту-Алегри, Риу-Грандер-ду-Сул, Бразилия. Несмотря на то, что все образцы претендовали на звание “разрушителя камней”, среди них было выявлено семь различных видов растений. Только P. niruri оказался растением из рода Phyllanthus среди этих семи видов и единственным видом, доказавшим свой терапевтический потенциал. Исследователи обнаружили, что после сушки и измельчения для продажи P. niruri и другие образцы оказались морфологически схожими, что является возможной причиной межвидовой путаницы [15 ] .

Поскольку идентификация таксонов по внешнему виду серьезно затруднена, бразильские ученые пытались бороться с проблемами таксономической путаницы, используя хроматографию в качестве метода для быстрой и точной идентификации P. niruri. В 2009 г. Colombo et al. опубликовали стандартный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для оценки образцов P. niruri, полученных от коммерческих поставщиков. Он представлял собой выявление путем идентификации трех основных соединений, присутствующих как в листьях травы, так и в коммерческих экстрактах: корилагина, рутина и этил 3,4,5-тригидроксибензоата. Первое из этих соединений, корилагин, было предложено в качестве фитохимического маркера для P. niruri. Этот метод полезен, потому что он быстрый и простой, требует небольшого количества растительного вещества для проведения анализа ВЭЖХ, не требует всего растения для физической таксономической идентификации и может быть применен для проверки подлинности образцов лекарственного сырья, обычно продаваемых на рынке [16 ] . Однако часто существует определенная степень химической изменчивости у разных видов растений, поскольку такие факторы, как условия произрастания, могут приводить к колебанию относительных концентраций соединений между образцами растений. Таким образом, возможно использовать хроматографический метод для различения образцов растений из разных родов, но он не обеспечивает идеального определения для близкородственных видов [13 ] .

В связи с ненадежностью идентификации видов рода Phyllanthus по анализу ВЭЖХ, был применен способ с использованием штрихкодирования ДНК. В ноябре 2009 г. Консорциум “Штрих-код жизни” сообщил в Nature, что он выбрал области rbcL и matK в качестве утвержденного штрих-кода ДНК [17 ] . А в исследовании Srirama et al. для 16 видов Phyllanthus были разработаны дополнительные характерные для ДНК видовые штрих-коды с использованием области ДНК хлоропласта, psbA-trnH [14 ] .

Кладистический анализ, являющийся идеологическим ядром филогенетики [18¹¹], с помощью выявления последовательностей ДНК ядерных внутренних транскрибированных спейсеров (ITS1 и ITS2) вместе с комбинированными последовательностями хлоропластов atpB и rbcL, проведенный Lee et al. показал парафилетичность рода Phyllanthus, и авторы решительно поддерживают идею о том, что два наиболее проблематичных вида, которых часто принимают за родственные, P. niruri и P. amarus, являются отдельными, хотя и близкородственными [19 ] .

Поэтому основной проблемой в фармакологических и клинических исследованиях видов рода Phyllanthus является обеспечение идентичности растительного сырья и, как следствие, лекарственных средств, произведенных из него.

Применение в традиционной медицине

Настои листьев, стеблей и корней видов рода Phyllanthus, в частности, P. niruri, P. urinaria, P. corcovadensis, P. amarus, P. tenellus и других в течение тысячелетий использовались в традиционной медицине разных стран для лечения широкого спектра симптомов, которые могут быть вызваны вирусными заболеваниями. P. niruri, также известный как Бхумиамалаки, использовался в аюрведической медицине [20²²], в индийской медицинской системе Сиддха для лечения проблем желудка, мочеполовой системы, печени, почек и селезенки, а также для лечения хронической лихорадки, мигрени, желтухи, гонореи, сифилиса, кожных заболеваний, малярии, менструальных проблем, диабета, хронической дизентерии, заболеваний печени, анорексии, запоров, синдрома раздраженного кишечника [11 ] . В аюрведической медицинской практике в Индии используют Phyllanthus для профилактики заболеваний печени, а также для лечения таких заболеваний, как гепатит, желтуха и рак печени [21 ] .

Амазонские племена Бразилии исторически использовали P. niruri для лечения камней в почках и камней в желчном пузыре, называя его “сhanca piedra” или “quebra pedra” – испанским термином, означающим “разрушитель камней” [3, 22 ] . Листья обычно используются для приготовления чая [23 ] .

Влияние экстрактов P. niruri на вирус гепатита В (HBV)

P. niruri был изучен на предмет его угнетающей активности против вируса гепатита В. Одним из первых исследований in vivo можно назвать эксперимент 1987 г. Venkateswaran et al., в котором было выявлено влияние экстракта P. niruri на вирус гепатита сурка (WBV). Поскольку WBV и HBV обладают значительной перекрестной реактивностью и значительной гомологией ДНК, WBV может служить аналогом вируса гепатита B человека [24 ] . Результаты работы показали, что у животных, которым вводили экстракт, обнаружилось значительное снижение титра антигена гепатита сурка, а также, что экстракт был непродуктивен при подкожном введении, но был эффективен при внутрибрюшинном введении. Venkateswaran et al. предположили, что экстракт оказал положительное влияние благодаря “профилактике вследствие задержки гибели дифференцированных клеток печени”. Авторы допустили следующую последовательность событий: пролиферация HBV в дифференцированных клетках приводит к гибели клеток, вызванной иммунным ответом, после чего менее дифференцированные клетки раньше времени делятся и размножаются в ответ на гибель зрелых дифференцированных клеток. При такой повышенной скорости размножения хромосомы более подвержены воздействию мутаций, которые могут восприниматься иммунной системой организма хозяина как рак. Таким образом, уменьшая вирусную нагрузку или подавляя проникновение вируса в клетки печени, негативные изменения будут замедляться и, в конечном счете, задерживать реакцию иммунной системы на воспринимаемые “раковые заболевания”. Это, однако, только одна из гипотез о том, каким образом снижение вирусной нагрузки может снизить вероятность возникновения рака печени или других заболеваний [24 ] .

Несколькими годами ранее Thyagarajan et al. был оценен ингибирующий потенциал P. niruri с использованием HBsAg-положительных сывороток от пациентов с хроническим гепатитом B. В результате эксперимента HBsAg был инактивирован растительным экстрактом, причем эффект наступал быстрее при 37 °С, чем при 40 °С [25 ] . Исследования токсичности препарата подтвердили, что экстракт P. niruri безопасен для использования. Токсичность не наблюдалась как in vitro, так и in vivo: ни у клеток vero, ни у мышей. Отсутствие токсичности признано и авторами исследования 2011 г., где LD50 водного экстракта P. niruri составил >5000 мг/кг массы тела [26].

Противовирусная эффективность экстракта P. niruri была проверена в клинических исследованиях на HBsAg-положительных людях. Экстракт давали ежедневно пациентам целевой группы в течение 30 дней, в то время как часть из них принимала контрольные препараты плацебо. Фактически, через 90 дней после обработки было установлено, что курс растительного экстракта эффективно очистил антиген HBV среди двух третей обработанных положительных индивидуумов [27]. Последующее исследование Wang et al. позволило подтвердить эффективность P. niruri in vivo для устранения гепатита В в течение 3–6 недель у млекопитающих [28].

Последующие эксперименты привели к открытию лигнанов у растений рода Phyllanthus, среди которых нирантин и ниртетралин эффективно подавляли экспрессию HBsAg и HBeAg in vitro [29]. Wei et al. доказали, что лигнаны Nirtetralin и Nirtetralin A, B, выделенные из P. niruri, эффективно подавляют секрецию антигенов HBV дозозависимым образом со значениями IC50 для HBsAg 9.5 мМ (ниртетралин A), 16.7 мМ (ниртетралин B) и 97.2 мМ (ниртетралин); значения IC50 для HBeAg 17.4 мМ (ниртетралин А), 69.3 мМ (ниртетралин В) и 232.0 мМ (ниртетралин), соответственно [30].

Одним из активных компонентов в подавлении вируса гепатита В называют эллаговую кислоту [31]. Тем не менее, полученные в 2017 г. Li et al. данные свидетельствуют о том, что хотя этаноловая фракция P. niruri ингибирует HBV, активным компонентом является не эллаговая кислота. Поскольку, выделенная из этанольной фракции, эллаговая кислота не влияла на репликацию ДНК вируса гепатита В при оцененных концентрациях и не ингибировала размножение HBV [32].

Целью двойного плацебо-контролируемого слепого исследования Baiguera et al. было изучение эффективности и безопасности 12-месячного лечения экстрактами P. niruri пациентов с хронической инфекцией вирусом гепатита B. Однако статистически значимых различий в вирусной нагрузке между группами вмешательства и плацебо через 12 месяцев обнаружено не было, и ни у одного из пациентов не было выявлено HBsAg. Что касается безопасности, то в обеих группах не было никаких изменений в параметрах почечной функции через 12 месяцев, и никаких серьезных побочных эффектов в результате лечения не наблюдалось. Исследование было остановлено в конце второго года [33].

Также, несмотря на выявленное положительное влияние экстракта P. niruri на cнижение титров антигена HBV, в систематическом обзоре 2014 г., использовавшем методологию сбора и анализа данных, основанную на Кокрановском справочнике систематических обзоров вмешательств, признается, что экстракты растений рода Phyllanthus могут быть полезными в сочетании со стандартной противовирусной терапией, но не имеют никакой выгоды в качестве монотерапии [34]. Кроме того, в исследованиях, проанализированных в аналогичном обзоре 2010 г., предположен риск необъективности из-за несовершенных методов распределения, неполных данных, выборочной отчетности о результатах и других факторов. Основным ограничением была продолжительность наблюдения после лечения. Одно испытание регистрировало результаты в течение 2 недель, другое в течение 24 недель, а третье – в течение 2 лет. Доступные исследования не предоставили данных о влиянии применения растений рода Phyllanthus на заболеваемость и смертность. Также около 2% участников испытали неблагоприятные последствия, которые включали легкую тошноту, снижение аппетита и боли в животе [34]. Добавим к этому, что существует высокий риск ошибки в идентификации растительного сырья, что также может приводить к необъективным результатам [16 ] .

Влияние экстрактов Phyllanthus niruri на гепатит С (HCV)

Для хронических заболеваний без эффективного лечения, помимо этого обладающего рядом побочных эффектов, таких как гепатит С [35], использование альтернативной медицины становится все более распространенным. Существует ряд исследований, посвященных влиянию экстрактов растений рода Phyllanthus на HCV. Так, Esh-era et al. указывают на то, что в целом экстракты P. niruri оказывают значительное угнетающее влияние на количество вирусных копий HCV на клетку по сравнению с эффектами интерферона альфа, но это исследование лишь подчеркивает необходимость дальнейших исследований потенциальных применений P. niruri для лечения HCV, так как результаты этого эксперимента не объясняют механизм наблюдаемого повышения жизнеспособности или подавления вируса [36].

Тем не менее, действие экстрактов P. niruri на HCV может быть не только прямым, но и опосредованным, выраженным через гепатопротективные и антиоксидантные свойства. Sarkar et al. исследовали гепатозащитную роль изолятов белка P. niruri против тиоацетамида и вызываемого им окислительного стресса. Поскольку вирус HCV также может вызывать значительный окислительный стресс в тканях и клетках из-за накопления железа в печени [37], возможно, что P. niruri может способствовать пролиферации клеток посредством гепатопротекции. Также Sarkar et al. обнаружили, что при отравлении тиоцетамидом предварительная обработка изолятами белка из P. niruri гепатоцитов мышей in vitro приводила к дозозависимому увеличению жизнеспособности клеток. Интересно, что обработка белком без воздействия тиоацетамида приводила к минимальному эффекту, что свидетельствует о том, что изоляты белка из P. niruri обеспечивают защитный эффект, а не эффект увеличения активности клетки [38].

Было показано, что экстракты и изоляты из P. niruri обладают антиоксидантным действием in vitro [38]. Sabir et al. продемонстрировали антиоксидантный и гепатозащитный потенциал водных экстрактов P. niruri. Они индуцировали перекисное окисление липидов in vitro с помощью 10 мкМ FeSO₄ и 5 мкМ нитропруссида натрия в гомогенатах печени, мозга и почек крысы. В результате применения экстракта P. niruri произошло снижение уровня глутамат-оксалоацетаттрансаминазы (GOT) и глутамат-пируваттрансаминазы (GPT) в сыворотке крови, а также повышение активности каталазы в печени в группах лечения по сравнению с контролем, что позволяет предположить потенциальное использование P. niruri в качестве антиоксиданта [40].

Влияние экстрактов Phyllanthus niruri на ВИЧ

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) – это оболочечный вирус с одноцепочечной геномоположительно-смысловой РНК. ВИЧ специфически заражает CD4+ T-лимфоциты, которые являются важными клетками иммунной системы, а также ВИЧ может манипулировать функцией дендритных клеток [41]. При отсутствии лечения это приводит к полному отказу иммунной системы и возникновению опасных для жизни оппортунистических инфекций, в конечном итоге приводящих к смерти человека.

Высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) произвела революцию в лечении пациентов. Эти синтетические препараты позволили снизить уровень виремии практически до неопределяемого уровня, уменьшить передачу (особенно по вертикальному пути), увеличить среднее время выживания пациентов и снизить вероятность возникновения оппортунистических инфекций. Однако другие проблемы связаны с высокой токсичностью такого лечения и сильными побочными реакциями, которые могут препятствовать доверию пациентов к терапии. Кроме того, существующие доказательства того, что даже при интенсивных режимах антиретровирусного лечения ВИЧ-1 сохраняется, реплицируется в покоящихся CD4+ T-лимфоцитах и в мононуклеарных клетках периферической крови, демонстрирует неудачу этих методов лечения в полной ликвидации вируса [42, 43].

Открытие того факта, что некоторые виды рода Phyllanthus ингибируют эндогенную ДНК-полимеразу гепаднавируса, указывает на возможность того, что эти экстракты также ингибируют размножение ретровирусов, поскольку обе группы вирусов имеют общую необходимость транскрибировать свой геном от РНК к ДНК, как существенный шаг в своем репликативном цикле. Ключевая роль обратной транскриптазы в репликации ретровирусов делает этот фермент очень привлекательной мишенью при терапии ВИЧ-инфекции. Эта гипотеза была подтверждена Ogata et al., которые идентифицировали специфический химический компонент (репандусиновую кислоту) из водных экстрактов P. niruri после обнаружения его ингибирующего действия против обратной транскриптазы ВИЧ-1. Это соединение тестировали на селективность и обнаружили, что он в 10 раз более эффективен в связывании с обратной транскриптазой ВИЧ-1 по сравнению с ДНК-полимеразой альфа [44].

Другое активное в отношении ВИЧ соединение, нируризид, было выделено и идентифицировано Qian-Cutrone et al. из MeOH экстрактов листьев P. niruri. Нируризид классифицируется как сапонин, фитохимическое вещество, сходное с гормонами человеческого организма. Это бесцветный порошок с молекулярной формулой C₃₈H₄₂O₁₇ и молекулярной массой 770.23 г/моль [45]. Было показано, что нируризид значительно ингибирует связывание белка REV (регуляция экспрессии вириона) с RRE RNA (REV-чувствительным элементом). Qian-Cutrone et al. обнаружили, что нируризид проявлял специфическую ингибирующую активность в отношении связывания белка REV с RRE RNA [5 ] . REV отвечает за регулирование транспортировки вирусной РНК [46].

В клинических испытаниях для лечения ВИЧ Naik et al. провели исследование in vitro на линии клеток человека МТ-4, чтобы оценить ингибирующее действие алкалоидного экстракта P. niruri на репликацию ВИЧ-1. Было установлено, что алкалоидный экстракт этого растения оказывает ингибирующее действие на вирус, а селективный индекс 50 для экстракта (50% цитотоксическая концентрация) составляет 279.85 мкг/мл. Высокое значение селективного индекса указывает на высокую токсичность в отношении клеток, инфицированных вирусом, и низкую токсичность в отношении клеток-хозяев. Naik et al. пришли к выводу, что алкалоидные экстракты P. niruri значительно ингибируют рост ВИЧ-1 и ВИЧ-2 на клеточных линиях МТ-4 человека [47].

Кроме непосредственного влияния на репликацию вирусной ДНК, P. niruri может опосредованно помогать бороться с инфекциями. Так, результаты исследования Muthulakshmi et al. демонстрируют значительное усиление как активации нейтрофилов, так и ответа антител при введении водных экстрактов P. niruri, что может указывать на его иммуностимулирующие свойства [48].

Влияние экстрактов Phyllanthus niruri на вирусы герпеса

Arboleda et al. сравнили эффективность различных видов экстрактов P. niruri на вирус простого герпеса 2 типа и вирус герпеса крупного рогатого скота 1 типа. Выяснилось, что наибольшим фактором снижения вирусной нагрузки обладал этилацетатный экстракт. В целом экстракты P. niruri проявляют цитотоксичность при концентрациях выше 250 мкг/мл [49].