Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2019, T. 105, № 9, стр. 1113-1121

Изучение молекулярных механизмов экспрессии генов в скелетных мышцах на протяжении многих лет остается одной из актуальных проблем молекулярной генетики и физиологии человека. До недавнего времени в генетике доминировало представление о том, что ДНК является единственным носителем наследственной информации. Расшифровка геномов человека и других организмов вскрыла не только принципы организации ДНК, но и показала сложность процессов регуляции экспрессии структурных и метаболических генов. Оказалось, что внешние воздействия такие как питание, стресс, физические нагрузки и другие стимулы изменяют экспрессию генов и их действие контролируется сложным набором регуляторных механизмов.

Возникла необходимость в более четком определении понятий, и кроме термина геном сейчас широкое распространение получил термин эпигеном, который включает совокупность элементов, регулирующих экспрессию генов. К эпигенетическим модификациям относят метилирование ДНК и гистонов, модификации гистонов и регуляторных белков в реакциях ацетилирования, фосфорилирования, убиквитинирования, сумоилирования, ацетилглюкозоаминирования и протеолитическое расщепление. Каскады реакций, связанные с эпигенетической посттрансляционной модификацией белков, являются универсальным механизмом контроля внутриклеточного метаболизма, обеспечивающего дифференцировку, трансформацию, гипертрофию и атрофию мышечных клеток.

Цель статьи – показать участие эпигенетических факторов в регуляции метаболизма скелетных мышц при различных функциональных состояниях человека.

Многочисленные генетические исследования, проводимые в разных странах, показали, что регуляция метаболизма в организме человека представлена не только экспрессией генов на уровне ДНК, но включает более сложный механизм с участием эпигенетических факторов. Кроме того, стало понятно, что помимо структурных особенностей ДНК (полиморфизмы, мутации), на предрасположенность человека к выполнению физических нагрузок влияют эпигенетические модификации, которые по своей природе являются обратимыми процессами и могут оказывать положительное либо отрицательное действие на физическую работоспособность.

Рассмотрим кратко последние достижения в эпигенетике человека, связанные с проявлением физической активности. Мышечные клетки обладают врожденными и индивидуальными эпигенетическими признаками, называемыми эпигеномом, который составляет два общих эпигенетических события: метилирование ДНК и модификацию гистонов. Эти процессы контролируют конформацию ДНК в двух разных состояниях: открытом с транскипционно активным эухроматином и закрытом с транскрипционно неактивным гетерохроматином. Таким образом, регулируется участие ДНК в процессах транскрипции, репарации и репликации.

Метилирование представляет собой временную химическую модификацию нуклеотидной последовательности без нарушения кодирующей способности ДНК. В этом случае обратимое метилирование рассматривается как эпимутация в отличие от мутации, приводящей к нуклеотидным заменам, делециям или вставкам нуклеотидов. Процесс метилирования и деметилирования ДНК в скелетных мышцах катализируют ДНК-метилтрансферазы (DNMT) и деметилазы, называемые десять-одиннадцать транслоказными энзимами (TET). В скелетных мышцах человека процесс метилирования ДНК включает перенос метильной группы (–CH₃) в положение С5 нуклеотида цитозина, который катализирует семейство DNMTs, состоящее из трех ферментов, различающихся по интенсивности экспрессии под влиянием физической нагрузки. Метилирование происходит в CpG-островках, в результате чего образуются метилСpG-последовательности на обеих цепях ДНК [1]. Семейство TETs включает 3 фермента TET1, TET2 и TET3, которые катализируют каскад окислительных реакций с участием 5-метилцитозина (5mC). На первом этапе 5-метилцитозин превращается в 5-гидроксиметилцитозин (5-hmC), который в дальнейшем окисляется в 5-формилцитозин (5fC) и 5-кабоксицитозин (5caC) [2, 3]. Теперь 5fC и 5caC становятся субстратами для фермента тимин-ДНК-гликозилазы (TDG), способного удалять их из молекулы ДНК. Восстановление цитозина в структуре ДНК происходит с участием мультибелкового комплекса BER (base excision repair) [4].

Из семи возможных модификаций гистонов в статье рассматриваются только процессы метилирования и ацетилирования гистонов в скелетных мышцах, поскольку именно они наиболее интенсивно изменяются при выполнении физических нагрузок. Метилирование гистонов имеет более разнообразный характер и приводит к разным изменениям интенсивности экспрессии генов. Метилирование лизина 4 в гистоне H3 (H3K4me3) вызывает увеличение экспрессии генов. При метилировании лизина в положении 9 и 27 гистона H3 (H3K9me2/3 и H3K27me3) и лизина 20 в гистоне H4 (H4K20me3) происходит угнетение экспрессии генов. Предполагается, что монометилирование гистонов приводит к активации процессов транскрипции, тогда как ди- и триметилирование, напротив, сопровождается угнетением транскрипции. Управление этими процессами происходит в реакциях взаимодействия между модификацией гистонов и метилированием ДНК [5]. Эпигенетические модификации, связанные с метилированием ДНК и гистонов, сопровождаются изменением экспрессии генов при наличии сигналов из внешней среды, в особенности это проявляется на моделях различных физических нагрузок.

Важным шагом в понимании роли метилирования ДНК в экспрессии генов в скелетных мышцах стало исследование, выполненное на разных типах мышечных волокон человека [6]. В медленных и быстрых типах мышечных волокон выявлены разные места метилирования ДНК и показана экспрессия ряда структурных и метаболических генов. Так, в медленных мышечных волокнах обнаружено гиперметилирование генов, участвующих в анаэробном метаболизме, таких как ген Са-АТФазы эндоплазматического ретикулума быстрой изоформы (SERCA1), фосфофруктокиназы (PEKM), альдолазы А (ALDOA) и разобщающего белка 3 (UCP3). С другой стороны, в быстрых мышечных волокнах выявлено гиперметилирование генов, которые участвуют в аэробном метаболизме, такие как ген Са-АТФазы эндоплазматического ретикулума медленной изоформы (SERCA2) и лактатдегидрогеназы B (LDHH). Предложенный авторами метод определения мест метилирования в специализированных мышечных волокнах открывает новые возможности для выявления молекулярных различий в тяжелых цепях миозина I и IIa скелетных мышц.

Выполнение физической нагрузки вызывает изменение метилирования промоторов метаболических и структурных генов в скелетных мышцах. Так, в мышцах человека после однократной физической нагрузки происходит снижение метилирования промоторов генов PGC-1α, TFAM, MEF2A, CS и PDK4 [7]. В процессе метилирования промоторов генов в скелетных мышцах принимают участие многочисленные метаболические пути, регулирующие освобождение Ca²⁺, усиление окислительного фосфорилирования и повышение продукции ATФ; оказывают влияние изменение отношения AMФ/ATФ, активация 5-AMФ протеинкиназы (AMPK), увеличение активных форм кислорода, изменение содержания S-аденозилметионина, основного поставщика метильных групп, а также возможное усиление реакций деметилирования с участием ферментов TET/BER [8]. Совокупный эффект этих метаболических реакций создает условия для успешного осуществления реакции метилирования с участием семейства ферментов метилтрансфераз.

В результате выполнения тренировочной программы в течение 6 месяцев произошло изменение профиля метилирования ДНК в скелетных мышцах испытуемых. Большинство исследованных генов после такой тренировки находились в различной степени гипометилирования [9]. Таким образом, достаточно убедительно показано, что однократные и систематические физические нагрузки сопровождаются изменениями степени метилирования ДНК в скелетных мышцах, и это является наиболее значимым эпигенетическим фактором [10–12].

В посттрансляционной модификации белков два типа ферментов контролируют обратимость ацетилирования остатков аминокислоты лизина в молекуле гистонов: гистоацетилтрансфераза (HAT) и гистондеацетилаза (HDAC). Эти ферменты катализируют перенос ацетильной группы на аминокислоту лизин в N-концевом участке молекулы гистонов H2A, H2B, H3 и H4. В настоящее время идентифицировано 18 ферментов HDACs, которые разделены на 4 класса. В регуляции метаболизма скелетных мышц участвуют ферменты, включенные в класс IIa. Эти ферменты имеют существенное отличие от других классов гистондеацетилаз, прежде всего потому, что являются тканеспецифичными и участвуют в регуляции метаболизма скелетных и сердечной мышц. Ферменты класса IIa участвуют в реакциях со специфическими транскрипционными факторами и их зависимое от сигналов ядерно-цитоплазматическое перемещение оказывает эффект на регуляцию генов в скелетных мышцах [13].

В состоянии покоя ферменты HDACs класса IIa находятся в ядрах в дефосфорилированном виде и взаимодействуют с транскрипционными факторами и регуляторными белками в качестве регуляторов активности генов. При наличии информационных сигналов, поступающих в ядро, происходит фосфорилирование HDACs, приводящее к распаду белковых комплексов с транскрипционными факторами и за этим следует выход ферментов в цитоплазму.

Регуляция метаболизма в скелетных мышцах при выполнении физических нагрузок различной интенсивности и длительности происходит с участием ферментов HDACs класса IIa. Роль этих ферментов изучалась на разных моделях как при однократном, так и систематическом физическом воздействии. Фосфорилирование HDAC и транспорт фермента из ядра способствует усилению транскрипционного ответа при выполнении физической нагрузки. Следовательно, группу ферментов HDACs можно рассматривать как ключевые регуляторы метаболизма в скелетных мышцах, контролирующие процессы метаболической адаптации к внешним воздействиям, в том числе к физическим нагрузкам [13].

В последние годы появились факты, которые показывают, что связь между эпигенетикой и метаболизмом является двухсторонней с участием метаболитов из общих метаболических путей, используемых для модификации белков и ДНК. Ключевым фактором для регуляции метаболизма скелетных мышц является транскрипционный контроль экспрессии метаболических ферментов. Это положение можно рассматривать как основное для эпигенетического регулирования [8, 14]. В качестве подтверждающего примера можно привести содержание ацетил-СоА в цитоплазме и ядре мышечных клеток, поскольку именно он служит субстратом в реакции ацетилирования белков. При наличии в мышечной клетке ферментов ацетилтрансфераз и деацетилаз фактически процесс регулируется высоким уровнем ацетил-СоА, при низком содержании этого субстрата процесс становится неэффективным [1]. Таким образом, доступность ацетил-СоА для ацетилирования гистонов во многом определяет интенсивность экспрессии генов и уровень метаболизма в скелетных мышцах как в покое, так и при функциональной активности. Увеличение активности фермента АТФ-цитратлиазы (ACL) в мышцах повышает метаболизм в митохондриях, и при этом возрастает продукция АТФ. Таким образом, повышение доступности ацетил-СоА приводит к увеличению метаболизма скелетных мышц.

В недавно опубликованной статье австралийских ученых обсуждается проблема наследования потомством метаболических фенотипов скелетных мышц [8]. Подробно рассматриваются изменения в метаболизме скелетных мышц, обусловленные посттрансляционными модификациями гистонов в реакциях ацетилирования/деацетилирования и метилированием ДНК, в моделях на клеточных культурах, экспериментах на животных и физических нагрузках у людей. Метилирование ДНК и модификация гистонов в реакциях ацетилирования и метилирования, а также участие микроРНК выполняют важную функцию в эпигенетической регуляции экспрессии генов и метаболизма скелетных мышц при различных функциональных состояниях человека [8, 14].

Классическая триада РНК-компонентов синтеза белков (информационные, транспортные и рибосомальные) постепенно расширялась, и выявлялись новые некодирующие белок РНК с различными функциями. Решающий прорыв произошел в начале 2000 годов, когда был открыт класс малых РНК, микроРНК, содержащих ~22 нуклеотида. Эта группа некодирующих белок РНК принимает участие в регуляции многих клеточных процессов у разных представителей животного и растительного мира. Синтез микроРНК включает несколько этапов [15]. На первом этапе фермент РНК полимераза II синтезирует длинную двухцепочечную первичную примикроРНК из независимых геномных транскрипционных единиц или из интронов белок-кодирующих генов. На втором этапе фермент РНКаза III – Drоsha вырезает более короткую премикроРНК из примикроРНК, которая состоит из 60 нуклеотидов. Из одной примикроРНК может быть образована одна или несколько премикроРНК. Фермент Drosha является компонентом большого комплекса-микропроцессора. Этот ядерный комплекс существует в двух формах: структура 600 кДа, функция которой пока не установлена, и гетеродимер, включающий Drosha и РНК-связывающий белок DGCR8. Субклеточное распределение микроРНК-синтезирующих ферментов и их субстратов показывает, что примикроРНК образуются в ядрах, тогда как премикроРНК используются в цитоплазме. Транспорт премикроРНК из ядра в цитоплазму через ядерные поры происходит с участием ядерного транспортного рецептора Экспортина 5. Кроме транспортной функции белок Экспортин 5 защищает премикроРНК от деградации экзонуклеазами [16]. В цитоплазме РНКаза III эндонуклеаза Dicer вместе с РНК-связывающим партнером TRBR (транспортным РНК-связывающим белком) вырезают из премикроРНК двуцепочечный фрагмент длиной ~22 нуклеотида. Эта молекула зрелой микроРНК, при участии белков шаперонов HSP70 и HSP90 присоединяется к белку Аргонавту (AGO2). Для связывания с AGO2 на 5' конце молекулы микроРНК имеется домен, состоящий из 6–8 нуклеотидов. Затем происходит разделение нитей РНК, одна из них – проводник переносится на РНК-индуцируемый комплекс выключения гена (RISC), а другая нить РНК подвергается деградации. В дальнейшем зрелая микроРНК в комплексе с RISC через 3'-UTR и очень короткий участок молекулы (seed) взаимодействует с мРНК-мишенью [15]. Активность ферментов Dicer и Drosha может изменяться при взаимодействии с различными факторами. Так, белок холодового шока (RBM3, РНК-связывающий мотив белок 3) способствует усилению ассоциации премикроРНК с Dicer, что приводит к ускорению образования зрелой микроРНК. Кроме того, показано, что белок RBM3 способен участвовать в регуляции размеров мышц [17]. Хотя основное количество микроРНК образуется по стандартному пути, имеется также и альтернативный путь, в котором синтез микроРНК происходит без участия ферментов Drosha и Dicer [18]. Так, синтез miR-451 происходит с участием премикроРНК и AGO2 [19]. Следует отметить, что образование микроРНК может осуществляться также с участием нуклеаз других сигнальных путей, в том числе основного механизма деградации РНК и факторов сплайсинга премикроРНК [15]. МикроРНК осуществляют посттранскрипционный сайленсинг генов – РНК-интерференцию. Они способны регулировать интенсивность процессов транскрипции, процессинга РНК и трансляции посредством комплементарного взаимодействия с ДНК или мРНК в разных органах и тканях человека. По данным биоинформационной оценки мишеней микроРНК до 60% всех генов человека находятся под контролем микроРНК. Каждая микроРНК имеет сайты связывания со многими мРНК, а одна мРНК представляет собой возможную мишень для нескольких микроРНК. Таким образом, микроРНК и мРНК образуют сложную сеть регуляторных взаимодействий, которая участвует в эпигенетической модификации экспрессии генов [20].

В скелетных мышцах тканеспецифическими микроРНК являются miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-206, которые получили название миомиРНК. Эти четыре микроРНК принадлежат к семейству miR-1, которое может быть на основе различий специфических последовательностей в структуре молекулы разделено на две группы: miR-1/206 и miR-133a/b. Следует отметить, что микроРНК регулируют основные функции скелетных мышц, такие как миогенез, энергетический метаболизм, синтез белков, гипертрофию и атрофию. Семейство миомиРНК постепенно расширяется и в настоящее время включает 7 микроРНК: 1, 133, 206, 208а, 208b, 486, 499. Важной характеристикой этого класса РНК является возможность одной микроРНК регулировать экспрессию многих других микроРНК и белков-мишеней, которые участвуют в метаболизме скелетных мышц [21, 22]. Это свойство указывает на наличие у некоторых микроРНК избыточных функций, и в этом случае потеря регуляторной функции одной микроРНК не всегда приводит к изменению экспрессии белка-мишени. В процессе метаболизма разные микроРНК взаимодействовуют между собой и совместно создают важную молекулярную систему, которая регулирует и поддерживает клеточный баланс [23]. МикроРНК регулируют метаболизм и биогенез митохондрий не только в скелетных мышцах, но и в других органах и тканях человека [24, 25]. В митохондриях существуют два вида миомиРНК, контролирующих митохондриальный геном: во-первых, ядерные микроРНК, которые транспортируются в митохондрии, и во-вторых, митохондриальные микроРНК, ингибирующие функции тРНК [26]. Открытие локализованных в митохондриях микроРНК, получивших название митомиРНК, поставило вопрос о механизмах их транслокации из цитоплазмы и возможности образования непосредственно с участием митохондриальной ДНК. Эти процессы требуют обеспечения энергией и относятся к АТФ-зависимым. Установлено, что продукция АТФ в процессе окислительного фосфорилирования в митохондриях регулируется с участием miR-156, miR-16, miR-195 и miR-424 [27]. Кроме того, miR-181c, miR-210 и miR-338 регулируют отдельные звенья цепи транспорта электронов в митохондриях [28]. Исследования, выполненные на животных и контингентах людей разного возраста, использовавших различные виды физических нагрузок, показали участие эпигенетической модификации в экспрессии структурных и метаболических генов в скелетных мышцах. Применение однократных и систематических физических нагрузок разной энергетической направленности позволило не только выявить новые миомиРНК, но и определить интенсивность экспрессии генов, участвующих в метаболизме скелетных мышц [27, 29, 30].

В процессе систематического выполнения аэробных физических нагрузок возрастает уровень экспрессии микроРНК в скелетных мышцах, что сопровождается увеличением биогенеза митохондрий, повышением содержания ферментов, обеспечивающих аэробные метаболические реакции и расширением сети капилляров [31–33]. Каждая микроРНК имеет много мишеней, и это затрудняет определение влияния отдельных молекул в разных условиях метаболизма тканей и органов человека. Реакция микроРНК в организме человека на разные внешние воздействия существенно различается, на что указывают результаты, полученные при разных видах физических нагрузок и применения разных пищевых веществ [34–36]. Можно предположить, что по мере расширения диапазона исследований микроРНК будут использоваться в качестве эпигенетических маркеров разных фенотипов и в частности, для выявления повреждений скелетных мышц и для оценки реакции организма на адекватность физической нагрузки функциональному состоянию человека [20].

Участники эпигенетической регуляции метаболизма в скелетных мышцах представлены на рис. 1. Первым компонентом сложной системы эпигенетической регуляции метаболизма скелетных мышц является молекула ДНК, на которой происходят реакции метилирования и деметилирования с участием семейств специфических ферментов. Второй компонент включает гистоны и регуляторные белки, модификация которых осуществляется в реакциях ацетилирования, метилирования и фосфорилирования, что приводит к посттрансляционной модификации белков и вызывает изменение экспрессии регуляторных и метаболических генов. В качестве третьего компонента выступает многочисленное семейство микроРНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов и при взаимодействии с мРНК осуществляют контроль процесса трансляции и деградации зрелых мРНК.

Рис. 1.

Возможные эпигенетические изменения в мышечной клетке под действием физической нагрузки.

В заключение необходимо отметить, что за последние два года заметно увеличился поток статей по теме эпигенетическая регуляция. Это связано не только с повышенным интересом к данному научному направлению, но и с организацией международного консорциума эпигеном человека (www.cell.com/consortium/IHEC). Состав консорциума и основные направления работы подробно изложены на сайте (http://ihec-epigenomes.org). Среди научных направлений планируется интеграция эпигеномики с другими омикс-технологиями, такими как протеомика, транскриптомика, секретомика, фосфопротеомика и ацетиломика, метаболомика и липидомика. Участие этих технологий в физиологии мышечной деятельности подробно изложено в обзоре [10].

Дальнейший прогресс в физиологии мышечной деятельности человека возможен при объединении и анализе данных геномики, эпигеномики и транскриптомики с привлечением инструментов биоинформатики, что позволит расширить представление о молекулярных механизмах, регулирующих метаболизм в скелетных мышцах человека при различных функциональных состояниях. Широкий диапазон метаболизма скелетных мышц при выполнении различных по интенсивности и длительности физических нагрузок создает возможности для улучшения функциональной деятельности и дальнейшего более глубокого изучениям молекулярных механизмов эпигенетической регуляции.