Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2019, T. 105, № 11, стр. 1381-1391

Обширные сведения, полученные в последние десятилетия, о структуре генома человека и уже многих видов млекопитающих существенно расширили возможности исследования их наиболее сложно организованного органа – головного мозга. Появилась возможность создания тысяч генетических линий животных, моделирующих, в том числе и в головном мозге, постоянное или возникающее при специфической индукции отсутствие или, наоборот, увеличение экспрессии интересующего исследователя гена, соответственно конститутивные или кондиционные нокауты (knockout) или нокины (knockin). Использование подобных моделей, наряду с линиями трансгенных животных, экспрессирующих генетические регуляторные механизмы, отсутствующие в геноме млекопитающих, такие как, например, Tet-off, Tet-on [1] или Cre-lox системы [2], обусловлено специфическими особенностями их генотипов, создаваемых исследователями. В отличие от моделей генетические инструменты – экзогенные генетические конструкции, ряд которых перечислен в табл. 1 и далее будет представлен в обзоре, применимы как к генетически модифицированным линиям, так и к организмам, не несущим каких-либо специальных трансформаций их генома, в том числе и к человеку. Последнее позволяет рассматривать возможность использования таких инструментов не только в исследовательских, но и в медицинских целях.

Доставка генетически кодируемых инструментов в клетку. Важной, а возможно и ключевой проблемой применения инструментов, перечисленных в табл. 1, с любой целью является необходимость их доставки в клетку, что особенно затруднено в случае с клетками мозга. Для облегчения поступления в клетки относительно простых, так называемых “голых” олигонуклеотидных конструкций, нуклеотиды подвергают разнообразным химическим модификациям [3]. На их основе создают различные мультимолекулярные комплексы [4], в том числе, например, и путем сшивки олигонуклеотидов с биодеградабельными полимерами, захватываемыми клетками [5]. Используются физические воздействия (электропорация, сонификация, магнитные наночастицы), способствующие эндоцитозу или обратимым изменениям в плазматической мембране клетки, позволяющим прямой проход генетических конструкций в клетку [6].

Более сложными генетическими инструментами по сравнению с олигонуклеотидными конструкциями являются плазмиды и вирусные векторы, способные запустить экспрессию в самой клетке эффектора, необходимого для воздействия на ее функцию. Плазмиды, как более крупные по размеру, уступают олигонуклеотидам по способности проникать в клетку. Поэтому для доставки плазмид в клетки центральной нервной системы (ЦНС) используют их введение в мозг и, как правило, с последующей электропорацией, что особенно успешно в период эмбриогенеза и первых дней жизни лабораторных грызунов [6, 7].

Вместе с тем, как для простых олигонуклеотидных конструкций, так и для вирусных векторов, нацеливаемых на функции клеток мозга, пока еще трудно преодолимой преградой является гемато-энцефалический барьер. В экспериментальных работах это препятствие обходят прямым стереотаксическим введением того или иного генетического инструмента непосредственно в желаемую область мозга [6]. В клинических случаях, когда риск осложнений от введения вектора в мозг намного меньше, чем от патологического процесса, на предотвращение или ослабление которого нацелен вектор, также описано применение стереотаксических инъекций. Так, I/II фазу проходит исследование эффективности лечения болезни Паркинсона введением в мозг аденоассоциированного вируса (AAV), кодирующего декарбоксилазу ароматических L-аминокислот человека [8].

Проблема доставки генетических инструментов в клетки мозга интенсивно исследуется. Полученные результаты анализируются в многочисленных современных обзорах [например, 4, 6]. Эта заслуживающая специального рассмотрения проблема, к сожалению, далека от решения. Несмотря на это, преодолевая затруднения, перечисленные выше и ряд других, например, обусловленные нуклеазной деградацией олигонуклеотидов или необходимостью обеспечения экспрессии вектора в желаемом типе клеток, наиболее популярные генетически кодируемые инструменты, перечисленные в таблице, уже использованы в тысячах исследованиях функции мозга, индексированных в базе Web of Science.

1. Олигонуклеотиды. Одноцепочечные антисмысловые к участку мРНК-мишени олигодезоксинуклеотиды (антисенс-технология) или короткие двухцепочечные РНК, одна из цепей которой также комплементарна к участку мРНК (РНК-интерференция) позволяют сиквенс-специфически снизить уровень экспрессии целевого гена – его нокдаун (knockdown).

1.а. Антисмысловой олигодезоксинуклеотид (ASO). Антисенс-технологии как минимум четверть века, и снижение экспрессии генов с ее применением осуществлено в более чем в 3000 работах, присутствующих в базе данных PubMed. ASO представляет собой короткий аналог ДНК, как правило, несущий химические модификации, защищающие его от деградации нуклеазами. ASO сиквенс-специфически гибридизуется с комплементарной мРНК по правилу спаривания оснований Уотсона–Крика. Гетеродуплекс ASO–мРНК активирует РНКазу Н, разрушающую мРНК и сам ASO. Формирование дуплекса также способно индуцировать остановку трансляции за счет стерического препятствия работе рибосомы. Кроме того, оно дестабилизирует пре-мРНК в ядре, что приводит к понижающей регуляции экспрессии белка, кодируемого мРНК-мишенью, а также нарушает созревание мРНК путем ингибирования сплайсинга, что, как и снижение экспрессии гена-мишени, может быть использовано в терапевтических целях. Следует отметить, что эффективная работа ASO достигается лишь при соблюдении при его конструировании правил выбора последовательности нуклеотидов, осуществляемого на основе учета вторичной структуры мРНК-мишени, а также предпочтительного состава и порядка нуклеотидов в сегменте, гибридизующимся с ASO [8, 9]. В сотнях исследований антисенс-технология успешно использовалась для выяснения механизмов регуляции физиологических функций и поведения. Например, введение в область скопления норадренергических нейронов в стволовой части головного мозга взрослых самцов крыс ASO к мРНК альфа2А-адренорецептора снижало уровень этого транскрипта и количество рецепторов в мозге, т.е. его экспрессию, что сопровождалось ослаблением проявлений тревожности и повышением внимания животных к особям противоположного пола [11].

Возможность использования ASO в терапевтических целях также активно исследуется во множестве клинических испытаний различных стадий, о которых сообщается в более чем 250 публикациях, представленных в базе PubMed. Однако лишь очень небольшая часть этих публикаций касается нервной системы, что вполне объяснимо весьма ограниченной возможностью доставки генетически кодируемых инструментов в головной мозг имеющимися в настоящее время способами. В связи с этим, пока единственный олигонуклеотидный препарат Nusinersen, одобренный для использования в США, нацелен на нормализацию функции моторных нейронов спинного мозга, дегенерирующих в результате мутации в гене жизнеспособности этих нейронов (SMN1) при спинальной мышечной атрофии. Имеющийся у человека ген SMN2 функционален у всех пациентов, но содержит замену C-на-T в 7-ом экзоне, которая обусловливает удаление этого экзона из большинства транскриптов гена SMN2, что приводит к синтезу нестабильного белка, неспособного компенсировать мутацию в основном гене SMN1. Антисмысловой олигонуклеотид Nusinersen при интратекальном введении обеспечивает включение экзона 7 в большинство мРНК SMN2 и, как следствие, выработку полнофункционального белка SMN, предотвращающего гибель мотонейронов [12, 13].

1.б. Короткая интерферирующая РНК (siRNA). Обнаружение в 2001 г. принципиальной возможности использования механизма РНК-интерференции для сиквенс-специфического снижения экспрессии генов в клетках млекопитающих [14] открыло новые перспективы для исследования функции генов млекопитающих, в том числе и в их головном мозге. РНК-интерференция – процесс ген-сайленсинга, в котором короткая (обычно 21 п.н.) двухцепочечная РНК вызывает гомологично-зависимую деградацию мРНК-мишени с участием индуцируемого РНК комплекса белков ген-сайленсинга (RISC – RNA Inducible Silencing Complex), в который включена антисмысловая к мишени цепь siRNA [15]. Молекулярные особенности функционирования этого эндогенного для клеток млекопитающих комплекса определяют предпочтительный размер siRNA, антисмысловая цепь которой – комплементарная к участку мРНК-мишени, адресует RISC на связывание с мишенью, разрезаемую нуклеазой комплекса. Сам комплекс, в отличие от ASO, при этом сохраняет свою целостность и активность. Поэтому однократное применение siRNA приводит к более продолжительному, чем ASO, снижению уровня мРНК мишени, которое при соблюдении правил конструирования эффективных siRNA [15] в зависимости от транскрипционной активности гена-мишени и стабильности его белка способно понижать уровень этого белка на протяжении нескольких дней. РНК-интерференция уже успешно применялась в тысячах исследованиях ЦНС и поведения.

Кроме установления функций исследуемых генов и кодируемых ими белков во взрослом мозге, siRNA предоставляет возможность анализа последствий сравнительно непродолжительного нарушения экспрессии нейрогена в критические сроки онтогенеза для нейрофизиологических и поведенческих свойств организма в последующие периоды жизни. В одном из первых исследований кратковременное снижение уровней мРНК и белка альфа2А-адренорецепторов с помощью короткой интерферирующей РНК в мозге новорожденных крысят приводило в дальнейшем, во взрослом состоянии, к повышению плотности этих рецепторов в ряде отделов мозга, что сопровождалось аномальным для грызунов снижением их тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте [16]. Применение siRNA позволило обнаружить, что даже кратковременное изменение экспрессии гена рецептора нейротрансмиттера в критический период развития мозга может приводить к продолжительному нарушению нейрохимии и поведения. Значение этого впервые выявленного механизма определяется способностью обычных факторов раннего онтогенеза, таких, как стресс, терапия или качество материнской заботы, индуцировать изменения в экспрессии нейрогенов, подобные действию РНК-интерференции и, следовательно, предрасполагать к развитию психопатологии в последующие периоды жизни [17].

Наряду с фундаментальными исследованиями проводятся обширные доклинические и клинические испытания возможности применения РНК-интерференции в ЦНС с терапевтическими целями. Естественной мишенью такой терапии могут быть опухоли мозга, в которые при хирургическом вмешательстве может быть введена siRNA [18]. С низкой доступностью мозга для siRNA связано нацеливание единственной недавно одобренной небольшой интерферирующей РНК, Patisiran (ALN-TTR02), на лечение периферической нейропатологии – аутосомно-доминантной семейной амилоидной полинейропатии. При этом заболевании происходит отложение амилоида в периферических нервах с последующей прогрессирующей нейродегенерацией и необратимым ухудшением неврологических функций [19].

2. Вирусные векторы. Вирусные векторы способны в самой клетке запустить экспрессию эффектора, необходимого для воздействия на ее функцию. Для этого применяются разнообразные вирусы, например, ленти-, ретро-, адено-, аденоассоциированные (AAV), а также и некоторые другие вирусы [20]. Каждый из типов вирусных векторов имеет определенные преимущества и ограничения, которые делают их более или менее подходящими для конкретного исследования. Для экспрессии генетически кодируемых инструментов в ЦНС предпочитаемым вариантом считаются AAV благодаря их минимальной токсичности, очень низкой скорости интеграции в геном [21] и способности трансфецировать как делящиеся, так и постмитотические клетки. Адресация действия вирусного вектора в определенном типе клеток осуществляется преимущественно за счет избирательной активности в клетках-мишенях промотора гена, кодируемого вектором. Вектор стереотаксически вводится в желаемую структуру головного мозга на необходимой стадии онтогенеза, поэтому он не влияет на предшествующие стадии развития. Во многих исследованиях вирусные векторы используются в комбинации с трансгенными животными, преимущественно имеющими механизм Cre/loxP рекомбинации [22, 23]. В этом случае векторы обеспечивают работу кодируемых ими генетических конструкций только в клетках с Cre-рекомбиназой. В настоящее время имеются сотни Cre-рекомбиназных линий мышей, способных обеспечить избирательную экспрессию вектора в разных структурах головного мозга и типах его клеток [2, 24]. С помощью вирусных векторов в клетках, в том числе и в клетках нервной системы, могут быть наработаны разнообразные генетически кодируемые инструменты, как снижающие, так и повышающие экспрессию исследуемого белка, избирательно регулирующие активность клеток управляемыми исследователем стимулами, маркирующие цепочки взаимодействующих нейронов, редактирующие геном, а также контролирующие экспрессию генов. Некоторые из этих применений вирусных векторов рассмотрены ниже.

2.а. Генетически активные олигонуклеотиды. Последовательности, кодирующие два типа олигонуклеотидов: короткие шпилечные РНК (shRNAs) и искусственные микроРНК (miRNAs), могут быть доставлены в клетки вирусным вектором с целью снижения экспрессии гена-мишени. shRNAs и miRNAs действуют с помощью РНК-интерференции, но включаются в этот механизм на разных стадиях его реализации. В отличие от shRNAs, miRNAs нуждаются во внутриядерной стадии превращения перед экспортом в цитоплазму, в которой эти молекулы активируются рибонуклеазой DIСER [25] и далее могут быть включены в РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC). Этот комплекс распознает мРНК-мишень и либо репрессирует трансляцию в случае частичной комплементарности мишени, либо индуцирует расщепление мРНК в случае полной комплементарности. Повышенные количества shRNAs, которые обычно нарабатываются под контролем сильных промоторов полимеразы III, могут вызывать насыщение и блокаду эндогенного механизма РНК-интерференции, обусловливая токсичность этих инструментов из-за конкуренции между эндогенными и экзогенными молекулами. Переключение контроля экспрессии shRNA/miRNAs на более слабый промотор ДНК-полимеразы II позволяет снизить их продукцию и, тем самым, токсичность. Хотя молекулы нацеливаются на определенные мРНК, тем не менее, могут наблюдаться нецелевые эффекты из-за неспецифического связывания со сходными по сиквенсу транскриптами, которые должны учитываться в процессе конструирования этих генетически кодируемых инструментов [26].

2.б. Белки. Вирусные векторы используются в качестве средства доставки в клетки генетических конструкций, кодирующих как терапевтические, так и потенциально токсичные или патогенные белки. Высокая экспрессия трансгенного белка обнаруживается в мозге даже после длительных периодов времени после вирусной трансдукции, что делает этот метод мощным инструментом для создания моделей заболеваний и их терапии. Наряду с самим вектором, важным аспектом, например, нейротрофической терапии болезни Паркинсона является необходимость учета свойств мишени – дофаминовых нейронов черной субстанции, для выбора области введения AAV, кодирующего тот или иной терапевтический белок, – в полосатое тело или черную субстанцию [27]. Имеются также данные о неспецифических реакциях и даже гибели клеток-мишеней из-за сверхэкспрессии белка, и поэтому использование таких белков в исследованиях нейродегенерации необходимо тщательно контролировать [27]. В связи с этим способность модулировать экспрессию трансгена имеет решающее значение для применения вирусных векторов в клинике [28]. С целью регуляции экспрессии трансгена в эукариотических клетках, в том числе и в клетках мозга, используются, например, контролируемые тетрациклином системы Tet–Off и Tet–On [1, 29]. Эти системы основаны на регуляторных элементах, которые контролируют в бактериях активность оперона устойчивости к тетрациклину. Система Tet–Off позволяет подавлять экспрессию генов после введения тетрациклина или его аналогов, таких как доксициклин, а система Tet–On позволяет активировать экспрессию генов посредством этих же препаратов. Такие системы регуляции активности генов могут быть встроены в вектор. Они широко применяются как в фундаментальных биологических исследованиях, так и в биотехнологии и генной терапии. Следует, однако, отметить, что сам доксициклин оказывает влияние на функции мозга [30], и его собственные эффекты необходимо контролировать. В клинике для терапии болезни Паркинсона исследовалась доставка с помощью AAV в мозг человека трех генов, кодирующих белки: фермента преобразования L-дофа в дофамин декарбоксилазу ароматических L-аминокислот человека в путамен [8], фермента синтеза GABA глутаматдекарбоксилазу в субталамическое ядро, демонстрирующее у пациентов высокую активность, а также нейротурина, обеспечивающего нейротрофическую поддержку, в нигростриатный тракт. Эти клинические испытания показали безопасность доставки AAV в мозг человека, однако, терапевтические эффекты были скромными [28].

2.в. Компоненты системы CRISPR/Cas9. (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – кластеризованные, регулярно разделенные, короткие палиндромные повторы)/CRISPR associated protein 9 – ассоциированный с CRISPR белок 9, который является эндонуклеазой, управляемой направляющей РНК). Бактериальная система CRISPR/Cas9 защищает клетки прокариот от проникновения в них чужеродной ДНК. Эта система нацеливается на ген-мишень фрагментом направляющей РНК (guide-RNA), включаемой в CRISPR/Cas9 комплекс. Эта РНК обеспечивает взаимодействие системы CRISPR/Cas9 с целевым участком в геномной ДНК, длиной в среднем 20 п.н. по правилу комплементарного спаривания оснований, а каталитически активная нуклеаза Cas9 делает в этом месте двунитевой разрыв ДНК, который может быть использован для изменения структуры гена в необходимом направлении. Это свойство стало основой для создания на базе системы CRISPR/Cas9 инструментов редактирования генома как митотических клеток, так и зрелых постмитотических нейронов in vitro и in vivo [31], позволяющих внесение модификаций в целевые гены для изучения их функций, генных сетей в мозге, а также моделировать различные патологические состояния без получения новых линий животных с модифицированным геномом.

Для функционирования CRISPR/Cas9 необходима экспрессия в клетке как белка Cas9, так и направляющей РНК. Большие для ААV-векторов размеры CRISPR/Cas9-системы, стимулировали разработку минимизированных конструкций на основе цитомегаловирусных векторов для эффективной доставки нуклеазы и направляющей РНК [32]. Для преодоления ограничений, диктуемых емкостью ААV-векторов, они могут использоваться парой: отдельно для Cas9 и для sgRNA (single guide RNA) [33]. Следует также отметить возможность нецелевой активности CRISPR/Cas9-нуклеаз, что необходимо учитывать при планировании использования этой системы [34]. Несмотря на перечисленные сложности, эта система активно используется как в фундаментальных, так и доклинических исследованиях, в том числе и функций головного мозга.

Например, доставка генетических конструкций, кодирующих элементы CRISPR/Cas9, нацеленные на ген субъединицы GluN1 NMDA-рецептора, в мозг эмбриона мыши привела к нокауту этого рецептора и к уменьшению соотношения NMDA/AMPA рецепторных токов [35]. Наряду с изменением структуры генов, создание каталитически неактивной dCas9, лишенной нуклеазных доменов, обеспечило появление инструментов для контроля экспрессии генов, маркировки специфических нуклеотидных последовательностей в мозге с высокой специфичностью и эффективностью. Не разрезающая ДНК dCas9, тем не менее, адресуется на участки генома, комплементарные направляющей РНК, и действует как якорная система для присоединенных к ней разнообразных белков. В качестве таких белков могут быть, например, активаторы или репрессоры транскрипции [36, 37], маркерные флуоресцентные белки, а также иные эффекторы, влияющие на структуру и функцию ДНК в районах, прилегающих к участкам генома, комплементарным направляющей РНК [38]. Универсальность и относительная простота системы CRISPR позволяет использовать ее для разнообразных целей, в их числе и для анализа транскрипционных и эпигенетических механизмов. С помощью этой системы ожидается углубление понимания генетических и эпигенетических основ нейрональной пластичности, поведения и психоневрологических расстройств.

2.г. Фото- и хемочувствительные белки, влияющие на активность клетки. Первая однокомпонентная система, способная при воздействии света изменять активность нейрона [39], была создана в 2005 г. и через год был предложен термин “Оптогенетика” (Optogenetics). Через несколько лет был создан еще один подход изменения активности нейрона в желаемом направлении с помощью воздействия химическим лигандом – “Хемогенетика” (Chemogenetics) [40]. Принципы функционирования и результаты, полученные с использованием каждого из этих подходов, суммированы в ряде отечественных и в сотнях зарубежных обзоров, и лишь малое их число может быть упомянуто в данной статье [41–44]. Как опто-, так и хемогенетика позволяют селективно изменять активность конкретных нейронов и их ансамблей. Оба подхода базируются на экспрессии в желаемом типе клеток, в том числе и нервных, новых для организма белков-рецепторов, воспринимающих в первом случае свет определенной длины волны, а во втором – необычную для организма химическую молекула лиганда, связывающуюся с этим рецептором. При поступлении к клетке сигнала, воспринимаемого ее новым рецептором, в зависимости от молекулярных особенностей рецептора, множество типов которых уже создано, активность клетки, например, частота разрядов нейрона, повышается или, наоборот, снижается. Каждый из подходов имеет свои преимущества и недостатки, которые необходимо учитывать при планировании их использования. Так, при поступлении света на оптогенетический рецептор, ответ нейрона происходит практически мгновенно. В то же время для развития ответа на хемогенетический сигнал необходимо более получаса. Поэтому при анализе немедленных реакций предпочтительнее оптогенетика. Так, в опытах с оптогенетической стимуляцией глутаматергических нейронов области СА1 дорзального гиппокампа, которая обеспечивалась экспрессией в этих нейронах фоточувствительного канала ChR2H134 под специфичным для этих нейронов промотором CAMKIIa в составе AAV вектора, впервые установлено, что увеличение проявления депрессивно-подобного поведения крыс – продолжительности неподвижного состояния в тесте, происходило только непосредственно под влиянием оптостимуляции – в 1-минутные периоды теста, когда клетки гиппокампа освещались синим (470 нм) светом, и не наблюдалось в чередующиеся со световыми 1-минутными периодами без оптостимуляции [45]. Оптогенетический подход позволил, например, также впервые обнаружить быстрое повышение в ответ на активацию нейрона экспрессии белка Bcl-xl, сходное по времени с индукцией гена раннего ответа c-Fos [46].

Из двух подходов, обеспечивающих избирательное по типу клеток и анатомической локализации изменение активности нейронов, хемогенетика, особенно в варианте DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs) [47], более привлекательна, чем оптогенетика, для анализа и модуляции функции нейронных сетей, участвующих в проявлении, например, психо-поведенческих свойств организма. Преимущество хемогенетики по сравнению с оптогенетикой заключается в возможности одним и тем же лигандом активировать одни и одновременно ингибировать другие участки нейронной сети в условиях свободного поведения животных [48]. Это преимущество обусловливает возможность хемогенетического подхода модифицировать в желаемом направлении активность взаимодействующих структур мозга, что поможет выяснить, как изменения коннективности мозга реализуются в психо-поведенческих проявлениях.

В целом, уже существующие, а также постоянно создаваемые новые генетически кодируемые инструменты открывают широчайшие возможности для исследований функций мозга и коррекции их нарушений как на молекулярно-клеточном уровне, так и на уровне нейрональных сетей. Последнее является особенно важным в свете все более укрепляющихся представлений, что проявления когнитивных дисфункций и психопатологии [40], а также дополнительные возможности их терапии, в том числе и с использованием технологии DREADDs [49], базируются не только, а может быть и не столько на внутринейронных и/или синаптических процессах, сколько на согласованной нормальной или аберрантной активности нейронных сетей [50], участвующих в осуществлении высших функций головного мозга.