1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова
  4. T. 106, № 2, 2020

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2020, T. 106, № 2, стр. 254-264

Ранние стероидогенные эффекты гонадотропина и низкомолекулярного агониста рецептора лютеинизирующего гормона при введении их субмаксимальных доз самцам крыс

А. А. Бахтюков 1, К. В. Деркач 1, А. О. Шпаков 1, *

1 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН
Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: alex_shpakov@list.ru

Поступила в редакцию 06.11.2019
После доработки 04.12.2019
Принята к публикации 06.12.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Рецепторы лютеинизирующего гормона (ЛГ) играют ключевую роль в регуляции стероидогенеза в семенниках. Они могут быть активированы гонадотропинами – ЛГ и хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ), и низкомолекулярными агонистами, в том числе производными тиено-[2,3-d]пиримидинов, которые связываются с аллостерическим сайтом, расположенным в трансмембранном канале рецептора ЛГ. Ранее были выявлены различия в стероидогенных эффектах гонадотропинов и тиено-[2,3-d]пиримидинов в экспериментах in vitro и при длительном введении самцам крыс, но их ранние стероидогенные эффекты в семенниках, в том числе при введении в субмаксимальных дозах, практически не изучены. Целью работы было изучить влияние однократного введения самцам крыс субмаксимальных доз ХГЧ и тиено-[2,3-d]пиримидинового производного TP03 на уровень тестостерона (Т) в крови и на экспрессию генов стероидогенных белков и паттерн стероидных гормонов, прекурсоров Т, в семенниках в течение 5 ч после такой обработки. Показано, что TP03 (15 мг/кг) и ХГЧ (50 МЕ/крысу) через 30 мин после введения крысам повышают интратестикулярные уровни Т и его прекурсоров – 17-гидроксипрогестерона и андростендиона, а также снижают уровень прегненолона, что указывает на его расходование для синтеза прогестерона. Экспрессия генов стероидогенных белков значимо менялась через 3 ч после введения препаратов – при введении TP03 и ХГЧ повышалась экспрессия генов Star и Cyp17a1, кодирующих транспортный белок StAR и цитохром Р450-17α, ключевые компоненты системы стероидогенеза. При этом выявлены различия между уровнем экспрессии гена Hsd17b, кодирующего дегидрогеназу HSD17β, содержание которой было выше в группе с обработкой ХГЧ в сравнении с группой, обработанной TP03. Через 1 и 3 ч после обработки крыс ХГЧ прирост уровня Т в крови был выше, чем в группе с обработкой TP03, но уже через 5 ч уровни Т в обеих группах крыс были сопоставимыми, что обусловлено ослаблением стероидогенного эффекта ХГЧ при сохранении такового TP03. Таким образом, несмотря на сходство ранних стероидогенных эффектов TP03 и ХГЧ, применяемых в субмаксимальных дозах, уже в первые часы после их введения крысам начинают выявляться особенности их влияния на тестикулярный стероидогенез, которые при длительном введении приводят к существенным различиям в их стероидогенной активности.

Ключевые слова: низкомолекулярный агонист, рецептор лютеинизирующего гормона, стероидогенез, тестостерон, семенники, хорионический гонадотропин, белок StAR, цитохром Р450-17α

В настоящее время во вспомогательных репродуктивных технологиях и для коррекции гипогонадотропного гипогонадизма и других репродуктивных дисфункций, ассоциированных со снижением продукции половых стероидных гормонов, широко используют препараты гонадотропинов – рекомбинатного лютеинизирующего гормона (ЛГ) и рекомбинантных и мочевых форм хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Однако при использовании в медицине гонадотропины имеют ряд серьезных недостатков, среди которых сравнительно быстрое развитие к ним резистентности тканей семенников и яичников и, как следствие, ослабление стероидогенного ответа при продолжительном применении, необходимость исключительно парентерального применения и иммуногенность, особенно при использовании недостаточно очищенных препаратов ХГЧ [1]. Многие побочные эффекты гонадотропинов обусловлены низкой избирательностью ЛГ и ХГЧ в отношении определенных внутриклеточных сигнальных каскадов, поскольку в условиях длительного воздействия на рецепторы ЛГ они активируют не только цАМФ-зависимые пути, нацеленные в основном на стимуляцию стероидогенеза, но и β-аррестиновые пути, ведущие к десенситизации рецептора ЛГ и опосредующие снижение чувствительности клеток-мишеней к гонадотропинам [2].

Альтернативой гонадотропинам являются низкомолекулярные агонисты рецептора ЛГ, которые в отличие от ЛГ и ХГЧ взаимодействуют не с высокоаффинным ортостерическим сайтом, расположенным в значительном по размеру внеклеточном домене рецептора, а с его аллостерическим сайтом, локализованным внутри трансмембранного домена, сформированного семью трансмембранными спиралями рецептора [3, 4]. Наибольший интерес среди них представляют производные тиено-[2,3-d]пиримидина, которые специфично активируют цАМФ-зависимые сигнальные пути в клетках-мишенях, характеризуются стероидогенной активностью при внутрибрюшинном и пероральном введении грызунам, а в условиях клиники способны вызывать овуляцию у женщин, не приводя при этом к развитию синдрома гиперстимуляции яичников – тяжелому осложнению, возникающему при проведении контролируемой индукции овуляции [3, 5–8].

На основе изучения специфической активности и биодоступности большого количества производных тиено-[2,3-d]пиримидинов нами было отобрано соединение TP03, 5-амино-N-трет-бутил-2-(метилсульфанил)-4-(3-(никотинамидо)фенил) тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид, наделенное активностью аллостерического агониста рецептора ЛГ. В условиях in vitro TP03 повышал активность аденилатциклазной системы в тестикулярных и овариальных мембранах, при этом слабо влияя на другие сигнальные каскады, стимулировал стероидогенез в культурируемых клетках Лейдига, а в условиях in vivo при однократном или на протяжении нескольких дней введении самцам крыс повышал у них продукцию тестостерона (Т) [9–12]. Были выявлены значительные различия механизмов стероидогенного действия ХГЧ и TP03 при их длительном введении самцам крыс, а также при однократном введении животным TP03 и ХГЧ в высокой дозе (100 МЕ/крысу). Следует, однако, отметить, что механизмы действия гонадотропинов сильно зависят от дозы, вследствие чего представляет интерес сравнить механизмы действия ХГЧ и TP03 и динамику развития стероидогенного эффекта при однократном введении препаратов в субмаксимальных дозах. Использование более низких, субмаксимальных, доз ХГЧ позволяет, по крайней мере, частично предотвратить его мощное ингибирующее воздействие на систему стероидогенеза, которое при применении высоких доз гонадотропина начинает выявляться уже через несколько часов после обработки [12–14]. Изучение ранних стероидогеных эффектов различающихся по природе агонистов рецептора ЛГ позволяет оценить перспективы и преимущества использования таких препаратов для однократной стимуляции стероидогенной функции. Целью исследования было сравнительное изучение влияния однократного введения самцам крыс TP03 и ХГЧ, взятых в субмаксимальных дозах 15 мг/кг и 50 МЕ/крысу соответственно, на уровень Т в крови, на экспрессию генов стероидогенных белков и паттерн стероидных гормонов, прекурсоров Т, в семенниках крыс в течение 5 ч после такой обработки.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для экспериментов использовали самцов крыс Вистар (возраст 3 мес.), которых содержали в стандартных условиях и на стандартном рационе. Все процедуры проводили в соответствии с правилами, разработанными Комитетом по биоэтике ИЭФБ РАН (15.02.2018 г.), и правилами и требованиями, изложенными в документах “European Communities Council Directive 1986” (86/609/EEC) и “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”.

Препарат ХГЧ (Московский эндокринологический завод, Россия) вводили крысам однократно в дозе 50 МЕ/крысу (подкожно), соединение TP03, которое синтезировали и характеризовали, как описано ранее [9] вводили однократно в дозе 15 мг/кг (внутрибрюшинно, в диметилсульфоксиде (ДМСО)). В каждой исследуемой группе было по шесть животных. Инъекции проводили в 11.00 ч, уровень Т оценивали до введения препаратов (10.00 ч) и через 1, 3 и 5 ч (12.00, 14.00, 16.00 ч) после их введения в образцах крови, полученных из хвостовой вены при использовании местного наркоза (2%-ный лидокаин, 2–4 мг/кг). Контрольным крысам в те же сроки вводили ДМСО. Концентрацию Т в крови животных определяли с помощью набора “Тестостерон-ИФА” (Алкор-Био, Россия).

Для исследования содержания стероидных гормонов и оценки экспрессии генов рецептора ЛГ и стероидогенных белков в семенниках крыс дополнительно использовали самцов крыс того же возраста (в каждой группе n = 6), которых декапитировали под наркозом через 30 мин (11.30 ч) и через 3 ч (14.00 ч) после введения препаратов или ДМСО (11.00 ч). Ткани семенников гомогенизировали на льду в лизирующем буфере (мМ): 20 Трис-НСl, pH 7.5, 150 NaCl, 1 EGTA, 1 EDTA, 0.1% Тритон Х-100 в соотношении 1 : 20, гомогенат центрифугировали (10 мин, 12 000 g), собирали супернатант, замораживали его при –18°C и использовали для определения уровня гормонов. Содержание Т в семенниках измеряли с помощью набора фирмы Алкор-Био (Россия), содержание прогестерона и 17-гидроксипрогестерона – с помощью наборов фирмы Хема (Россия), содержание прегненолона и андростендиона – с помощью наборов фирмы DRG Instruments GmbH (Германия).

Экспрессию мРНК оценивали с помощью ПЦР в реальном времени, для чего из тканей семенников выделяли тотальную РНК с помощью реагента ExtractRNA (Евроген, Россия). Обратную транскрипцию осуществляли с помощью набора MMLV RT Kit (Евроген, Россия), количественную оценку экспрессии проводили с помощью амплификатора 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Использовали следующие праймеры: Lhr (рецептор ЛГ) – CTGCGCTGTCCTGGCC (For) и CGACCTCATTAAGTCCCCTGAA (Rev); Star (StAR-белок) – AAGGCTGGAAGAAGGAAAGC (For) и CACCTGGCACCACCTTACTT (Rev); Cyp11a1 (цитохром Р450scc) – TATTCCGCTTTGCCTTTGAG (For) и CACGATCTCCTCCAACATCC (Rev); Hsd3b (3β-гидростероиддегидрогеназа, HSD3β) – AGGCCTGTGTCCAAGCTAGTGT (For) и CTCGGCCATCTTTTTGCTGTAT (Rev); Cyp17a1 (цитохром Р450-17α) – CATCCCCCACAAGGCTAAC (For) и TGTGTCCTTGGGGACAGTAAA (Rev); Hsd17b (17β-гидростероиддегидрогеназа, HSD17β) – CCTTTGGCTTTGCCATGAGA (For) и CAATCCATCCTGCTCCAACCT (Rev). Для исследования использовали референсные гены β-актина (Actb) и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (Gapdh). Результаты анализировали с помощью метода ΔΔСt и программного обеспечения 7500 Software v2.0.6 и Expression Suite Software v1.0.3, значения RQ рассчитывали по отношению к контрольной группе.

Статистическую обработку проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, США). Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения двух выборок с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента, для сравнения трех и более групп – дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми считали отличия при p < 0.05. Данные представляли как M ± SEM.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение самцам крыс ХГЧ и TP03 через 1 ч приводило к достоверному повышению у них уровня Т с максимумом стероидогенного эффекта через 3 ч, причем ХГЧ был более активным в сравнении с TP03 (табл. 1). На это указывает более высокое значение AUC12.00–16.00 для его стероидогенного эффекта, которое на 72% выше, чем в случае TP03 (табл. 1). Стимулирующий продукцию Т эффект гонадотропина нарастал быстрее, но затем ослабевал, в то время как соответствующий эффект TP03 повышался более плавно и сохранялся на одном уровне через 3 и 5 ч. Так, через 3 ч после введения ХГЧ прирост уровня Т был выше прироста, вызываемого TP03, на 104%, в то время как через 5 ч – на 60%. Полученные данные демонстрируют различия во временной динамике стероидогенных эффектов различающихся по природе и механизмам действия агонистов рецептора ЛГ. Причинами этого могут быть различия в биодоступности ХГЧ и TP03, поскольку гонадотропины легче достигают семенников и преодолевают гематотестикулярный барьер в сравнении с гидрофобными тиено-[2,3-d]пиримидинами, а также в индукции гонадотропинами десенситизации рецепторов ЛГ, что ведет к постепенному ослаблению их стероидогенного эффекта [2].

Таблица 1.  

Уровни тестостерона в крови при однократном введении самцам крыс ХГЧ в дозе 50 МЕ/животное и соединения TP03 в дозе 15 мг/кг Table 1.  The plasma levels of testosterone in a single administration of hCG at a dose of 50 IU/animal and TP03 at a dose of 15 mg/kg in male rats

  До введения, 10.00 ч Before administration, 10.00 h* Через 1 ч, 12.00 After 1 h,12.00 Через 3 ч, 14.00 After 3 hs,14.00 Через 5 ч, 16.00 After 5 hs,16.00 AUC12.00–16.00, усл. ед. AUC12.00-16.00, arb.un.
Контроль
Control 		15.6 ± 2.6 16.0 ± 2.5 14.8 ± 2.0 14.4 ± 4.5 59.9 ± 7.6
ХГЧ, 50 МЕ/крысу
hCG, 50 IU/rat 		13.9 ± 2.0 71.2 ± 8.6a 111.5 ± 10.4a 86.1 ± 8.9a 380.3 ± 21.6b
TP03, 15 мг/кг
TP03, 15 mg/kg 		14.3 ± 1.8 36.8 ± 5.0a, c 62.3 ± 5.4a, c 59.4 ± 5.2a 220.8 ± 17.6b, c

* – препараты вводили в 11.00 ч. a – различия по сравнению с базовым уровнем Т статистически значимы при p < 0.05; b – различия значений AUC12.00–16.00 по сравнению с таковыми в контроле статистически значимы при p < 0.05; c – различия уровней Т и значений AUC12.00–16.00 между группами, обработанными ХГЧ и TP03, статистически значимы при p < 0.05. Значения представлены как M ± SEM, n = 6. * – the drugs were administered at 11.00 h. a – the differences in comparison with the baseline T level are significant at p < 0.05; b – the differences of the AUC12.00–16.00 values as compared with those in the control are significant at p < 0.05; c – the differences in the T levels and the AUC12.00–16.00 values between the groups treated with hCG and TP03 are significant at p < 0.05. The values are presented as M ± SEM, n = 6.

Нами показано, что уже через 30 мин после введения ХГЧ и TP03 содержание Т и ряда его прекурсоров в семенниках крыс в сравнении с контролем менялось. Так, содержание прегненолона, синтез которого из холестерина осуществляется в митохондриях и катализируется цитохромом Р450scc, при обработке крыс ХГЧ и TP03 снижалось ниже контрольного уровня (табл. 2). Это обусловлено тем, что накопленный в клетках Лейдига прегненолон после активации рецепторов ЛГ с помощью ХГЧ или TP03 превращается в прогестерон, что говорит о значительной стимуляции ферментов, катализирующих начальные, митохондриальные, стадии стероидогенеза. Уровень прогестерона, синтез которого из прегненолона катализируется дегидрогеназой HSD3β, во всех исследуемых группах не различался. Это указывает на быструю конверсию прогестерона с помощью цитохрома Р450-17α сначала в 17-гидроксипрогестерон, а затем уже в андростендион. В свою очередь, уровни 17-гидроксипрогестерона, андростендиона и Т, синтезируемого из андростендиона с помощью дегидрогеназы HSD17β, у самцов крыс, обработанных ХГЧ и TP03, были повышены, в наибольшей степени при обработке гонадотропином (табл. 2). Так, в сравнении с контролем ХГЧ повышал уровень 17-гидроксипрогестерона, андростендиона и Т в семенниках крыс на 620, 204 и 492%, в то время как TP03 – на 45, 64 и 90%. Следует отметить положительную корреляцию между интратестикулярным уровнем Т через 30 мин после введения крысам ХГЧ и TP03 и подъемом концентрации Т в крови животных через 1 ч после введения. Соотношение между приростами уровня интратестикулярного Т в группах с обработкой ХГЧ и TP03 составило 4.72 и было сопоставимым с соотношением уровней Т в крови, которое составило 2.65.

Таблица 2.  

Влияние ХГЧ и TP03 на уровни стероидных гормонов – тестостерона и его прекурсоров, в семенниках самцов крыс через 30 мин после введения препаратов Table 2.  The effect of hCG and TP03 on the levels of steroid hormones, testosterone and its precursors, in the testes of male rats 30 minutes after drug administration

Стероидный гормон
Steroid hormone 		Контроль
Control 		ХГЧ, 50 МЕ/крысу
hCG, 50 IU/rat 		TP03, 15 мг/кг
TP03, 15 mg/kg
  Концентрация стероидного гормона, нмоль/г ткани
The concentration of steroid hormone, nmol/g of the tissue
Прегненолон
Pregnenolone 		1.27 ± 0.07 0.76 ± 0.06a 0.88 ± 0.05a
Прогестерон
Progesterone 		0.41 ± 0.05 0.47 ± 0.06 0.45 ± 0.03
17-Гидрокси-прогестерон
17-Hydroxyprogesterone 		0.044 ± 0.010 0.317 ± 0.026a 0.064 ± 0.004b
Андростендион Androstenedione 0.045 ± 0.003 0.137 ± 0.015a 0.074 ± 0.010a,b
Тестостерон
Testosterone 		0.49 ± 0.12 2.85 ± 0.22a 0.99 ± 0.07a, b

a – различия по сравнению с контролем статистически значимы при p < 0.05; b – различия по сравнению с группой, обработанной ХГЧ, статистически значимы при p < 0.05. Значения представлены как M ± SEM, n = 6. a – the differences in comparison with the control are significant at p < 0.05; b – the differences in the comparison with the hCG-treated group are significant at p < 0.05. The values are presented as M ± SEM, n = 6.

Экспрессия стероидогенных генов в семенниках крыс через 30 мин после их обработки ХГЧ и TP03 существенно не отличалась от таковой в контроле (данные не представлены), что, как можно полагать, обусловлено недостаточностью времени, прошедшего с момента воздействия ХГЧ и TP03 на клетки Лейдига, для изменения в них транскрипционной активности генов. Полученные данные согласуются с выявленным нами соотношением стероидных гормонов в семенниках, которое указывает на быструю “перекачку” прегненолона и прогестерона в конечные продукты стероидогенеза без заметного их синтеза de novo. В этой связи следует отметить, что ключевую роль в интенсификации синтеза прегненолона и прогестерона играет белок StAR, который отвечает за активный транспорт холестерина через митохондриальную мембрану внутрь митохондрий, где осуществляются начальные стадии стероидогенеза [15].

Через 3 ч после введения крысам ХГЧ и TP03 отмечали значимые изменения экспрессии гена Star, кодирующего белок StAR, которая в обеих группах повышалась в среднем в два раза, и экспрессии гена Cyp17a1, кодирующего цитохром Р450-17α, которая повышалась в тех же группах крыс в среднем в три раза (рис. 1). Как отмечалось выше, транспортный белок StAR катализирует транспорт холестерина в митохондрии, что является скорость-лимитирующей стадией тестикулярного стероидогенеза, и повышение экспрессии белка StAR положительно коррелирует с продукцией T в семенниках. Наши данные согласуются с результатами других авторов о повышении экспрессии гена Star при обработке ХГЧ культуры клеток Лейдига крысы [16, 17]. Этот эффект гонадотропина обусловлен стимуляцией активности ERK1/2-киназ, осуществляемой как через цАМФ-зависимый, так и через фосфоинозитидный пути. Необходимо отметить, что активация ERK1/2-киназ в клетках Лейдига не только повышает экспрессию гена Star, но и стимулирует активность белка StAR, что, в конечном итоге, стимулирует синтез прогестерона, основного субстрата цитохрома Р450-17α [15, 18].

Рис. 1.

Влияние ХГЧ и TP03 на экспрессию генов, кодирующих рецептор ЛГ/ХГЧ и стероидогенные белки, в семенниках самцов крыс через 3 ч после введения препаратов. a – различия по сравнению с контролем статистически значимы при p < 0.05; b – различия по сравнению с группой, обработанной ХГЧ, статистически значимы при p < 0.05. Значения представлены, как M ± SEM, n = 6. Fig. 1. The effect of hCG and TP03 on the expression of the genes encoding LH/hCG receptor and the steroidogenic proteins in the testes of male rats three hours after drug administration. a – the differences in comparison with the control are significant at p < 0.05; b – the differences in comparison with the hCG-treated group are significant at p < 0.05. The values are presented as M ± SEM, n = 6.

Цитохром Р450-17α, фермент с двойной специфичностью, катализирует сразу две стадии стероидогенеза – превращение прогестерона в 17-гидроксипрогестерон (17α-гидроксилазная активность) и конверсию 17-гидроксипрогестерона в андростендион (C17–20-лиазная активность) [19, 20]. Показанное нами повышение экспрессии гена Cyp17a1 в сочетании со значительным повышением уровня Т в крови крыс через 3 ч после введения им TP03 и ХГЧ указывает на то, что повышение экспрессии и активности цитохрома Р450-17α также вносит значительный вклад в стероидогенный эффект тиено-[2,3-d]пиримидинов, сходно с тем, как это происходит при действии ХГЧ. Стимуляция гонадотропинами с ЛГ-активностью экспрессии и активности цитохрома Р450-17α ранее была показана при обработке ими культуры клеток Лейдига семенников [21, 22] и клеток теки яичников [23, 24]. Следует, однако, отметить, что данные по влиянию гонадотропинов на цитохром Р450-17α в клеточных культурах отличаются от результатов, полученных в условиях in vivo, что обусловлено особенностями временной динамики развития стероидогенного эффекта и различиями паттерна регуляторных влияний в изолированных клетках и в репродуктивных тканях. Однократное введение высоких доз ХГЧ пациентам и экспериментальным животным уже в первые часы повышало у них активность цитохрома Р450-17α [13, 25], но через 6 ч, как было продемонстрировано в опытах с самцами крыс, этот эффект затухал [25]. При введении гонадотропинов с ЛГ-активностью в течение нескольких дней отмечали подавление экспрессии гена Cyp17a1 и активности цитохрома Р450-17α, что показано в семенниках, яичниках и плаценте [13, 26–30]. Необходимо обратить внимание на тот факт, что соединения, ингибирующие экспрессию и активность цитохрома Р450-17α, характеризуются сильно выраженным антиандрогенным эффектом, и это позволяет использовать их для лечения ЛГ-зависимых опухолей [31]. Следует также отметить, что трехдневное введение TP03 самцам крыс, в отличие от ХГЧ, вызывало повышение, а не снижение экспрессии гена Cyp17a1 в семенниках животных, что коррелировало с сохранением у TP03 стероидогенного эффекта [29].

Экспрессия генов, кодирующих дегидрогеназы HSD3β и HSD17β, в семенниках крыс, обработанных TP03 и ХГЧ, существенно не отличалась от таковой в контрольной группе. При этом экспрессия гена Hsd17b в группе, обработанной TP03, была достоверно ниже, чем в группе с введением ХГЧ (рис. 1), что указывает на разнонаправленное влияние на нее тиено-[2,3-d]пиримидинов и гонадотропинов. Дегидрогеназа HSD17β катализирует заключительную стадию тестикулярного стероидогенеза, осуществляя конверсию андростендиона в Т [19, 20]. Другими авторами было показано, что при однократном введении ХГЧ самцам крыс на первом этапе экспрессия и активность дегидрогеназы HSD17β существенно не отличалась от контроля, как и в нашем случае, но в дальнейшем заметно снижалась [14, 32]. Так, при воздействии ХГЧ экспрессия гена Hsd17b снижалась, достигая минимума через 24 ч, и восстанавливалась до контрольного уровня только на девятые сутки после инъекции гонадотропина [14]. Нами ранее было показано, что при трехдневном введении самцам крыс ХГЧ экспрессия гена Hsd17b снижалась в два раза, в то время как в группе с длительной обработкой TP03 экспрессия гена дегидрогеназы HSD17β сохранялась на контрольном уровне [29].

Суммируя результаты, полученные ранее и в рамках настоящего исследования, можно заключить, что в течение первых часов после введения ХГЧ и TP03 самцам крыс их эффекты на экспрессию стероидогенных ферментов различаются в небольшой степени, но в дальнейшем различия становятся значительными. Среди причин этого изменение экспрессии рецепторов ЛГ. Так, через 3 ч после введения ХГЧ и TP03 экспрессия гена Lhr в семенниках самцов крыс практически не менялась (рис. 1). В то же время, как показано нами ранее, при длительном введении ХГЧ она снижалась в три раза и, напротив, парадоксальным образом возрастала при обработке TP03 [29]. Мы полагаем, что TP03 как при краткосрочном, так и при длительном его введении самцам крыс не способен в достаточной степени стимулировать β-аррестиновый и фосфоинозитидный пути в клетках Лейдига, контролирующие процесс эндоцитоза и экспрессию гена Lhr, что обусловлено специфичностью TP03 в отношении цАМФ-зависимых каскадов, ответственных за активацию стероидогенеза [6, 10]. В то же время ХГЧ, будучи низкоселективным в отношении внутриклеточных сигнальных каскадов, стимулирует β-аррестиновый и фосфоинозитидный пути, причем при повышении силы и продолжительности воздействия эти его эффекты только усиливаются, что и приводит к снижению экспрессии рецептора ЛГ и ослаблению стероидогенного ответа.

Таким образом, тиено-[2,3-d]пиримидиновое производное TP03, аллостерический агонист рецептора ЛГ, через 30 мин после введения самцам крыс стимулирует стероидогенез, причем, его стероидогенный эффект на начальном этапе воздействия на клетки Лейдига сходен с таковым ХГЧ. Так, TP03 и ХГЧ через 30 мин повышают в семенниках уровни Т и его прекурсоров – 17-гидроксипрогестерона и андростендиона, а также снижают уровень прегненолона, что указывает на расходование последнего для синтеза прогестерона и других предшественников Т. Изменение экспрессии генов стероидогенных белков через 30 мин после введения препаратов отсутствовало, но выявлялось через 3 ч. При введении TP03 и ХГЧ значимо повышалась экспрессия генов Star и Cyp17a1, кодирующих белок StAR и цитохром Р450-17α, ключевые компоненты тестикулярного стероидогенеза. В то же время в группе, обработанной TP03, уровень экспрессии гена Hsd17b, кодирующего дегидрогеназу HSD17β, был достоверно ниже, чем в группе с обработкой ХГЧ. Поскольку продукция Т, индуцированная гонадотропином через 5 ч заметно снижалась, то стероидогенный эффект ХГЧ становился сопоставимым с таковым TP03, несмотря на то что еще через 1 и 3 ч он в значительной степени его превосходил. Эти изменения стероидогенного эффекта ХГЧ и тиено-[2,3-d]пиримидина предшествуют значимым различиям, которые выявляются позднее, при более длительной обработке крыс тиено-[2,3-d]пиримидинами и ХГЧ и обусловлены различиями их механизмов действия на внутриклеточные сигнальные каскады в клетках Лейдига.

Список литературы

  1. Шпаков А.О. Гонадотропины – от теории к клинической практике. Санкт-Петербург. ПОЛИТЕХ-ПРЕСС. 2018. ISBN 978-5-7422-6330-2. [Shpakov A.O. Gonadotropiny – ot teorii k klinicheskoj praktike [Gonadotropins – from theory to clinical practice]. St-Petersburg. POLYTEСH-PRESS. 2018. ISBN 978-5-7422-6330-2. (In Russ)].

  2. Riccetti L., Yvinec R., Klett D., Gallay N., Combarnous Y., Reiter E., Simoni M., Casarini L., Ayoub M.A. Human luteinizing hormone and chorionic gonadotropin display biased agonism at the LH and LH/CG receptors. Sci. Rep. 7(1): 940. 2017.

  3. van Straten N.C., Timmers C.M. Non-Peptide ligands for the gonadotropin receptors. Annu. Rep. Med. Chem. 44: 171–188. 2009. https://doi.org/10.1016/S0065-7743(09)04408-X

  4. Шпаков А.О. Новые достижения в разработке и изучении механизмов действия низкомолекулярных агонистов рецепторов тиреотропного и лютеинизирующего гормонов. Цитология. 57(3): 167–176. 2015. [Shpakov A.O. Novye dostizheniya v razrabotke i izuchenii mekhanizmov dejstviya nizkomolekulyarnyh agonistov receptorov tireotropnogo i lyuteiniziruyushchego gormonov [New achievements in the development and study of the mechanisms of action of low-molecular-weight agonists of the receptors of the thyroid-stimulating and luteinizing hormones]. Tsitologiia. 57(3): 167–176. 2015. (In Russ)].

  5. van Straten N.C., Schoonus-Gerritsma G.G., van Someren R.G., Draaijer J., Adang A.E., Timmers C.M., Hanssen R.G., van Boeckel C.A. The first orally active low molecular weight agonists for the LH receptor: Thienopyr(im)idines with therapeutic potential for ovulation induction. Chem. BioChem. 3(10): 1023–1026. 2002.

  6. van Koppen C.J., Zaman G.J., Timmers C.M., Kelder J., Mosselman S., van de Lagemaat R., Smit M.J., Hanssen R.G. A signaling-selective, nanomolar potent allosteric low molecular weight agonist for the human luteinizing hormone receptor. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 378(5): 503–514. 2008. https://doi.org/10.1007/s00210-008-0318-3

  7. van de Lagemaat R., Timmers C.M., Kelder J., van Koppen C., Mosselman S., Hanssen R.G. Induction of ovulation by a potent, orally active, low molecular weight agonist (Org 43553) of the luteinizing hormone receptor. Hum. Reprod. 24(3): 640–648. 2009. https://doi.org/10.1093/humrep/den412

  8. Newton C.L., Whay A.M., McArdle C.A., Zhang M., van Koppen C.J., van de Lagemaat R., Segaloff D.L., Millar R.P. Rescue of expression and signaling of human luteinizing hormone G protein-coupled receptor mutants with an allosterically binding small-molecule agonist. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108(17): 7172–7176. 2011. https://doi.org/10.1073/pnas.1015723108

  9. Derkach K.V., Dar’in D.V., Bakhtyukov A.A., Lobanov P.S., Shpakov A.O. In vitro and in vivo studies of functional activity of new low molecular weight agonists of the luteinizing hormone receptor. Biochemistry (Moscow). Suppl. Ser. A: Memb. Cell Biol. 10(4): 294–300. 2016. https://doi.org/10.1134/S1990747816030132

  10. Derkach K.V., Bakhtyukov A.A., Shpakov A.A., Dar’in D.V., Shpakov A.O. Specificity of heterotrimeric G protein regulation by human chorionic gonadotropin and low-molecular agonist of luteinizing hormone receptor. Cell Tissue Biol. 11(6): 475–482. 2017. https://doi.org/10.1134/S1990519X17060037

  11. Bakhtyukov A.A., Derkach K.V., Dar’in D.V., Stepochkina A.M., Shpakov A.O. A low molecular weight agonist of the luteinizing hormone receptor stimulates adenylyl cyclase in the testicular membranes and steroidogenesis in the testes od rats with type 1 diabetes. Biochemistry (Moscow). Suppl. Ser. A: Membr. Cell Biol. 13(4): 301–309. 2019. https://doi.org/10.1134/S1990747819040032

  12. Bakhtyukov A.A., Derkach K.V., Dar’in D.V., Shpakov A.O. Conservation of steroidogenic effect of the low-molecular-weight agonist of luteinizing hormone receptor in the course of its long-term administration to male rats. Dokl. Biochem. Biophys. 484(1): 78–81. 2019. https://doi.org/10.1134/S1607672919

  13. Forest M.G., Roulier R. Kinetics of the steroidogenic response of the testis to stimulation by hCG. V. Blockade of 17–20 lyase induced by hCG is an age-dependent phenomenon inducible by pre-treatment with hCG. Ann. Endocrinol. (Paris). 45: 281–290. 1984.

  14. Tsai-Morris C.H., Khanum A., Tang P.Z., Dufau M.L. The rat 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type III: molecular cloning and gonadotropin regulation. Endocrinology. 140(8): 3534–3542. 1999.

  15. Castillo A.F., Orlando U., Helfenberger K.E., Poderoso C., Podesta E.J. The role of mitochondrial fusion and StAR phosphorylation in the regulation of StAR activity and steroidogenesis. Mol. Cell Endocrinol. 408: 73–79. 2015. https://doi.org/10.1016/j.mce.2014.12.011

  16. Martinelle N., Holst M., Söder O., Svechnikov K. Extracellular signal-regulated kinases are involved in the acute activation of steroidogenesis in immature rat Leydig cells by human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 145(10): 4629–4634. 2004.

  17. Manna P.R., Jo Y., Stocco D.M. Regulation of Leydig cell steroidogenesis by extracellular signal-regulated kinase 1/2: role of protein kinase A and protein kinase C signaling. J. Endocrinol. 193(1): 53–63. 2007.

  18. Poderoso C., Maloberti P., Duarte A., Neuman I., Paz C., Cornejo Maciel F., Podesta E.J. Hormonal activation of a kinase cascade localized at the mitochondria is required for StAR protein activity. Mol. Cell Endocrinol. 300(1–2): 37–42. 2009. https://doi.org/10.1016/j.mce.2008.10.009

  19. Labrie F., Luu-The V., Lin S.X., Labrie C., Simard J., Breton R., Bélanger A. The key role of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenases in sex steroid biology. Steroids. 62(1): 148–158. 1997.

  20. Marchais-Oberwinkler S., Henn C., Möller G., Klein T., Negri M., Oster A., Spadaro A., Werth R., Wetzel M., Xu K., Frotscher M., Hartmann R.W., Adamski J. 17β-Hydroxysteroid dehydrogenases (17β-HSDs) as therapeutic targets: protein structures, functions, and recent progress in inhibitor development. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 125(1–2): 66–82. 2011. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2010.12.013

  21. Clark A.M., Chuzel F., Sanchez P., Saez J.M. Regulation by gonadotropins of the messenger ribonucleic acid for P450 side-chain cleavage, P45017 alpha-hydroxylase/C17,20-lyase, and 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase in cultured pig Leydig cells. Biol. Reprod. 55(2): 347–354. 1996.

  22. Бахтюков А.А., Соколова Т.В., Дарьин Д.В., Деркач К.В., Шпаков А.О. Сравнительное изучение стимулирующего эффекта низкомолекулярного агониста рецептора лютеинизирующего гормона и хорионического гонадотропина на стероидогенез в клетках Лейдига крысы. Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 103(10): 1181–1192. 2017. [Bakhtyukov A.A., Sokolova T.V., Dar’in D.V., Derkach K.V., Shpakov A.O. A comparative study of the stimulating effect of a low-molecular-weight agonist of luteinizing hormone receptor and chorionic gonadotropin on the steroidogenesis in the rat Leydig cells]. Russ. J. Physiol. 103(10): 1181–1192. 2017. (In Russ)].

  23. Magoffin D.A. Evidence that luteinizing hormone-stimulated differentiation of purified ovarian thecal-interstitial cells is mediated by both type I and type II adenosine 3',5' monophosphate-dependent protein kinases. Endocrinology. 125: 1464–1473. 1987.

  24. Wang X., Zou P., He Y., Meng K., Quan F., Zhang Y. Effect of luteinizing hormone on goat theca cell apoptosis and steroidogenesis through activation of the PI3K/AKT pathway. Anim. Reprod. Sci. 190: 108–118. 2018. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2018.01.014

  25. Chasalow F., Marr H., Haour F., Saez J.M. Testicular steroidogenesis after human chorionic gonadotropin desensitization in rats. J. Biol. Chem. 254(13): 5613–5617. 1979.

  26. Suzuki K., Tamaoki B. Acute decrease by human chorionic gonadotropin of the activity of preovulatory ovarian 17 alpha-hydroxylase and C-17-C-20 lyase is due to decrease of microsomal cytochrome P-450 through de novo synthesis of ribonucleic acid and protein. Endocrinology. 113(6): 1985–1991. 1983.

  27. Johnson D.C., Griswold T. Relationship between in vivo and in vitro 17 alpha-hydroxylase and C17,20-lyase activity in ovaries of immature hypophysectomized rats treated chronically with human chorionic gonadotropin. J. Steroid. Biochem. 24(2): 637–643. 1986.

  28. Durkee T.J., McLean M.P., Hales D.B., Payne A.H., Waterman M.R., Khan I., Gibori G. P450(17 alpha) and P450SCC gene expression and regulation in the rat placenta. Endocrinology. 130(3): 1309–1317. 1992.

  29. Bakhtyukov A.A., Derkach K.V., Dar’in D.V., Sharova T.S., Shpakov A.O. Decrease in the basal and luteinizing hormone receptor agonist-stimulated testosterone production in aging male rats. Adv. Gerontol. 9(2): 179–185. 2019. https://doi.org/10.1134/S2079057019020036

  30. Kakuta H., Iguchi T., Sato T. The Involvement of Granulosa Cells in the Regulation by Gonadotropins of Cyp17a1 in Theca Cells. In Vivo. 32(6): 1387–1401. 2018. https://doi.org/10.21873/invivo.11391

  31. Ye L., Chen X., Li X., Zhu Q., Yu L., Guo J., Chen B., Akingbemi B.T., Ge R.S., Li H. Effects of methoxychlor and its metabolite 2,2-bis(p-hydroxyphenyl)-1,1,1-trichloroethane on human and rat 17α-hydroxylase/17,20-lyase activity. Toxicol. Lett. 225(3): 407–412. 2014. https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2014.01.011

  32. Marín-Juez R., Castellana B., Manchado M., Planas J.V. Molecular identification of genes involved in testicular steroid synthesis and characterization of the response to gonadotropic stimulation in the Senegalese sole (Solea senegalensis) testis. Gen. Comp. Endocrinol. 172(1): 130–139. 2011. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2011.02.003

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал