Растительные ресурсы, 2020, T. 56, № 4, стр. 375-384

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для экспериментального хранения семян мы использовали лéдник, находящийся в п. Черский на севере Якутии (65.5° с.ш.), имеющий глубину около 9 м. Температуру в лéднике измеряли в 1999 и 2002 гг. ежемесячно. Она изменяется сезонно в зависимости от летнего прогрева и зимнего охлаждения грунта, а также зимнего охлаждения воздухом. В октябре, когда до глубины расположения ледника доходит волна летнего прогрева, температура может подниматься до –8 °C (максимальное зафиксированное значение). Когда зимой ледник открывают для большего охлаждения воздухом, температура в нем может опускаться до –35 °C (минимальное зафиксированное значение). Среднегодовое значение температуры в лéднике около –23 °C.

Семена 16 дикорастущих видов, относящихся к 12 родам из 8 семейств: перловник пестрый Melica picta C. Koch – сем. Poaceae, ирис сибирский Iris sibirica L. – сем. Iridaceae, гвоздика Борбаша Dianthus borbasii Vandas, гвоздика Фишера D. fisheri Spreng., мыльнянка обыкновенная Saponaria officinalis L., смолевка белая Silene alba (Mill.) E.L. Krause, смолевка двудомная S. dioica (L.) Clairv., смолевка поникшая S. nutans L., смолевка татарская S. tatarica (L.) Pers. – сем. Caryophhyllaceae, ветренница лесная Anemone sylvestris L., прострел раскрытый Pulsatilla patens (L.) Mill. – сем. Ranunculaceae, бурачок Гмелина Alyssum gmelinii Jord., резуха повислая Arabis pendula L. – сем. Brassicaceae, зверобой жестковолосистый Hypericum hirsutum L. – сем. Hypericaceae, ластовень ласточкин Vincetoxicum hirundinaria Medic. – сем. Asclepiadaceae, колокольчик рапунцелевидный Campanula rapunculoides L. – сем. Campanulaceae – были собраны в природных сообществах в Серпуховском р-не Московской обл. Для эксперимента использовали как свежесобранные семена, так и семена, хранившиеся несколько лет в комнатных условиях при температуре 18–24 °C (летом краткосрочно до 30 °C) и относительной влажностью воздуха 15–50%. Искусственное подсушивание семян не применялось. Длительность пребывания семян в комнатных условиях приведена в табл. 1, 2.

Перед закладкой семян на хранение была определена их масса (среднее 3-х взвешиваний 100 штук), влажность (высушиванием при 105 °C, среднее 3-х проб).

Исходное качество семян оценивали по их лабораторной всхожести и динамике прорастания. Динамика прорастания является более чувствительным параметром старения семян по сравнению с их всхожестью. Проращивание семян осуществляли в чашках Петри на ватно-бумажных матрасиках. Увлажняли водопроводной водой с жесткостью около 8 мгэкв/л. Проращивали семена в соответствии с ранее разработанными и опубликованными рекомендациями по проращиванию семян изучавшихся видов [8]. Прорастание семян проверяли от 2 до 6 раз в неделю (в зависимости от вида), что дало возможность оценить динамику прорастания – скорость прорастания и ее изменения за время проращивания. Лабораторную всхожесть семян определяли на выборке 200 шт. – по 50 шт. в одной чашке Петри в 4-хкратной повторности.

На хранение семена закладывались дважды в 2003 и 2012 гг., оба раза в августе. Параллельно первой партии семян, помещенной в лéдник, образцы семян хранились в лабораторных условиях в холодильнике при температуре 5 ± 1 °C, второй партии – в холодильнике при 5 ± 1 °C и в морозильнике при –20 ± 2 °C. Первая партия семян (6 видов) хранилась 8 лет, вторая (12 видов) – 3 года. Изначально эксперимент планировался на более длительный срок, но был прерван по техническим причинам. Семена двух видов (Anemone sylvestris и Pulsatilla patens) были в обеих партиях.

Для хранения семена были упакованы герметично в многослойную пластиковую упаковку. После извлечения из лéдника они доставлялись для исследования в лабораторию в замороженном состоянии.

После указанных сроков хранения была определена лабораторная всхожесть и динамика прорастания семян по тем же, что и до хранения, методикам. Температура проращивания семян до и после хранения могла незначительно отличаться, условия освещенности могли отличаться существенно, так как семена проращивали при естественном освещении. Пробы семян конкретного образца, хранившихся в разных условиях определенный срок, проращивали одновременно в одинаковых условиях. Во всех случаях, до и после хранения, контролировал прорастание один специалист.

Достоверность различий значений всхожести по вариантам хранения попарно оценивали по критерию Стьюдента с уровнем достоверности 0.95. В таблицах представлены средние значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Семена, используемые в эксперименте, существенно – на 3 порядка значений различались по массе (табл. 1, 2). Влажность разных образцов семян была от 6.2 до 13.5% (табл. 1, 2), то есть все семена были ортодоксальными. Ортодоксальными называются семена, хорошо переносящие подсушивание, их влажность в воздушно сухом состоянии не более 15%.

В результате 8-летнего хранения в лéднике снизилась всхожесть семян всех 6 видов (табл. 3). Семена Anemone sylvestris и Pulsatilla patens полностью утратили всхожесть. Всхожесть семян Silene alba, Dianthus fisheri, Alyssum gmelinii снизилась в 1.3–2.5 раза. При таком существенном изменении всхожести семян сравнивать динамику их прорастания не имеет смысла. Набухшие семена A. gmelinii не имели слизистой капсулы, которая есть у них в норме для обеспечения стабильной влажности набухших семян при нестабильной влажности окружающей среды. Проростки A. gmelinii хуже развивались по сравнению с проростками из семян, хранившихся при 5 ± 1 °C, были мелкими и желтыми. Лучше других сохранились в лéднике семена Silene nutans, но и у них выявлено статистически достоверное снижение всхожести на 14%. Ухудшилась динамика их прорастания: время прорастания 50% семян (Т⁵⁰) – 8 дней было вдвое больше исходного значения Т⁵⁰ – 4 дня.

Хранившиеся в холодильнике при температуре 5 ± 1 °C 8 лет образцы семян 4-х видов (Anemone sylvestris, Dianthus fisheri, Silene alba, S. nutans) сохранили динамику прорастания и всхожесть на уровне исходной. Всхожесть семян Alyssum gmelinii снизилась на 10%, Т⁵⁰ – 4 дня, против исходного Т⁵⁰ – 1 день. Всхожесть семян Pulsatilla patens снизилась в 1.5 раза.

Следует добавить, что по нашим данным, полученным в другом эксперименте, но с этими же образцами, семена данных 6 видов полностью сохранили всхожесть, динамику прорастания и качество проростков после 9-летнего хранения в морозильнике при –20 ± 2 °C [3, 9].

В результате 3-летнего хранения в леднике семян 12 видов на исходном уровне сохранили всхожесть и динамику прорастания семена 10 видов (табл. 4). Полностью утратили всхожесть семена Pulsatilla patens, почти полностью – Hypericum hirsutum.

Образцы семян всех видов, хранившиеся 3 года в морозильнике при температуре –20 ± 2 °C, сохранили динамику прорастания и всхожесть на уровне исходной.

Образцы семян 11 из 12 видов, хранившиеся в холодильнике при температуре 5 ± 1 °C сохранили динамику прорастания и всхожесть на уровне исходной, а всхожесть семян Campanula rapunculoides, имеющих физиологический покой, даже немного повысилась за счет уменьшения глубины покоя в процессе хранения.

Основное отличие условий хранения в морозильнике и лéднике заключалось в относительно стабильной температуре –20 ± 2 °C в морозильнике и ее изменении в лéднике в течение года в диапазоне от –35 до –8 °C. Очевидно, что такие колебания температуры в лéднике негативно повлияли на семена, ускорив их старение.

Мы намеренно использовали в эксперименте семена дикорастущих видов как более разнообразные по своим биологическим свойствам по сравнению с семенами культурных видов. Немногочисленные эксперименты по хранению семян ряда культурных видов в условиях вечной мерзлоты показали сохранение всхожести семян длительное время [10–16]. Однако, необходимо учитывать, что свойства семян большинства культурных видов растений – это результат длительного искусственного отбора в культуре, в том числе по признаку скорости старения при хранении в условиях сезонно изменяющейся температуры. Результаты многолетнего хранения семян как при низкой положительной, так и при отрицательной температуре в условиях вечной мерзлоты показали, что семена основных зерновых злаков и бобовых, введенных в культуру сотни лет назад хранятся лучше, чем семена кормовых злаков и бобовых, введенных в культуру в прошлом веке [10, 12, 17]. Имеются данные, что семена малораспространенных видов культурных растений хранятся значительно хуже семян их более часто используемых сородичей [17]. Это может быть объяснено тем, что более частое использование каких-либо видов дает больше возможностей для спонтанного мутагенеза и, соответственно, отбора по хозяйственно полезным признакам, в том числе, скорости старения.

Биологические свойства семян дикорастущих видов, в том числе скорость их старения в разных условиях, очень слабо изучены. Поэтому созданию банков семян дикорастущих, особенно редких видов, должно предшествовать изучение возможности сохранения ими жизнеспособности в различных условиях семенных хранилищ.

Наименее устойчивыми к длительному хранению в условиях колеблющейся отрицательной температуры в лéднике оказались семена Pulsatilla patens. В тоже время семена этого вида сохраняют всхожесть при температуре хранения 5 ± 1 °C до 3-х лет хранения (табл. 4), всхожесть начинает снижаться позже. Следует отметить, что для обоих экспериментов использовали свежесобранные семена P. patens (табл. 1, 2), то есть не было значительного срока предварительного хранения в неконтролируемых (теплых, комнатных) условиях. Хранение семян в таких условиях, как известно [3, 17–19], ускоряет старение при их последующем длительном хранении в условиях низких температур.

Так же очень неустойчивы к хранению в условиях колеблющейся отрицательной температуры семена Hypericum hirsutum, которые почти полностью утратили всхожесть в результате 3‑летнего хранения в леднике, но полностью сохранили всхожесть после хранения при температуре 5 ± 1 °C и –20 ± 2 °C. Ранее нами было выявлено изменение динамики прорастания и снижение всхожести семян этого вида после 6-летнего хранения при температуре –20 ± 2 °C; после хранения при температуре 5 ± 1 °C тот же срок эти показатели сохранились на исходном уровне [20]. Следовательно, на семена этого вида негативно влияет как стабильная отрицательная температура, так, в еще большей степени, изменяющаяся в течение года отрицательная температура хранения. Следует отметить, что для эксперимента использовали семена H. hirsutum, до того долго находившиеся в комнатных условиях (табл. 2), что также могло сказаться на скорости старения в эксперименте.

Несколько более устойчивы к хранению в лéднике семена Anemone sylvestris. Они сохранили всхожесть на уровне исходного значения после 3 лет, но полностью утратили ее после 8 лет хранения (табл. 3, 4). При других температурных условиях хранения (5 ± 1 °C и –20 ± 2 °C) всхожесть семян сохранилась на исходном уровне после 3 и 8 лет хранения. Для обоих экспериментов использовались свежесобранные семена этого вида (табл. 1, 2). Anemone sylvestris и Pulsatilla patens являются микробиотиками, то есть видами, семена которых быстро теряют всхожесть в теплых (комнатных) условиях. Результаты наших опытов подтвердили логичное предложение [12] тестировать хранилища на пригодность для длительного хранения семян не на культурных растениях – макро- и мезобиотиках, а на микробиотиках (классификация видов по долголетию семян по A.J. Ewart [21]).

Для выявления видов семян, устойчивых к длительному хранению в условиях отрицательной температуры с сезонными колебаниями, 3 года хранения явно недостаточно. Ранее было выявлено, что ортодоксальные семена многих видов сохранят жизнеспособность 3 года, хранясь в различных температурных условиях (–196, –20, 5 °C). Снижение всхожести семян начинается после более длительных сроков хранения [3, 9, 20]. Эксперимент по 8-летнему хранению семян 6 видов в лéднике показал, что наиболее устойчивыми к таким условиям хранения являются семена Silene nutans (табл. 3). На основании работы по восстановлению растения Silene sp. из живой ткани семян, пребывавших в условиях вечной мерзлоты около 30 тыс. лет [4, 5] и представленных нами данных, можно предположить, что семена некоторых видов р. Silene обладают повышенной устойчивостью к хранению в условиях отрицательной температуры с сезонными колебаниями.

Следует отметить, что семена, использованные в эксперименте, имели довольно высокую для ортодоксальных семян влажность от 6.2 до 13.5% (табл. 1, 2). Наиболее устойчивые к хранению в лéднике семена Silene nutans имели влажность 12.6%. Наименее устойчивые семена Pulsatilla patens имели влажность в первом опыте 11.3%, во втором – 7.7%, то есть меньше, чем у семян S. nutans. В обоих опытах хранившиеся в лéднике семена P. patens полностью утратили всхожесть. Следовательно, оптимальная для хранения семян влажность собственная у каждого вида и эта влажность может быть относительно высокой, существенно выше 5–7%-ного значения влажности, рекомендуемого стандартами генных банков для длительного хранения семян культурных видов [22].

При созревании ортодоксальных семян их влажность снижается до 3–15%, что обеспечивает сильное замедление метаболизма и, соответственно, возможность длительное время сохраняться живыми. Устойчивость клеток семян к обезвоживанию обеспечивается содержащимися в них растворимыми сахарами, LEA-протеинами (Late Embryogenesis Abundant proteins), sHSPs-протеинами (small Heat Shock Proteins), наличием механизма нейтрализации активных форм кислорода и витрификацией клеточного матрикса – формированием внутриклеточного стекла [23]. Продолжительность жизни семян коррелирует со свойствами внутриклеточного стекла [18], которые определяются LEA- и sHSPs-протеинами. Основные функции LEA-протеинов, синтезирующихся на последних стадиях созревания семян – повышение температуры стеклования, связывание воды, стабилизация биологических мембран, поддержание структуры макромолекул, защита ферментов, поддержание окислительного баланса. sHSPs-протеины противостоят окислительному стрессу в условиях водного дефицита, участвуют в сборке и стабилизируют вторичную структуру протеинов [23, 24]. Можно предположить, что семена микробиотиков отличаются от семян мезо- и макробиотиков количеством и/или спектром LEA- и sHSPs-протеинов.

Благодаря низкому содержанию воды уже при наблюдающихся в комнатных условиях температуре и влажности, клеточный матрикс ортодоксальных семян находится в витрифицированном состоянии, но свойства внутриклеточного стекла зависят от температуры [18, 25]. В витрифицированном клеточном матриксе, в том числе при отрицательных по шкале Цельсия температурах, сохраняются колебательные и вращательные движения макромолекул или их частей. Молекулярная подвижность является важным фактором регуляции физиологической активности в семенах, такой как дозревание (выход из состояния физиологического покоя) и старения семян [25]. Колебания температуры изменяют молекулярную подвижность, делают ее неравномерной. Это, вероятно, ускоряет деградацию биополимеров, в первую очередь протеинов, что ведет к ускорению старения семян.

Таким образом, использование для хранения семян лéдников в вечной мерзлоте с большой амплитудой сезонных колебаний отрицательной температуры, вызывает серьезные сомнения. Полученные результаты свидетельствуют, что при организации долговременных хранилищ семян, в том числе в условиях вечной мерзлоты, необходимо особое внимание уделять стабилизации температуры хранения. В связи с этим возникает вопрос о возможности обеспечения стабильной температуры в хранилище с конвекционным типом охлаждения. В первый год эксплуатации Якутского криохранилища температура в нем изменялась от –20 до –2 °C [26: 40; рис. 3.5 ]. Исследователи, изучавшие возможность управления температурным режимом в Якутском криохранилище, подчеркивают “неизбежность годичных колебаний температуры в рабочих камерах при охлаждении криохранилища атмосферным воздухом” [26: 39].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты экспериментов по хранению ортодоксальных семян 16 дикорастущих видов в лéднике в вечной мерзлоте с дополнительным охлаждением зимним воздухом и меняющейся в течение года температурой от –35 до –8 °C, в морозильнике при температуре –20 ± 2 °C и в холодильнике при температуре 5 ± 1 °C показали, что семена быстрее теряют всхожесть при изменяющейся отрицательной температуре хранения, чем при других условиях экспериментального хранения. Значительные колебания отрицательной температуры старят семена быстрее, чем даже хранение при низкой положительной, но стабильной температуре.

Семена разных видов растений обладают разной устойчивостью к хранению в условиях сезонно изменяющейся отрицательной температуры. Наименее устойчивы к хранению в лéднике семена микробиотиков: Pulsatilla patens и Anemone sylvestris, наиболее устойчивы семена Silene nutans.